miR-140-3p靶向AGT5调控鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移及自噬研究.pdf

程生物776-BME&ClinMed,November 2023,Vol.27,No.6生物医学工程与临床2 0 2 3年11月第2 7 卷第6 期网络出版时间：2 0 2 3-10-2 5512:23:27D0I:10.13339/ki.sglc.20231024.007网络出版地址：https:/ G T 5蛋白及AGT5mRNA表达水平明显低于HNEpC细胞（0.2 10.0 3vs0.870.11、0.2 10.0 6 v s 0.8 7 0.12、0.32 0.0 5v s0.740.08)(P0.01)。上调miR-140-3p的CNE2细胞增殖、侵袭及迁移能力降低,LC3II/LC3I、Be c l i n 1、A G T 5蛋白表达水平升高，p62蛋白表达水平降低（P0.01)；下调miR-140-3p的CNE2细胞增殖、侵袭及迁移能力升高,LC3I/LC3I、Beclin1、A G T 5蛋白表达水平降低，p62蛋白表达水平升高（P0.01）。上调AGT5可逆转敲低miR-140-3p对CNE2细胞增殖、侵袭、迁移的促进作用及自噬的抑制作用。miR-140-3p与AGT5具有靶向调控关系。结论miR-140-3p对 CNE2细胞增殖、侵袭、迁移具有抑制作用，对自噬具有促进作用，机制可能与正性调控AGT5有关。关键词：鼻咽癌;miR-140-3p;细胞自噬；细胞增殖；细胞侵袭；细胞迁移；自噬相关基因5中图分类号：R739.63；Q 7 5文献标识码：A文章编号：10 0 9-7 0 90(2 0 2 3)0 6-0 7 7 6-0 9miR-140-3p regulates proliferation,invasion,migration and autophagy of nasopharyngeal carcinoma cells by target-ing AGT5WANG Zhong-qiao,GAO Yan,SI Feng-zhi(Department of Otolaryngology,The Second Affiliated Hospitaof Xinjiang Medical University,Urumqi830063,Xinjiang,China)Corresponding author:GA0 Yan.E-mail:.Abstract:Objective To investigate the effects of miR-140-3p on proliferation,invasion,migration and autophagy of na-sopharyngeal carcinoma cells and its targeting relationship with autophagy-associated gene 5(AGT5).Methods The humannasopharyngeal carcinoma cell CNE2 and human nasal epithelial cell HNEpC were selected and divided into miR-140-3pgroup(transfected with miR-140-3p mimic plasmid),si-miR-140-3p group(transfected with miR-140-3p inhibitor plasmid),miR-negative control(NC)group(transfected with miR-140-3p mimic empty vector),NC group(transfected with miR-140-3pinhibitor empty vector),si-miR-140-3p+overexpression(OE)group(transfected with miR-140-3p inhibitor plasmid,OE-AGT5empty vector)and si-miR-140-3p+AGT5 group(transfected with miR-140-3p inhibitor plasmid,OE-AGT5 plasmid)accord-ing to transfection of different plasmids.The cell counting kit-8(CCK-8)assay was performed to detect proliferation ability;Transwell assay detect invasion and migration ability,the fluorescence quantitative polymerase chain reaction(RT-PCR)detectcellular AGT5 mRNA and miR-106b-5p expression level.The protein