miR-135a调节Treg_Th17免疫平衡参与变应性鼻炎模型小鼠发病及机制探讨.pdf

中国免疫学杂志2023 年第 39 卷miR-135a调节Treg/Th17免疫平衡参与变应性鼻炎模型小鼠发病及机制探讨严宏 严华（武汉市第三医院光谷院区检验科，武汉 430073）中图分类号 R392 文献标志码 A 文章编号 1000-484X（2023）08-1628-05摘要 目的：探究微小 RNA（miR）-135a调节 Treg/Th17免疫平衡参与变应性鼻炎（AR）的作用机制。方法：利用 0.5 mg/ml卵清蛋白和20 mg/ml氢氧化铝生理盐水溶液构建AR模型。32只AR小鼠分为AR组和AR+miR-135a mimic组（n=16），16只健康小鼠作为对照组。通过腹腔注射miR-135a mimic以提高miR-135a的水平。比较各组血清IgE和IgG、鼻黏膜损伤情况、外周血Th17/Treg、miR-135a和GATA3蛋白表达量。通过双荧光素酶报告实验验证miR-135a和GATA3的靶向关系。结果：与对照组比较，AR组IgE水平、鼻黏膜损伤程度、Th17比例和GATA3蛋白水平显著升高，而miR-135a、Treg比例、Treg/Th17显著降低（P0.05）。AR+miR-135a mimic组IgE水平、鼻黏膜损伤程度、Th17比例和GATA3蛋白水平显著低于AR组，而miR-135a、Treg比例、Treg/Th17显著高于AR组（P0.05）。miR-135a能够与GATA3靶向结合（P0.05）。结论：miR-135a可能通过使AR模型小鼠Th17/Treg平衡从而缓解AR病情。关键词 变应性鼻炎；微小RNA-135a；Th17细胞；Treg细胞miR-135a regulates immune balance of Treg/Th17 and participates in pathogenesis of AR animal models and its mechanismYAN Hong，YAN Hua.Department of Laboratory，Kwong Valley Hospital，Wuhan Third Hospital，Wuhan 430073，ChinaAbstract Objective：To explore the mechanism of microRNA（miR）-135a regulating the immune balance of Treg/Th17 to participate in allergic rhinitis（AR）.Methods：The AR model was constructed with 0.5 mg/ml ovalbumin and 20 mg/ml aluminum hydroxide physiological saline solution.A total of 32 AR mice were divided into AR group and AR+miR-135a mimic group（n=16），and 16 healthy mice were served as control group.miR-135a mimic was intraperitoneal injection to increase the level of miR-135a.The serum IgE and IgG，nasal mucosal damage，peripheral blood Th17/Treg，miR-135a and GATA3 protein expression levels were compared in each group.The target relationship between miR-135a and GATA3 were verified by dual luciferase report experiment.Results：Compared with the control group，the IgE level，nasal mucosal damage，Th17 ratio and GATA3 protein levels in the AR group were significantly increased，while miR-135a，Treg ratio，and Treg/Th17 were significantly decreased（P0.05）.AR+miR-135a mimic groups IgE level，nasal mucosal damage，Th17 and GATA3 protein level were significantly lower than those in the AR group，while miR-135a，Treg ratio and Treg/Th17 were significantly higher than those in the AR group（P0.05）.miR-135a could target binding to GATA3（P350 ng/ml为建模成功。