LC-MS法结合化学计量学法探讨发酵时间对六神曲中化学成分的影响.pdf

法结合化学计量学法探讨发酵时间对六神曲中化学成分的影响时海燕，徐 男，赵 霞，王 鹏，郑 伟，刘月程，崔彦伟 山东第一医科大学第一附属医院（山东省千佛山医院）临床药学，山东省儿童药物临床评价与研发工程技术研究中心，山东省医药卫生临床药学重点实验室，山东 济南；山东省中医药研究院中药制剂研究所，山东 济南；山东百味堂中药饮片有限公司研发部，山东 济南；山东中医药大学药学院，山东 济南 收稿日期：基金项目：山东省自然科学基金重点项目（）；山东省中医药科技项目重点项目（）；山东省科技型中小企业创新能力提升工程项目（）；济南市科技型中小企业创新能力提升工程项目（）作者简介：时海燕（），女，博士，主任药师，从事中药炮制化学与药动学研究。：通信作者：徐 男（），男，博士，研究员，从事中药新药开发与炮制原理研究。：摘要：目的 采用 法结合化学计量学分析法探究不同发酵时间六神曲中葫芦巴碱、没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、隐绿原酸、苦杏仁苷、香草酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、紫云英苷、槲皮素、槲皮苷、异绿原酸、木犀草素、芹菜素的含量，并筛选差异性标志物。方法 该药物的分析采用 色谱柱（，）；流动相乙腈 甲酸，梯度洗脱；体积流量 ；柱温 。采用主成分分析（）对六神曲进行分类和评价，再借助正交偏最小二乘判别分析（）法筛选出差异性标志物，并通过聚类热图进行区分。结果 发酵过程中，葫芦巴碱、原儿茶醛、苦杏仁苷、芦丁、金丝桃苷、东莨菪内酯、紫云英苷质量分数呈下降趋势，没食子酸、原儿茶酸、香草酸、木犀草素、芹菜素质量分数呈上升趋势，隐绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、槲皮苷、异绿原酸 质量分数存在波动；结果显示，不同发酵时间六神曲可聚类为 个发酵阶段；结果表明，原儿茶酸、苦杏仁苷、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、异绿原酸 为差异性标志物；以 种已知化学成分、个差异性标志物含量为指标，分别进行聚类热图分析，聚类结果一致。结论 该方法稳定可靠，可用于区分不同发酵时间六神曲。关键词：六神曲；发酵时间；化学计量学；质量标志物；层次聚类分析；正交偏最小二乘判别分析中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（），；，；，；，：，（）（，），年 月第 卷 第 期中 成 药 （）；（），：；六神曲始载于唐 药性论，由面粉（麦麸）、杏仁、赤小豆、青蒿、苍耳、辣蓼汁或煎煮液混合均匀后发酵、切丁、干燥而成。年版 中国药典 尚未收录六神曲，但全国各省 中药饮片炮制规范 大都有收录，质量标准以外观性状为主，通过观察颜色、菌斑菌衣和折断面质地、纹孔和气味来辨别优劣，缺乏量化评价指标，导致产品质量差异较大，严重影响临床疗效。目前，有关六神曲发酵机制、药效物质及质量评价等方面的研究不够深入。六神曲作为一味发酵类中药，不同发酵时间的六神曲物质基础不同，相应的药效品质也存在差异，因此，有效区分不同发酵时间六神曲是质量评价及控制的关键因素。对于发酵过程不易控制的传统发酵类中药，有必要结合现代技术，建立全面、有效的区分及评价方法，明确不同发酵时间成品间的差异，为发酵类中药的质量控制及临床疗效提供保证。基于此，本实验拟通过 法建立不同发酵时间六神曲多种化学成分含量方法，结合化学计量学对不同发酵时间六神曲进行区分并筛选不同发酵阶段六神曲的差异性标志物，以便相对全面、客观地对六神曲发酵过程中化学成分的变化情况进行初步探究，为后续六神曲发酵机制、质量控制及临床应用等研究提供参考。