expression levels of microtubule-associated proteinlight chain 3 I(LC3I),microtubule-associated protein light chain 3 II(LC3II),AGT5,autophagy key molecule yeast Atg6 homo-logue 1(Beclinl)and p62 were detected by Western blot.The binding site of miR-140-3p and AGT5 was predicted by TargetScanonline website,and targeting relationship between miR-140-3p and AGT5 was verified by dual luciferase reporter gene exper-iment.Results The expression levels of miR-140-3p,AGT5 protein and AGT5 mRNA in CNE2 cells were significantly lowerthan those in HNEpC cells(0.21 0.03 vs 0.87 0.11,0.21 0.06 vs 0.87 0.12,0.32 0.05 vs 0.74 0.08)(P 0.01).The作者单位：新疆医科大学第二附属医院耳鼻喉科，新疆乌鲁木齐8 30 0 6 3作者简介：王忠巧（198 7 一），女，新疆伊犁人，硕士，主治医师，主要从事耳鼻咽喉科的常见病、多发病研究。电话：15999192 92 3。E-mail：基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（2 0 2 2 D01C504）通信作者：高妍（198 4一），女，新疆人，硕士，副主任医师，主要从事耳鼻咽喉科的常见病、多发病研究。电话：158 99131159。E-mail：7 7 0 7 18 0 0 2 。版权保护，不得翻录。777生物医学工程与临床2 0 2 3年11月第2 7 卷第6 期BME&Clin Med,November 2023,Vol.27,No.6proliferation,invasion and migration ability of CNE2 cells with up-regulated miR-140-3p were decreased,the expressionlevels of LC3II/LC3 I,Beclinl and AGT5 proteins were increased,and the expression level of p62 protein was decreased(P 0.01).The proliferation,invasion and migration ability of CNE2 cells with down-regulation of miR-140-3p were increased,the expression levels of LC31I/LC3I,Beclinl and AGT5 proteins were decreased,and the expression level of p62 protein was in-creased(P 0.01).The up-regulation of AGT5 was reversed the promotion of proliferation,invasion,migration and autophagyinhibition of CNE2 cells by knockdown of miR-140-3p.There was targeted regulatory relationship between miR-140-3p andAGT5.Conclusion It is demonstrated that miR-140-3p showed inhibitory effects on CNE2 cell proliferation,invasion and mi-gration,and promotional effects on autophagy,the mechanism may be related to positive regulation of AGT5.Key words:nasopharyngeal carcinoma;miR-140-3p;cell autophagy;cell proliferation;cell invasion;cell migration;autophagy-related gene5鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC)是头颈部常见恶性肿瘤之一，进展快，复发率高，很多患者初次就诊时已经出现远处转移。因此，探索NPC进展分子机制、寻找新的治疗靶点迫在眉睫。