MiR-139-5p靶向RIPK1_RIPK3_MLKL信号通路对慢性脑低灌注大鼠认知障碍的影响 (1).pdf

天津医药 2023 年 11 月第 51 卷第 11 期MiR-139-5p靶向RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路对慢性脑低灌注大鼠认知障碍的影响史文倩，赵美英，黄捷，贺桂，汪桂青摘要：目的探究微小RNA（miR）-139-5p靶向受体相互作用蛋白激酶（RIPK）1/RIPK3/混合系列蛋白激酶结构域蛋白（MLKL）信号通路对慢性脑低灌注（CCH）大鼠认知障碍的影响。方法将60只SPF级SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组（Sham组）、模型组（Model组）、miR-NC组、miR-139-5p mimic组、miR-139-5p mimic+RIPK1抑制剂Nec-1组（miR-139-5p mimic+Nec-1组），每组12只。除Sham组外，其余组均采用永久性结扎双侧颈总动脉构建CCH模型。采用新物体识别实验、Morris水迷宫实验评价大鼠的认知功能；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠海马组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肿瘤坏死因子（TNF）-、白细胞介素6（IL-6）水平。实时荧光定量PCR（qPCR）法检测大鼠海马组织miR-139-5p及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 表达。Western blot法检测大鼠海马组织RIPK1、RIPK3、MLKL、突触素（SYP）、突触后密度蛋白95（PSD95）、-突触核蛋白（-SYN）蛋白的表达。双萤光素酶报告基因实验验证miR-139-5p和RIPK1的靶向关系。结果与Sham组相比，Model组大鼠分辨系数降低，目标象限停留时间缩短，海马组织miR-139-5p、GSH-Px、SOD水平降低，SYP、PSD95蛋白表达降低（P0.05），逃避潜伏期延长，海马组织MDA、TNF-、IL-6水平升高，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA和蛋白、-SYN蛋白表达升高（P0.05）。与Model组、miR-NC组相比，miR-139-5p mimic组相关指标的表达趋势与上述相反（P0.05）。Nec-1进一步促进了上调miR-139-5p表达对CCH大鼠认知功能的恢复（P0.05）。miR-139-5p和RIPK1存在结合位点。结论上调miR-139-5p可能通过靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路减轻CCH大鼠的认知障碍。关键词：认知障碍；RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路；微小RNA-139-5p；慢性脑低灌注中图分类号：R743.3文献标志码：ADOI：10.11958/20230110Influence of miR-139-5p on cognitive dysfunction in rats with chronic cerebralhypoperfusion by targeting RIPK1/RIPK3/MLKL signal pathwaySHI Wenqian,ZHAO Meiying,HUANG Jie,HE Gui,WANG GuiqingDepartment of Geriatrics,Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,ChinaCorresponding AuthorE-mail:Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of miR-139-5p on cognitive dysfunction in chronic cerebralhypoperfusion(CCH)rats by targeting receptor-interacting protein kinase-1(RIPK1)/receptor-interacting protein kinase-3(RIPK3)/mixed lineage kinase domain-like protein(MLKL)signal pathway.MethodsSixty SPF SD rats were randomlydivided into the sham operation group,the model group,the miR-NC group,the miR-139-5p mimic group and the miR-139-5p mimic+RIPK1 inhibitor Nec-1 group(miR-139-5p mimic+Nec-1 group),with 12 rats in each group.Except thesham group,the other groups