材料 仪器 三重四极杆串联质谱仪、移液器（美国 公司）；低速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；型分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。试 剂 与 药 物 葫 芦 巴 碱（批 号）、没食子酸（批号）、原儿茶酸（批号）、原儿茶醛（批号）、隐绿原酸（批号）、苦杏仁苷（批号）、金丝桃苷（批号）、东莨菪内酯（批号）、阿魏酸（批号）、紫云英苷（批号）、槲皮苷（批号）、异绿原酸（批号）、木犀草素（批号）、芹菜素（批号），纯度，购自成都普思生物科技股份有限公司；槲皮素（批 号 ）、芦 丁（批 号），纯度，购自中国食品药品检定研究院；香草酸（批号）、咖啡酸（批号），纯度，购自四川省维克奇生物科技有限公司。青蒿、辣蓼、苍耳草、苦杏仁、赤小豆均购自河北省安国市，经山东省中医药研究院靳光乾教授鉴定为正品；全麦粉（五得利面粉集团有限公司，批号）；六神曲（山东百味堂中药饮片有限公司，批号）。甲醇、乙 腈、甲 酸 为 色 谱 纯，购 自 美 国 公司；水为超纯水，购自广州屈臣氏食品饮料有限公司。方法与结果 六神曲粉末制备 取赤小豆、苦杏仁各 ，磨成粗粉，加入全麦粉 。另取鲜青蒿、鲜辣 年 月第 卷 第 期中 成 药 蓼草、鲜苍耳草各 ，切碎，加水适量煮成药液，去渣。再将面粉置锅内，加入药液，接揉混合，制成软材（以捉之成闭，弹之松散为宜）。装入模内，压实成块，取出，置于 、相对湿度 的恒温恒湿发酵箱内发酵，从发酵 起，每 取样 次，除取样外，发酵箱门保持密闭，烘干即得。含量测定 供试品溶液制备精密称取六神曲粉末 ，置 于 锥 形 瓶 中，加 入 甲 醇，称定质量，超声处理 ，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀过滤，滤液于 水浴挥干，残渣加入甲醇溶解定容至 量瓶中，混匀，微孔滤膜过滤，即得。对照品溶液制备精密称取葫芦巴碱、没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、隐绿原酸、苦杏仁苷、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、紫云英苷、槲皮素、槲皮苷、异绿原酸、木犀草素、芹菜素、芦丁、香草酸、咖啡酸对照品适量，置于 量瓶中，甲醇溶解定容，即得。色 谱 条 件 色 谱 柱（，）；流动相 甲酸水（）乙腈（），梯度洗脱（，；，；，；，；，；，；，；，；，；，）；体积流量 ；柱温 ；进样量 。质谱条件电喷雾离子源，负离子检测模式；喷雾电压正离子 、负离子 ；鞘气体积流量 ；辅助气体积流量 ；辅助气温度 ；离子传输管温度 。优化质谱参数见表。表 优化质谱参数 化合物分子式保留时间 离子对 碰撞能量 碰撞能量 模式葫芦巴碱 没食子酸 原儿茶酸 原儿茶醛 隐绿原酸 苦杏仁苷 香草酸 咖啡酸 芦丁 金丝桃苷 东莨菪内酯 阿魏酸 紫云英苷 槲皮素 槲皮苷 异绿原酸 木犀草素 芹菜素 方法学考察 线性关系考察精密称取“”项下对照品溶液适量，甲醇稀释成不同质量浓度，在“”“”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（）进行回归，并计算检测限（）、定量限（），结果见表，可知各成分在各自范围内线性关系良好。精密度试验精密吸取“”项下供试品溶液，同一天内在“”“”项条件下进样测定 次，或连续测定 ，每天 次，测得葫芦巴碱、没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、隐绿原酸、苦杏仁苷、香草酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、紫云英苷、槲皮素、槲皮苷、异绿原酸、木犀草素、芹菜素日内精 密 度 分 别 为 、年 月第 卷 第 期中 成 药 表 各成分线性关系 成分回归方程线性范围（）定量限（）检测限（）葫芦巴碱 没食子酸 原儿茶酸 原儿茶醛 隐绿原酸 苦杏仁苷 香草酸 咖啡酸 芦丁 金丝桃苷 东莨菪内酯 阿魏酸 紫云英苷 槲皮素 槲皮苷 异绿原酸 木犀草素 芹菜素 、，日间精密度 分别为 、，表明仪器精密度良好。