微小RNA(microRNA,miRNA）是一类2 2 nt的非编码RNA，参与调控癌细胞的恶性生物学进程。研究显示,miR-140-3p在多种肿瘤组织中差异表达，参与调控细胞增殖、侵袭并促进细胞调亡的作用 1 3。ZouX等 4研究发现,miR-140-3p在NPC患者血浆中低表达,对NPC具有一定的诊断价值。然而miR-140-3p对NPC的作用及分子机制尚不明确。自噬是细胞的一种程序性死亡,参与肿瘤的发生发展、药物抵抗等 5。抑制自噬可促进NPC细胞的增殖、转移,如ZhuQ等回研究发现,上调miR-106a-5p可抑制NPC细胞自噬产生，进而促进细胞增殖、侵袭及迁移。但也有文献报道,抑制自噬可增强NPC细胞的放化疗敏感性7。目前多项研究发现,miRNA参与了肿瘤细胞自噬的调控 8.9 。笔者所在课题组前期通过生物信息学网站分析发现，miR-140-3p与自噬相关基因5（autophagy relatedgenes5,AGT5)存在核苷酸结合位点，而AGT5在自噬发生中扮演着重要角色，因此推测miR-140-3p可能通过靶向AGT5调控细胞自噬影响NPC进展。基于此，笔者主要探讨了miR-140-3p对NPC细胞恶性生物学行为、自噬的影响及其与AGT5的靶向调控关系，希望为NPC的防治提供新的靶点1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验细胞人NPC细胞CNE2细胞、人鼻黏膜上皮细胞一HNEpC细胞（北纳生物，中国）。1.1.2主要试剂达氏修正伊氏培养液（DulbeccosmodifiedEa-glesmedium,DMEM）（安徽白鲨生物科技有限公司，中国）；胎牛血清、0.2 5%胰蛋白酶（百克赛斯生物科技有限公司，中国）;lipofectamine8000（上海碧云天生物有限公司，中国）;TRizol(Invitrogen，美国）；引物序列、过表达(overexpression,OE）-A G T 5质粒、OE-AGT5空载体、miR-140-3p模拟物(mimic)质粒、miR-140-3p抑制剂(inhibitor)质粒、miR-140-3pmimic空载体及miR-140-3pinhibitor空载体、野生型（wildtype,WT)-AGT5载体、突变型(mutant,MUT)-AGT5载体(北京博尔迈生物技术有限公司，中国）;CCK-8(cell countingkit-8)检测试剂盒（上海生物，中国）；CCK-8试剂盒（杭州赫贝科技有限公司,中国);双萤光素酶报告基因检测试剂盒（武汉科谨生物科技有限公司，中国）；兔抗人-actin、微管关联蛋白轻链3I(microtubule-associated protein 1 light,LC3 I）、微管关联蛋白轻链3I (microtubule-associated protein 3light,LC3II）、A G T 5、自噬关键分子酵母Atg6同系物1(ATG6 autophagy related 6 homolog,Beclin1)、p 6 2、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂盒（上海碧云天生物有限公司，中国）1.1.3主要仪器酶标仪（美谷分子，中国）;NANOdrop2000仪(Bio-rad公司,美国）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PACE)凝胶电泳器械（上海懋康生物科技有限公司，中国）；天能VE-586曝光机（上海天能科技有限公司，中国）ABI7900PCR仪（ABI公司，美国）；ARM200F原子级分辨率透射电子显微镜（电子株式会社，日本）。1.2方法1.2.1细胞培养、转染及分组CNE2、H NEp C细胞使用含有10%胎牛血清、0.1%青霉素/链霉素的DMEM进行培养。培养条件：37、体积分数5%CO2，每隔2 d更换新鲜培养液。取传代3次对数生长期的CNE2细胞接种到6 孔板，细胞铺满50%板面积时使用lipofectamine8000将不同质粒转染细胞分为如下各组：miR-140-3p组(转染miR-140-778BME&Clin Med,November 2023,Vol.27,No.6生物医学工程与临床2 0 2 3年11月第2 7 卷第6 期3pmimic质粒）,si-miR-140-3p组（转染miR-140-3pinhibitor质粒）,miR-空白对照(negativecontrol,NC)组（转染miR-140-3pmimic空载体）,NC组（转染miR-140-3p inhibitor 空载体),si-miR-140-3p+OE组（转染miR-140-3pinhibitor质粒、OE-AGT5空载体）,si-miR-140-3p+AGT5组（转染miR-140-3pinhibitor质粒、OE-AGT5质粒）。继续培养48 h后进行后续实验1.2.2CCK-8测定细胞活力制备单细胞悬液，按照8 0 0 0/孔（每孔10 0 L)的密度接种在9 6 孔板上，并在体积分数5%CO2、37的培养箱中进行孵育处理，分别在2 4、48、7 2 h更换新鲜培养液,加人10 LCCK-8溶液，培养箱孵育3h。