used permanent ligation of bilateral common carotid arteries to construct rat CCH model.Newobject recognition experiment and Morris water maze were used to evaluate the cognitive function of rats.Enzyme linkedimmunosorbent assay(ELISA)was used to detect levels of glutathione peroxidase(GSH-Px),superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA),inflammatory factor tumor necrosis factor(TNF)-and interleukin-6(IL-6)in rat hippocampus.Real-time quantitative PCR(qPCR)was used to detect the expression of miR-139-5p,RIPK1,RIPK3,MLKL mRNA in rathippocampus.Western blot method was used to detect the protein expression levels of RIPK1,RIPK3,MLKL,synaptophysin(SYP),postsynaptic density protein 95(PSD95)and-synuclein(-SYN).Double luciferase reporter gene experiment wasused to verify the relationship between miR-139-5p and RIPK1.ResultsCompared with the sham group,the resolutioncoefficient,target quadrant residence time,levels of miR-139-5p,GSH-Px,SOD and the protein expression levels of SYPand PSD95 decreased obviously in hippocampus of the model group rats(P0.05).The escape latency extended,and levelsof MDA,TNF-and IL-6 in hippocampus increased.The mRNA and protein expression of RIPK1,RIPK2,MLKL,the基金项目：河南省医学科技攻关计划联合共建项目（LHGJ20210767）作者单位：郑州大学附属郑州中心医院老年医学科（邮编450000）作者简介：史文倩（1987），女，主治医师，主要从事认知障碍方面研究。E-mail：通信作者E-mail：实验研究1187Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.11慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是阿尔茨海默病、血管性痴呆等认知障碍性疾病的病理基础1。CCH主要是由血容量不足、管腔狭窄等原因引起大脑长期供血不足，造成脑缺血缺氧状态，继而出现持久或进展性的认知障碍2-3。微小RNA（miRNA）可通过调控靶基因来调节CCH相关的病理过程4-6。miR-139-5p是一种在大脑中发挥神经保护作用的miRNA，在脑缺血/再灌注小鼠大脑和氧糖剥夺/复氧诱导的皮层神经元损伤模型中下调，上调其表达可减轻神经元损伤7。但 miR-139-5p在CCH中的作用鲜有报道。受体相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）1/RIPK3/混合系列蛋白激酶结构域蛋白（mixedlineage kinase domain-like protein，MLKL）信号通路与神经细胞的程序性坏死相关8。RIPK1是一种由N末端激酶结构域、中间结构域和C末端死亡结构域组成的蛋白质，当肿瘤坏死因子-（TNF-）结合TNF受体-1形成信号复合物时，RIPK1被募集并发生磷酸化，激活RIPK3和MLKL激酶，使神经细胞发生程序性坏死9-10。抑制RIPK1/RIPK3/MLKL可减轻脑卒中大鼠神经元的坏死样凋亡，改善认知功能9。本研究旨在探讨 miR-139-5p 靶向 RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路对 CCH 大鼠认知障碍的影响。1材料与方法1.1实验动物与细胞60只SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体质量260280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2021-0011。所有大鼠均饲养在SPF级恒温（221）、相对湿度50%60%的通风实验室中，维持12 h/12 h光照黑暗节律，分笼饲养，自由摄食、饮水。