本次建模成功率为80%（32/40）。32只AR小鼠随机分为AR组和AR+miR-135a mimic组（n=16，每组雌、雄各8只）。AR+miR-135a mimic 组 小 鼠 腹 腔 注 射 miR-135a mimic 以提高 miR-135a 水平，剂量为 300 g/kg，每周2次，连续2周。AR组注射等量的NC质粒。另取16只（雌、雄各8只）健康小鼠作为对照组，仅使用等量的溶剂进行干预。1.2.2RT-qPCR 检测 miR-135a使用 miRNeasy Mini 试剂盒提取鼻黏膜组织中总 miRNA，并通过TaqMan miRNA 反转录试剂盒合成 cDNA，条件如下：37 /15 min，98/5 min。然后使用 TaqMan miRNA 进行 qPCR 实验，条件如下：95/2 min，94/20 s，58/20 s，72/20 s，40个循环，最后在72 下延伸4 min。通过比较循环阈值并以U6作为内参，计算miR-135a的相对表达水平。1.2.3检测血清 IgE 和 IgG 浓度收集小鼠眼眶血，将样品在室温下放置 30 min，以 3 000 g 离心 10 min，分离血清。根据说明书加入抗体和显色剂，在450 nm下检测吸光度并根据标准曲线计算AR特异性IgE和IgG浓度。1.2.4HE 染色小鼠处死后将头部用 10%甲醛溶液固定48 h，流水冲洗。不同浓度的乙醇脱水，然后将组织浸入蜡中，并切成4 m厚度。脱蜡、水化后将切片分别用 HE染色。细胞核用苏木精室温下染色10 min，细胞质用0.5%伊红染色2 min。显微镜下观察鼻黏膜组织的损伤情况。1.2.5流式细胞术检测Th17和Treg细胞比例小鼠处死前抽取尾静脉血液，通过标准梯度离心分离外周血单个核细胞。将所得的单个核细胞用磷酸盐缓冲液以500 g/g洗涤2次，每次持续5 min。通过免疫磁珠从外周血单个核细胞中分离出T细胞。为了分析Treg细胞，在通透所用的缓冲液培养后，分别加入小鼠抗 CD25（5 g/ml）和抗小鼠 GATA3（5 g/ml）在黑暗中孵育20 min进行表面标记染色。为了分析Th17细胞，在24孔板中用含有蛋白质转运抑制剂的细胞刺激混合物孵育4 h。然后将细胞置于 5 l 无菌试管中，洗涤后加入小鼠抗 CD4 （5 g/ml）和抗小鼠 IL-17（5 g/ml）在黑暗中孵育 20 min进行表面标记染色。使用BD Aria 活细胞分选仪对细胞进行分析。1.2.6Western blot 检测 GATA3 蛋白鼻黏膜组织离心（4，12 000 r/min，5 min）收集总蛋白。通过8%SDS-PAGE分离每个样品中等量（50 g）蛋白，并将其转移至硝酸纤维素膜。通过在室温下将膜浸入5%脱脂牛奶中2 h封闭非特异性抗原。随后，将膜与抗体在4 下孵育过夜，然后将膜与相应的辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1 h。使用 Quantum One 软件分析灰度计算 GATA3 蛋白相对于GAPDH的表达量。1629中国免疫学杂志2023 年第 39 卷1.2.7双荧光素酶报告检测 miR-135a 与 GATA3的靶向关系miR-135a与GATA3的碱基结合位点通过 Starbase 得到（http：/ GATA3 序列扩增到pGL4荧光素酶载体的下游位点，使用快速定点诱变试剂盒生成突变型（mut-）GATA3。将293T细胞以3104个/孔 接 种 于 24 孔 板，24 h 后 使 用 Lipofectamine2000 将 1 g wt-/mut-GATA3 荧光素酶质粒转染至细胞，分别转染50 nmol/L miR-135a mimic或者miR-135a NC质粒。将细胞在37 下孵育36 h。根据制造商的方案，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。所有数据均以 Renilla荧光素酶活性进行标准化。1.3统计学处理设立3个平行实验，实验数据使用SPSS19.0统计，数据以x s表示，单因素方差分析（ANOVA）以评估组间差异，两两比较使用SNK-q检验，P0.05表示差异具有统计学意义。2 结果 2.1各组AR小鼠鼻黏膜中miR-135a表达水平各组AR小鼠鼻黏膜中miR-135a表达水平比较差异显著（P0.05）。AR 组 miR-135a 水平（0.430.07）显著低于对照组（1.000.18）（P0.05），AR+miR-135a mimic组miR-135a水平（2.670.41）显著高于对照组和AR组（P0.05）。2.2miR-135a对AR模型小鼠IgE和IgG水平的影响各组小鼠血清中 IgE 水平比较差异显著（P0.05）。AR 组 IgE（403.8526.36 ng/ml）显著高于对 照 组（P0.05），AR+miR-135a mimic 组 IgE（284.2120.83 ng/ml）水 平 显 著 低 于 AR 组（P0.05），见表1。