孵育结束后采用酶标仪在450 nm处读取各处理组细胞的光密度(opticaldensity,OD）。每组实验独立重复3次。1.2.3Tanswell实验测定细胞侵袭、迁移能力对于侵袭实验，首先用无血清培养液配置基质胶,向Tanswell小室的上室中加人6 0 L基质胶,放人培养箱中凝固，下室中加人10%胎牛血清，然后制备单细胞悬液；按照110 4个细胞接种到上室,培养48 h后去除培养液，棉签拭去上室未穿的细胞，上室穿过去的细胞用4%多聚甲醛溶液固定10 min，0.1%结晶紫染色，光学显微镜下拍照、计数。对于迁移实验，上室中不加人基质胶，其他步骤参考侵袭实验1.2.4免疫荧光检测自噬制备单细胞悬液，按照110 4/孔（每孔2 0 0 L）的密度接种在6 孔板，并在体积分数5%CO2、37 培养箱中进行孵育处理2 4h，然后每孔加人1LAd-mRFP-GFP-LC3B,继续培养12 h后激光共聚焦采集图像1.2.5实时定量聚合酶链式反应实时定量聚合酶链式反应（quantitativereal-timepolymerase chain reaction,qRT-PCR）检测 miR-140-3p和AGT5mRNA的表达。使用TRizol从各组细胞中提取总RNA，测定浓度、纯度。根据试剂盒说明书逆转录成cDNA，然后PCR。体系：cDNA2L，上下游引物各0.2 L,2TipGreenqPCRSperMix5L，焦碳酸二乙酯（di-ethypyrocarbonate,DEPC)水2.6 L。条件:9 5 2 min,9515s,6 0 15s,共40 个循环，构建溶解曲线。2-A Ct 法表示基因相对含量。内参选择甘油醛3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),U6。引物序列:AGT5,forward5-AGGCCTATGTGTT-CACCTGC-3,reverse 5-CACATCTTGGCGCGAAAG-TC-3;miR-140-3p,forward 5-GACCCAGTTCAAG-TAATTCAG-3,reverse CGAGCCAAGTAATGGAGAA-3;GAPDH,forward 5-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3,reverse 5-TACGACCAAATCCGTTGACTC-3;U6,forward 5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3;reverse 5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-31.2.6Western blot检测AGT5、LC3I、LC3I、Be c l i n 1和p62蛋白表达。将各处理组细胞裂解物通过二喹啉甲酸(bicin-choninic acid,BCA)法进行总蛋白定量，按照1：4的比例向上清液中加入5蛋白上样缓冲液，并于沸水中加热变性10 min。取50 g蛋白进行SDS-PAGE电泳进行蛋白分离，采用湿转法将分离的蛋白转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上,用5%脱脂牛奶于室温下封闭2 h后，分别加人AGT5（1：1 000)、LC3 I (1:1 0 0 0)、LC3 I (1:1 0 0 0)、Be c l i n l(1:1000)及p62(1：10 0 0)一抗，在4条件下摇床孵育过夜。用Tris盐缓冲溶液-吐温（Tris-bufferedsalineTween,TBST)溶液清洗3次，每次5min，以辣根酶标记的二抗(1：10 0 0)室温孵育1h,以TBST溶液清洗3次，每次5min。最后均匀滴加增强型化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)溶液后于凝胶成像仪进行曝光拍照。采用ImageJ软件测定条带灰度值,以目标蛋白与内参-actin的比值作为其相对表达量。以上实验重复3次。1.2.7在线网站预测miR-140-3p与AGT5的靶向关系使用TargetScan 在线网站(http:/www.targetscan.org/)预测则miR-140-3p与AGT5的靶向关系1.2.8双荧光素酶报告在转染前2 4h，将CNE2细胞以每孔110 4/mL细胞接种在2 4孔板中。将miR-NC或miR-140-3pmimics分别与WT-AGT5、M U T-A G T 5载体共转染到CNE2细胞中。使用双荧光素酶报告分析系统在转染后2 4h进行荧光素酶分析。萤火虫萤光素酶活性被标准化为每个反应的海肾萤光素酶活性。1.3统计学方法使用 Graphpad Prism 软件 8.0(Graphpad SoftwareInc.,美国)进行统计分析。其中计量资料以均值标准差表示。两组及多组间比较分别采用Studentt检验、方差分析。P0.05为差异有统计学意义。