适应性饲养1周后用于实验。本实验经我院动物伦理委员会批准（批件号20220017），实验操作符合 实验动物管理条例 相关要求。人胚胎肾细胞株HEK293购自中国科学院上海细胞库，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37、5%CO2的细胞培养箱环境中培养。1.2主要试剂与仪器miR-NC、miR-139-5p mimic购自上海吉玛制药有限公司；RIPK1抑制剂Nec-1、胎牛血清、RPMI1640培养基购自英国Abcam公司；戊巴比妥钠购自中国上海信裕生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）、超 氧 化 物 歧 化 酶（SOD）、丙 二 醛（MDA）、TNF-、白细胞介素 6（IL-6）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自 Invitrogen 公司；兔源 RIPK1、RIPK3、MLKL、突 触 前 膜 和 突 触 后 膜 关 键 蛋 白 突 触 素（synapsin，SYP）、突 触 后 密 度 蛋 白 95（postsynapticdensityprotein 95，PSD95）、-突触核蛋白（-synuclein，-SYN）一抗和山羊抗兔IgG二抗购自美国Sigma-Aldrich公司。Morris水迷宫购自中国医学科学院药物研究所。1.3方法1.3.1大鼠CCH模型建立采用随机数字表法抽取12只大鼠为假手术组（Sham组），余48只大鼠建立CCH模型。参照文献 10，永久性结扎双侧颈总动脉（two vessel occlusion，2VO）构建大鼠 CCH 模型。术前所有大鼠禁食 12 h，禁水4 h。采用3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。将麻醉后大鼠仰卧固定在手术台上，颈前皮肤去毛，消毒后于颈部正中行1 cm切口，分离双侧颈动脉，结扎一侧颈总动脉，30 min后结扎对侧颈总动脉，注意保持大鼠体温恒定。缝合皮肤，消毒，等待大鼠苏醒。1.3.2动物分组与给药采用随机数字表法将造模大鼠分为模型组（Model 组）、miR-NC 组、miR-139-5p mimic 组、miR-139-5p mimic+RIPK1 抑 制 剂 Nec-1 组（miR-139-5pmimic+Nec-1组），每组12只。造模成功第2天，miR-NC组大鼠于侧脑室注射miR-NC（0.8 nmol miR-NC溶于4 L PBS中7），miR-139-5p mimic 组大鼠于侧脑室注射同剂量的miR-139-5p mimic，miR-139-5p mimic+Nec-1组大鼠于侧脑室注射同剂量的 miR-139-5p mimic 和 Nec-1（10 mol/LNec-1 10 L11）。侧脑室注射方法：麻醉大鼠后固定，沿中线进行头皮切口，并在颅骨右侧钻一个毛刺孔，使用微量注射器分别将上述试剂注射到右侧脑室中。注射5 min后再取出针头，用骨蜡密封毛刺孔，待大鼠苏醒。Sham组只行开关颈部的操作，不结扎颈总动脉，与Model组侧脑室注射等量的生理盐水。1.3.3新物体识别实验造模4周后，准备一个无盖的白色塑料盒，以及颜色、大小、形状均不相同的两套物体。首先对各组大鼠进行适应性训练。在盒子一侧2个角落放置完全相同的2个物体，把大鼠面向对侧盒壁放入盒子中，使其在盒子中自由活动15 min，每放入1只大鼠前对盒内进行乙醇消毒，消除盒子气味。实验过程中保持参照物不移动，且环境安静。次日进行物体再认实验。将第1天放入的其中一个物体更换为颜色、大小、形状均不同的新物体，按相同的方法放入大鼠，分别记录5 min内大鼠对新物体和旧物体的探索时间。计算分辨系数，分辨系数=（探索新物体时间-探索旧物体时间）/探索总时间。protein expression of-SYN increased obviously(P0.05).Compared with the model group and the miR-NC group,theexpression trends of related indexes were opposite to the above in the miR-139-5p mimic group(P0.05).Nec-1 furtherpromoted the recovery of cognitive function in CCH rats by up-regulating the expression of miR-139-5p(P0.05).MiR-139-5p negatively regulated the expression of RIPK1.ConclusionThe up regulation of miR-139-5p may alleviate thecognitive dysfunction of CCH rats by targeting the inhibition of RIPK1/RIPK3/MLKL signaling pathway.Key words:cognitive dysfunction;RIPK1/RIPK3/MLKL pathway;MicroRNA-139-5p;chronic cerebral hypoperfusion1188天津医药 2023 年 11 月第 51 卷第 11 期1.3.4Morris水迷宫实验新物体识别实验后，进行Morris水迷宫实验。