2.3miR-135a 对 AR 模型小鼠鼻黏膜损伤的影响HE染色分析miR-135a对AR模型小鼠一般形态的影响。如图1，AR组鼻黏膜中观察到组织学改变，黏膜中浸润的炎症细胞大量增加，黏膜厚度显著增加。AR+miR-135a mimic组炎症细胞浸润情况较AR组明显缓解，鼻黏膜厚度也显著低于AR组。2.4miR-135a 对 AR 模型小鼠 Th17/Treg 的影响各组 Th17 细胞和 Treg 细胞水平比较差异显著 （P0.05，图 2）。AR组 Th17比例（3.950.37）%显著高于对照组，而 Treg 比例（1.560.12）%和 Treg/Th17（0.390.03）显著低于对照组（P0.05）。AR+miR-135a mimic组 Th17比例（2.300.19）%显著低于 AR 组，Treg 比例（2.380.21）%以及 Treg/Th17（1.030.08）显著高于AR组（P0.05），见表2。2.5miR-135a对AR模型小鼠GATA3蛋白表达的影响各组AR小鼠鼻黏膜中GATA3蛋白表达水平比较差异显著（P0.05）。AR 组 GATA3 蛋白水平（3.450.29）显 著 高 于 对 照 组（1.000.06）（P0.05），AR+miR-135a mimic 组 GATA3 蛋 白 水 平（1.820.14）显著低于对照组和AR组（P0.05），见图3。2.6双荧光素酶报告验证 miR-135a 与 GATA3 的表1miR-135a 对 AR 模型小鼠 IgE 和 IgG 水平的影响 （x s，n=16）Tab.1Effect of miR-135a on levels of IgE and IgG in AR model mice（x s，n=16）GroupsControlARAR+miR-135a mimicIgE/（ng ml1）178.5212.98403.8526.361）284.2120.831）2）IgG/（g ml1）128.766.19127.445.85129.286.04Note：Compared with control group，1）P0.05；compared with AR group，2）P0.05.图1HE染色分析miR-135a对AR模型小鼠鼻黏膜损伤的影响Fig.1HE staining analysis of effect of miR-135a on nasal mucosal damage in AR model miceNote：A.FOX03+CD25+cell is Treg cell；B.IL-17+CD4+cell is Th17.图2流式细胞术检测miR-135a对AR模型小鼠Th17以及Treg的影响Fig.2Flow cytometry to detect effect of miR-135a on Th17 and Treg of AR model mice1630严宏等 miR-135a调节Treg/Th17免疫平衡参与变应性鼻炎模型小鼠发病及机制探讨 第 8 期靶向关系miR-135a与GATA3的靶向结合位点，如图4。当共同转染wt-GATA3和miR-135a mimic后，细胞中相对荧光素酶活性显著降低（P0.05），证明miR-135a与GATA3靶向结合，见表3。3 讨论 AR是一种由IgE介导的过敏性疾病，其临床特征是鼻黏膜充血、鼻痒和打喷嚏。现阶段，吸入皮质类固醇、抗组胺药和白三烯受体拮抗剂是治疗AR的主要方法，然而这些药物只能暂时缓解症状，停药后症状很快就会复发8。分析AR的发病机制寻找新的治疗AR的方法具有重要意义。miRNA是近年来的研究热点，参与肿瘤的发生和进展。miRNA可通过碱基互补配对的方式识别并结合mRNA的3端UTR区域，诱导mRNA降解抑制翻译过程，从而在转录后的水平上调控基因表达9。miR-135a是近年来新发现的与免疫和炎症反应有关的 miRNA，miR-135a 可通过靶向抑制 JAK/STAT信号通路抑制哮喘小鼠气道炎症反应10。也有研究发现miR-135a通过靶向动脉粥样硬化中的Toll样受体4抑制氧化应激和血管炎症事件11。本次研究通过卵清蛋白和氢氧化铝诱导AR模型，结果显示AR小鼠鼻黏膜中miR-135a显著降低，通过注射 miR-135a mimic 提高 miR-135a 水平。结果显示提高miR-135a水平能够显著的抑制AR模型IgE水平，缓解鼻黏膜损伤。本次研究在体内水平上证实了miR-135a在AR中降低，而提高miR-135a的水平能够显著缓解AR。为进一步分析miR-135a缓解AR的机制，本研究分析了Treg/Th17细胞平衡和GATA3蛋白的表达情况。Th17/Treg平衡在机体免疫炎症中发挥重要作用，受到过敏原刺激后，Th17/Treg平衡向Th17偏移诱导的炎症反应 12。而损伤鼻黏膜粗肌AR，重新调节Th17/Treg平衡可以有效的缓解AR13。GATA3是一种转录因子，其可识别并结合5-AGATAG-3序列，调控T细胞中基因的转录活性，进而促进T细胞的分化14。研究显示GATA3参与哮喘小鼠中Treg/Th17 失衡15。