779BME&ClinMed,November2023,Vol.27,No.6生物医学工程与临床2 0 2 3年11月第2 7 卷第6 期2结果2.1CNE2、H NEp C细胞AGT5蛋白及其mRNA、miR-140-3p表达水平比较CNE2细胞miR-140-3p、A G T 5蛋白及其mRNA表达水平低于HNEpC细胞(P0.01)。见图1、表1。CNE2细胞HNEpC 细胞AGT5-actin图1Westernblot检测AGT5蛋白表达电脉图Fig.1Electrophoretograms of AGT5 protein expression detectedby Western blot2.24组CNE2细胞增殖、侵袭及迁移比较miR-140-3p组CNE2细胞48 h、7 2 h 细胞增殖、表1CNE2、H NEp C细胞AGT5及miR-140-3p表达水平Tab.1Expression levels of AGT5 and miR-140-3p in CNE2 andHNEpC cellsmiR-140-3pAGT5mRNAAGT5蛋白项目水平水平水平CNE2细胞0.21 0.030.32 0.050.21 0.06HNEpC细胞0.87 0.110.74 0.080.87 0.12t10.0307.7118.521P0.0010.0020.001侵袭、迁移数低于miR-NC组（P0.01）。s i-m i R-140-3p组CNE2细胞48 h、7 2 h 细胞增殖、侵袭、迁移数高于NC组(P0.01)。见图2 和表2、3。说明上调miR-140-3p可抑制细胞的增殖、侵袭及迁移能力。2.34组CNE2细胞自噬蛋白表达比较miR-140-3p组CNE2细胞LC3/LC3I、Be-clinl蛋白水平，黄色荧光强度高于miR-NC组,p62AmiR-NC 组miR-140-3p 组BmiR-NC 组miR-140-3p 组NC组si-miR-140-3p 组NC组si-miR-140-3p 组A：侵袭实验B:迁移实验图2miR-140-3p对CNE2细胞增殖、侵袭及迁移的影响Tanswell实验光学显微镜图Fig.2 Tanswell experiment optical microscope images of miR-140-3p effect on proliferation,invasion and migration of CNE2 cells表2 miR-140-3p对4组CNE2细胞不同时间细胞增殖影响的比较Tab.2Comparison effect of miR-140-3p on proliferation of CNE2 cells at different times in 4 groups项目oh24h48 h72 hNC组00.21 0.030.44 0.050.71 0.04si-miR-140-3p 组00.28 0.030.54 0.031.34 0.03miR-NC 组00.23 0.020.47 0.030.74 0.03miR-140-3p 组00.18 0.020.26 0.030.37 0.04F6.83961.850390.400P0.0130.0000.000表3miR-140-3p对4组CNE2细胞侵袭、迁移影响的比较Tab.3Comparison effect of miR-140-3p on invasion and migration in 4 groups of CNE2 cell项目miR-140-3p水平侵袭细胞数迁移细胞数NC组0.25 0.0383 10108 12si-miR-140-3p 组0.11 0.01194 18257 21miR-NC 组0.26 0.0381 11107 11miR-140-3p 组1.04 0.1441 755 8F99.52087.320118.200P0.0000.0000.000780-BME&ClinMed,November2023,Vol.27,No.6生物医学工程与临床2 0 2 3年11月第2 7 卷第6 期蛋白水平低于miR-NC组(P0.01);si-miR-140-3p组细胞LC3I/LC3I、Be c l i n 1蛋白水平，黄色荧光强度低于NC组，p62蛋白水平高于NC组（P0.01)。见图3、4和表4。说明miR-140-3p可促进细胞自噬的发生。ABCDLC3LC3p62Beclinl-actinA:miR-NC组;B:miR-140-3p组;C:NC组;D:si-miR-140-3p组图3Westernblot检测4组CNE2细胞自噬蛋白表达的电泳图Fig.3 Electrophoretograms of autophagy-related protein expres-sion in 4 groups of CNE2 cell detected by Western blot2.4上调AGT5逆转miR-140-3p敲低对CNE2细胞的影响2.4.13组敲低miR-140-3p后细胞增殖、侵袭及迁移比较si-miR-140-3p+OE组细胞48 h、7 2 h 细胞增殖、侵袭、迁移细胞数高于NC组(P0.01);si-miR-140-3p+AGT5组细胞48 h、7 2 h 细胞增殖、侵袭、迁移细胞数低于si-miR-140-3p+OE组(P0.01)。