定位航行实验：每日于东、南、西、北4个定点放入大鼠，使大鼠头朝向水池壁放入水中。记录大鼠找到平台的时间，并使其在平台上停留15 s，如果60 s内未成功找到平台，则引导大鼠找到平台。实验期间保持环境安静且参照物不变。重复5 d，记录大鼠找到平台所用的时间，即逃逸潜伏期。空间探索实验：在第6天撤去平台，于原平台位置的对侧象限面向水池壁放入大鼠，记录60 s内大鼠在平台所在象限活动的时间。1.3.5ELISA检测大鼠海马组织GSH-Px、SOD、MDA、TNF-、IL-6水平水迷宫实验后，脱颈处死所有大鼠，断头取脑，分离海马组织，放入液氮速冻后置于-80 超低温冰箱中保存。根据GSH-Px、SOD、MDA、TNF-、IL-6 ELISA试剂盒说明书，检测海马组织GSH-Px、SOD、MDA、TNF-、IL-6水平。1.3.6实时荧光定量PCR（qPCR）法检测大鼠海马组织miR-139-5p及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表达水平取冻存的海马组织，根据RNA提取试剂盒说明书，提取大鼠海马组织总RNA，并将RNA反转录为cDNA。以U6、-actin为内参进行PCR扩增反应。反应体系（20 L）：10 L SYBRPremixEx Taq（2）、0.8 L PCR正向引物（10 mol/L）、0.8 L PCR反向引物（10 mol/L）、2 L cDNA（200 g/L）和6.4 L无菌水。反应条件：95 预变性30 s；95 变性5 s，60 退火20 s，循环40次。引物序列见表1，引物由中国上海GenePharma构建合 成。应 用 2-Ct法 计 算 miR-139-5p 及 RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA的相对表达水平。1.3.7Western blot 检 测 大 鼠 海 马 组 织 RIPK1、RIPK3、MLKL、SYP、PSD95、-SYN的表达取冻存的大鼠海马组织，加入RIPA蛋白裂解液提取组织总蛋白。经BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质，转PVDF膜，清洗并用脱脂奶粉封闭。用兔源RIPK1（1 500）、RIPK3（1 1 000）、MLKL（1 1 000）、SYP（1 1 000）、PSD95（1 1 000）、-SYN（1 1 000）、GAPDH（1 1 000）一抗于4 下孵育过夜。次日复温洗膜后，加入山羊抗兔IgG二抗（1 5 000）室温孵育2 h，加入ECL试剂进行显影，利用Image Lab软件对目标蛋白的灰度值进行计算分析。1.3.8双萤光素酶基因报告实验验证靶向关系使用TargetScan数据库进行miR-139-5p和RIPK1之间的结合位点预测。由上海 GenePharma 公司构建 RIPK1 野生型质粒（RIPK1-WT）和突变型质粒（RIPK1-MUT），将HEK293细胞以 1105个/孔接种在 24 孔板中。用 Lipofectamine2000 将RIPK1-WT 和 RIPK1-MUT 分别与 miR-NC 或 miR-139-5pmimic共转染于HEK293细胞中。48 h后，应用荧光测定仪检测萤光素酶活性。1.4统计学方法采用GraphPad Prism7.0软件进行数据分析。计量资料采用xs表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠新物体识别能力比较Sham 组、Model组、miR-NC组、miR-139-5p mimic组和miR-139-5p mimic+Nec-1组分辨系数分别为0.420.06、0.160.02、0.150.01、0.240.04和0.380.06，其差异有 统 计 学 意 义（n=12，F=100.000，P0.01）。与Sham 组相比，Model 组大鼠分辨系数降低（P0.05）；与 Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5pmimic组大鼠分辨系数升高（P0.05）；与miR-139-5p mimic组相比，miR-139-5p mimic+Nec-1组大鼠分辨系数升高（P0.05）。2.2各组大鼠定位航行实验逃避潜伏期比较与Sham 组相比，Model 组大鼠逃避潜伏期延长（P0.05）；与 Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5pmimic 组大鼠逃避潜伏期缩短（P0.05）；与 miR-139-5p mimic组相比，miR-139-5p mimic+Nec-1组大鼠逃避潜伏期缩短（P0.05），见表2。