稳定性试验精密吸取“”项下供试品溶液，室温下于、在“”“”项条件下进样测定，测得葫芦巴碱、没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、隐绿原酸、苦杏仁苷、香草酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、紫云英苷、槲皮素、槲皮苷、异绿原酸、木犀草素、芹菜素峰面积 分别为 、，表明溶液在 内稳定性良好。重复性试验精密称取六神曲粉末，按“”项下方法制备供试品溶液，平行 份，在“”“”项条件下进样测定，测得葫芦巴碱、没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、隐绿原酸、苦杏仁苷、香草酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、紫云英苷、槲皮素、槲皮苷、异绿原酸、木犀草素、芹菜素含量 分别为 、，表明该方法重复性良好。加样回收率试验取各成分含量已知的六神曲粉末 份，每份 ，精密称定，分别加入对照品溶液（含葫芦巴碱 、没食子酸 、原儿茶酸 、原儿茶醛 、隐绿原酸 、苦杏仁苷 、香 草 酸 、咖 啡 酸 、芦丁 、金丝桃苷 、东莨菪内酯 、阿魏酸 、紫 云 英 苷 、槲 皮 素 、槲皮 苷 、异 绿 原 酸 、木 犀 草 素 、芹 菜 素 ），按“”项下方法制备供试品溶液，在“”“”项条件下进样测定，计算回收率。结果，葫芦巴碱、没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、隐绿原酸、苦杏仁苷、香草酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、紫云英苷、槲皮素、槲皮苷、异绿原酸、木犀草素、芹 菜 素 平 均 加 样 回 收 率 分 别 为 、，分 别 为 、。样品含量测定精密称取不同发酵时间六神曲 ，按“”项方法制备供试品溶液，在“”“”项条件下进样测定，计算含量，结果见表。质谱图见图。年 月第 卷 第 期中 成 药 葫芦巴碱 没食子酸 原儿茶酸 原儿茶醛 隐绿原酸 苦杏仁苷 香草酸 咖啡酸 芦丁 金丝桃苷 东莨菪内酯 阿魏酸 紫云英苷 槲皮素 槲皮苷 异绿原酸 木犀草素 芹菜素 图 各成分 图 化学计量学分析 主成分分析（）采用 软件，对各成分含量数据进行主成分分析。结果显示，前 个主成分具有很好的代表性，累计方差贡献率为 ，主成分 累计方差贡献率达到 ，是信息量较全面的指标（表）。由图 可知，影响六神曲发酵前后差异的是多成分（群）的协同作用的结果，并不是单一成分。年 月第 卷 第 期中 成 药 表 各成分含量测定结果（，）（，）成分发酵时间 葫芦巴碱 没食子酸 原儿茶酸 原儿茶醛 隐绿原酸 苦杏仁苷 香草酸 咖啡酸 芦丁 金丝桃苷 东莨菪内酯 阿魏酸 紫云英苷 槲皮素 槲皮苷 异绿原酸 木犀草素 芹菜素 表 特征值和方差贡献率 编号初始特征值提取平方和载入合计方差的贡献率 累计贡献率 合计方差的贡献率 累计贡献率 图 各成分在 个主成分的平面分布图 正交偏最小二乘判别分析（）采用 软件建立 模型，以筛选不同发酵时间六神曲间的差异性成分；将相邻 个发酵阶段建曲共有峰面积数据分别导入 软件，建立模型、，以筛选六神曲发酵时间控制的关键指标；由表 可知，个 模型的、都接近于，并进行 次置换检验评价各模型，均没有过拟合的现象，说明模型都稳定、有效、可行，具有良好的解释及预测能力。在模型得分图中，不同发酵阶段六神曲分别位于 轴、轴两侧，说明不同发酵阶段六神曲差异明显，可被区分。