见图5和表5、6。2.4.23组miR-140-3p过表达后细胞自噬比较si-miR-140-3p+OE组细胞LC3II/LC3I、Be c l i n l蛋白水平、黄色荧光强度低于NC组，p62蛋白水平高于miR-NC组(P0.01);si-miR-140-3p+AGT5组细胞LC3II/LC3I、Be c l i n 1蛋白水平、黄色荧光强度高于si-miR-140-3p+OE组，p62蛋白水平低于miR-NC组(P0.01)。见图6、7 和表7。GFPmRFPmergeABCD50mA:miR-NC 组;B:miR-140-3p组;C:si-miR-140-3p组;D:NC组图44组自噬相关蛋白表达免疫荧光检测结果比较Fig.4Comparison results of immunofluorescence detection of autophagy-related protein expression in 4 groups781BME&ClinMed,November2023,Vol.27,No.6生物医学工程与临床2 0 2 3年11月第2 7 卷第6 期表44组细胞自噬相关蛋白表达水平比较Tab.4 Comparison expression levels of autophagy-related protein in 4 groups项目LC3II/LC3 Ip62蛋白Beclinl蛋白NC组1.53 0.160.58 0.080.64 0.07si-miR-140-3p 组2.11 0.160.17 0.021.02 0.11miR-NC 组1.51 0.120.56 0.050.64 0.08miR-140-3p 组1.01 0.110.92 0.070.33 0.05F27.30079.35036.950P0.0000.0000.000ABCA:NC 组;B:si-miR-140-3p+AGT5组;C:si-miR-140-3p+OE 组图5下调AGT5逆转miR-140-3p过表达对3组CNE2细胞侵袭及迁移Tanswell实验光学显微镜图Fig.5 Tanswell experiment optical microscope images of down-regulation of AGT5 reversed effect of miR-140-3p overexpression oninvasion and migration in 3 groups of CNE2 cell表5下调AGT5逆转miR-140-3p过表达对3组CNE2细胞不同时间细胞增殖的比较Tab.5Comparison down-regulation ofAGT5 reverses miR-140-3p overexpression on proliferation of CNE2 cells at different times in 3 groups项目Oh24 h48h72 hNC组0.21 0.030.44 0.050.71 0.04si-miR-140-3p+AGT5 组0.24 0.070.48 0.110.83 0.11si-miR-140-3p+OE 组0.28 0.030.64 0.031.34 0.03F1.6576.50332.070P0.2670.0320.001表6 下调AGT5逆转miR-140-3p过表达对3组CNE2细胞侵袭及迁移影响的比较Tab.6 Comparison of down-regulation of A GT5 reversed effect ofmiR-140-3p overexpression on invasion and migration in 3 groupsof CNE2cell项目侵袭细胞数迁移细胞数NC组78 15107 21si-miR-140-3p+AGT5 组81 15111 18si-miR-140-3p+OE 组207 25265 23F45.39054.880P0.0000.0002.5miR-140-3p与AGT5的靶向关系miR-140-3p组细胞AGT5蛋白水平高于miR-NC 组(0.9 5 0.11 vs 0.45 0.07)(P0.01),si-miR-140-3p组细胞AGT5蛋白水平低于NC组(0.12 0.0 2ABCLC31LC3p62Beclinl-actinA:NC 组;B:si-miR-140-3p+OE 组;C:si-miR-140-3p+AGT5组图6 Westernblot检测miR-140-3p对3组CNE2细胞自噬相关蛋白表达电泳图Fig.6 Electrophoretograms of autophagy-related protein expres-sion of miR-140-3p in 3 groups of CNE2 cell detected by