本次研究结果显示在 AR 小鼠模型中，GATA3 显著升高，与 miR-135a 变化趋势相反，Treg/Th17平衡向 Th17偏移；而过表达 miR-135a则可显著的抑制GATA3蛋白的表达，并且促进Treg细胞比例抑制Th17细胞比例，促进Treg/Th17平衡向Treg偏移。为进一步分析 miR-135a是否在转录后的水平上参与GATA3表达的调控，对二者序列进行了分析，结果显示miR-135a与GATA3 mRNA的3-UTR存在结合位点，并且双荧光素酶报告结果也显示了miR-135a与GATA3靶向结合。本次研究结果提示miR-135a水平的降低可能引起GATA3蛋白的表达，从而促进 T 细胞向 Th17 分化促进炎症反应，参与AR。而过表达miR-135a则可显著抑制GATA3蛋白表达，促进失衡的Treg/Th17平衡恢复。本研究也有一些不足之处，如miR-135a在AR患者中的表达特点以及临床上miR-135a与Treg/Th17平衡的相关性表2miR-135a 对 AR 模型小鼠 Treg 和 Th17 细胞水平的 影响（x s，n=16）Tab.2Effect of miR-135a on levels of Th17 cells and Treg cells in AR model mice（x s，n=16）GroupsControlARAR+miR-135a mimicTreg/%3.680.331.560.121）2.380.211）2）Th17/%1.170.113.950.371）2.300.191）2）Treg/Th173.150.270.390.031）1.030.081）2）Note：Compared with control group，1）P0.05；compared with AR group，2）P0.05.图3Western blot 检测 miR-135a 对 AR 模型小鼠 GATA3蛋白表达的影响Fig.3Western blot detection of effect of miR-135a on expression of GATA3 protein in AR model mice图4miR-135a 与 GATA3 mRNA 3端非翻译区域结合 位点Fig.4Binding site of miR-135a and 3untranslated region of GATA3 mRNA表3双荧光素酶报告验证 miR-135a 与 GATA3 的靶向 关系（x s，相对荧光素酶活性）Tab.3Dual luciferase report verifies targeting relationship between miR-135a and GATA3（x s，Relative luciferase activity）GroupsmiR-135a NCmiR-135a mimicWt-GATA31.000.090.280.041）2）Mut-GATA31.020.110.970.10Note：Compared with miR-135a NC group，1）P0.05；compared with mut-GATA3 group，2）P0.05.1631中国免疫学杂志2023 年第 39 卷仍需要进行分析，miR-135a靶向GATA3调控T细胞分化的机制也需要进一步验证。综上所述，miR-135a可能通过使 AR模型大鼠的 Th17/Treg 平衡恢复缓解 AR 病情。miR-135a 可能成为诊断和治疗AR的新靶点。参考文献：1 WANG L，LV Q，SONG X，et al.ADRB2 suppresses IL-13-induced allergic rhinitis inflammatory cytokine regulated by miR-15a-5pJ.Hum Cell，2019，32（3）：306-315.DOI：10.1007/s13577-019-00259-z.2 QING M，YONGGE L，WEI X，et al.Comparison of Th17 cells mediated immunological response among asthmatic children with or without allergic rhinitisJ.Asian Pac J Allergy Immunol，2019，37（2）：65-72.DOI：10.12932/AP-140317-0047.3 陈敏云，王佳蓉，吴瑞珊.鼻渊通窍颗粒通过调节SP-A水平及Th1/Th2/Th17细胞平衡缓解变应性鼻炎的实验研究 J.中国免疫学杂志，2020，36（2）：2846-2849，2854.DOI：10.3969/j.issn.1000-484X.2020.23.007.4 CUI X，GUO Y，WANG Q，et al.MiR-199-3p-Dnmt3a-STAT3 signalling pathway in ovalbumin-induced allergic rhinitisJ.Exp 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