由模型 图（图）可知，第 阶段六神曲主要差异性成分（值）为原儿茶酸、苦杏仁苷、金丝桃苷、东莨菪内酯、阿魏酸、异绿原酸。其中，第 阶段与第 阶段六神曲主要差异性成分为苦杏仁苷、金丝桃苷、原 年 月第 卷 第 期中 成 药 儿茶酸、木犀草素、葫芦巴碱、紫云英苷、没食子酸、香草酸、异绿原酸、咖啡酸；第 阶段与第 阶段建曲主要差异成分为没食子酸、原儿茶酸、木犀草素、苦杏仁苷、槲皮素、东莨菪内酯、金丝桃苷、香草酸、葫芦巴碱；第 阶段与第 阶段建曲主要差异性成分为苦杏仁苷、金丝桃苷、隐绿原酸、异绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、原儿茶酸、东莨菪内酯、芦丁。表 模型信息 模型编号发酵阶段第 阶段 第 阶段 第 阶段 第 阶段 图 得分图（）及 值（）（）（）聚类热图分析 采用 平台对 种已知成分、个差异性标志物和发酵时间 个维度分别进行聚类热图分析，结果见图。树形热图中横坐标代表成分名，纵坐标代表发酵时间，其中红色表达挥发性成分含量升高，响应绿色代表含量降低。由此可知，不同发酵时间六神曲可以被分为 类。同时，聚类结果一致，证明了 提取的 种差异性成分能够基本体现所有成分信 年 月第 卷 第 期中 成 药 息，可以将不同发酵时间六神曲区分开。图 各成分含量聚类分析热图 图 差异性成分聚类分析热图 讨论本实验首次采用 法建立了六神曲 种成分的含量测定方法。实验过程中，为了确保建立的含量测定可对不同发酵时间六神曲中的成分进行较全面地分析，参照六神曲各原料药所含主要成分选用对照品，对 色谱峰进行指认，并分别对提取溶剂、提取方式、流动相、梯度洗脱条件进行优化。结果显示，可作为区分不同发酵时间六神曲的关键指标，为六神曲发酵工艺优化及质量标准建立提供参考。本实验借助 法对不同发酵时间六神曲的化学成分按 值大小排序，筛选出 种差异性成分（值），分别为原儿茶酸、东莨菪内酯、阿魏酸、异绿原酸、苦杏仁苷、金丝桃苷。进一步通过聚类热图分析，证实了上述 种成分是差异性标志物的合理性。原儿茶酸、阿魏酸主要来源于苍耳草，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、调节血糖等活性；异绿原酸、东莨菪内酯主要来源于青蒿，具有抗疟疾、抗肿瘤、抑菌杀虫、解热抗炎、免疫调节作用；金丝桃苷主要来源于辣蓼，具有抗菌、保护消化道、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用；苦杏仁苷主要来源于苦杏仁，具有镇痛消炎、免疫调节等作用。这些成分的变化可能是产生健脾和胃、消食化积功效的主要原因。青蒿、辣蓼、苍耳草和苦杏仁等原料药是六神曲质量控制的关键。研究表明，微生物发酵多数化学成分会出现含量变化的现象。结合各阶段差异性成分的变化趋势，可初步定义 个不同发酵时间，发酵、为六神曲发酵的初期阶段；发酵、为未成熟阶段；发酵、为适度阶段，发酵、为过度阶段。在六神曲发酵过程中，酚酸类成分含量均呈逐渐升高趋势，可能与发酵初期、未成熟阶段植物本身的纤维素酶等降解植物细胞壁，促进活性成分的溶出有关。槲皮素含量升高，可能是部分微生物产生降解苷类成分槲皮苷、金丝桃苷的酶，使两者成分分解生成代谢产物槲皮素以供微生物自身生长需求。发酵过度阶段，多数成分含量又呈下降趋势，可能与发酵后期微生物产生的 葡萄糖苷酶和纤维素酶降解有关。有关六神曲发酵过程中，微生物的种群、生长代谢特性及其对六神曲物质基础的转化机理均不明确，仍有待进一步深入研究。参考文献：马 开，田 萍，张迪文，等 波长切换 法同时测定六神曲中 个成分的含量 药物分析杂志，（）：陈彦琳，王云庭，关凯乐，等 六神曲发酵过程中微生物群落结 构 研 究 中 国 中 药 杂 志，（）：王丽芳，高文远 论六神曲中微生物、消化酶动态检测及整体 性 研 究 时 珍 国 医 国 药，（）：马维维，戚岑聪，张艳聪，等 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