Westernblot82BME&ClinMed,November2023,Vol.27,No.6生物医学工程与临床2 0 2 3年11月第2 7 卷第6 期GFPmRFPmergeABC50umA:NC 组;B:si-miR-140-3p+OE组;C:si-miR-140-3p+AGT5组图7 miR-140-3p对3组CNE2细胞自噬表达影响的免疫荧光图Fig.7 Immunofluorescence images of miR-140-3p on autophagy expression in 3 groups of CNE2 cells表7 3组细胞自噬相关蛋白表达水平比较Tab.77 Comparison expression levels of autophagy-related proteins in 3 groups项目LC3 II/LC3 Ip62蛋白Beclinl蛋白NC组1.12 0.160.57 0.080.32 0.07si-miR-140-3p+AGT5 组2.11 0.160.17 0.021.02 0.11si-miR-140-3p+OE组0.98 0.090.33 0.040.39 0.06F57.59043.43064.940P0.0000.0000.000vs 0.460.06)(P0.01)。T a r g e t Sc a n 在线网站预测发现,miR-140-3p与AGT5mRNA存在结合位点。miR-140-3p+WT-AGT5组细胞荧光素酶活性高于miR-NC+WT-AGT5组(1.7 50.0 6 vs 1.000.01)(t=20.540,P0.05)。见图8。ABCDAGT5AGT55-GTTTGTAATGAGAGCACTTTC-3-actinmiR-140-3p3-UAGACGUGACAGUCGUGAAAU-5A:NC组;B:si-miR-140-3p组;C:miR-NC组;D:si-miR-140-3p组图8 4组细胞AGT5蛋白表达电泳图和miR-140-3p与AGT5的核苷酸结合位点Fig.8Electrophoretograms of AGT5 protein expression and nucleotide binding sites of miR-140-3p and AGT5 in 4 groups3讨论NPC是耳鼻喉最常见的恶性肿瘤之一，其在中国的发病率、死亡率逐渐升高，尽管多种治疗方法在一定程度上改善了患者预后，但总体预后不佳。NPC的进展涉及多种基因调控,异质性高。因此探索NPC783BME&Clin Med,November 2023,Vol.27,No.6生物医学工程与临床2 0 2 3年11月第2 7 卷第6 期发生和发展的分子机制，对于肿瘤的防治、改善患者预后至关重要。miRNA在肿瘤进展中发挥重要功能，随着对miR-140-3p研究的深人,miR-140-3p在肿瘤中的作用越来越清楚，如WangY等10 研究发现，miR-140-3p过表达可抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭。此外，miR-140-3p在胃癌组织中低表达,上调miR-140-3p可抑制胃癌细胞增殖、侵袭及迁移能力。然而miR-140-3p与NPC生物学行为的关系尚不清楚。有文献报道,NPC患者血浆miR-140-3p低表达，诊断NPC的效能良好 12 。笔者研究结果显示,NPC细胞miR-140-3p表达水平低于正常鼻腔黏膜细胞，提示miR-140-3p可能参与了NPC发生。为明确miR-140-3p对NPC细胞的影响，笔者所在课题组构建了miR-140-3p过表达、敲低NPC细胞株，结果显示，上调miR-140-3p可抑制NPC细胞的增殖、侵袭及迁移能力，反之下调miR-140-3p可促进鼻咽癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力,这与其他肿瘤相关研究结果基本一致。自噬是一种保守的分解代谢过程，参与细胞许多生理过程。自噬发生过程中，细胞质成分被溶酶体蛋白酶溶解。此外，自噬有助于去除受损的细胞器和细胞质聚集体，从而缓解细胞应激并维持体内平衡。最近研究发现，自噬在NPC发生发展过程中扮演着重要角色，如郑方静等 13 研究发现，上调miR-216a可诱导NPC细胞自噬的产生,进而抑制细胞增殖、侵袭及血管合成。也有文献报道，miR-197-3p可抑制NPC细胞自噬,进而抑制肿瘤细胞恶性表型,增强放射治疗敏感性 14。有研究发现,抑制自噬可增强NPC的化学治疗敏感性 15。这些研究说明,自噬在NPC发生发展及治疗中扮演着重要角色。鉴于自噬在NPC中的作用，笔者观察了miR-140-3p与NPC自噬的关系。LC3是自噬小体上的膜蛋白，在自噬泡形成过程中发挥重要作用，自噬形成后,LC3I经泛素化修饰形成LC3I，被认为是自噬的标记物6 。p62在自噬小体与溶酶体融合后被降解，因此自噬发生时p62蛋白水平减少 17 。Beclin1可诱导自噬泡的形成,可促进自噬的形成。笔者研究结果显示，上调miR-140-3p可促进LC3、Be c l i n 1表达，抑制p62表达