2.3各组大鼠空间探索实验目标象限停留时间比较Sham 组、Model 组、miR-NC 组、miR-139-5pmimic组和miR-139-5p mimic+Nec-1组目标象限停留 时 间（s）分 别 为 27.872.37、10.481.25、9.891.04、18.282.20 和 25.443.42，差异有统计学意义（n=12，F=165.987，P0.01）。与 Sham 组 相 比，Model组大鼠目标象限停留时间缩短（P0.05）；与Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5p mimic 组大鼠目标象限停留时间延长（P0.05）；与miR-139-5p mimic组相比，miR-139-5p mimic+Nec-1组大鼠目标象限停留时间延长（P0.05）。2.4各组大鼠海马组织GSH-Px、SOD、MDA、TNF-、IL-6水平比较见表3。与Sham组相比，Model组大鼠GSH-Px、SOD水平降低，MDA、TNF-、IL-6水平升高（P0.05）；与Model组、miR-NC组相比，miR-139-5p mimic组大鼠GSH-Px、SOD水平升高，MDA、TNF-、IL-6 水平降低（P0.05）；与 miR-基因名称miR-139-5pRIPK1RIPK3MLKLU6-actin引物序列（53）上游：CAGCAGTGGCAGAGTGCG下游：CGATCCAGCCTACCTAGAGTGCA上游：TTCATGGTGCACAAACCCCT下游：TGACACAAGCGCAACAAAGG上游：CATCGATCTCTCTCGTGGGC下游：CGTACACGTAGTCCCACTCG上游：GGGAACACTCCACGGAAACA下游：GATCTTGCAGTCTCTCGGGG上游：GGTCAGCCAGCTCAAGCGTC下游：TGGACACGCTCGCTCTGAATCG上游：CCCGCGAGTACAACCTTCTT下游：AGGGTCAGGATGCCTCTCTT产物大小/bp15912118511713698Tab.1Primer design sequence表1引物设计序列1189Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.11139-5p mimic组相比，miR-139-5p mimic+Nec-1组大鼠GSH-Px、SOD水平升高，MDA、TNF-、IL-6水平降低（P0.05）。2.5各组大鼠 miR-139-5p、RIPK1、RIPK3、MLKLmRNA 水平比较与 Sham 组相比，Model 组大鼠miR-139-5p水平降低，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平升高（P0.05）；与Model组、miR-NC组相比，miR-139-5p mimic 组大鼠 miR-139-5p 水平升高，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA水平降低（P0.05）；与miR-139-5p mimic 组 相 比，miR-139-5p mimic+Nec-1组大鼠miR-139-5p水平差异无统计学意义，RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平降低（P0.05），见表4。2.6各组大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路相关蛋白与 SYP、PSD95、-SYN 蛋白表达比较与 Sham组相比，Model组大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、-SYN蛋白表达升高，SYP、PSD95蛋白表达水平降低（P0.05）；与 Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5pmimic组大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL、-SYN蛋白表达水平降低，SYP、PSD95 蛋白表达水平升高（P0.05）；与 miR-139-5p mimic 组相比，miR-139-5pmimic+Nec-1 组大鼠 RIPK1、RIPK3、MLKL、-SYN蛋白表达水平降低，SYP、PSD95蛋白表达水平升高（P0.05），见表5、图1。2.7双萤光素酶基因报告实验预测得到的miR-139-5p 和 RIPK1 之 间 的 结 合 位 点 见 图 2。与RIPK1-WT共转染后，miR-139-5p mimic组萤光素酶活性较 miR-NC 组降低（0.280.03 vs.1.170.06，n=3，t=22.980，P0.05）；与RIPK1-MUT共转染后，miR-139-5p mimic组与miR-NC组萤光素酶活性差异无统计学意义（1.140.05 vs.1.100.09，n=3，t=0.673，P0.05）。3讨论CCH可以导致神经元变性和认知障碍，CCH后认知障碍与沉默突触增多、线粒体老化、-SYN表达增加有关12-14。SYP是位于突触前膜囊泡内的钙结合膜蛋白，可将神经元接受到的外界信号所产生的电信号转化为化学信号，突触小泡移动至突触前膜，与其融合后释放神经递质，参与突触的连接；而突触连接是认知功能的神经生物学基础，突触连接丧失或功能异常将会导致严重的认知障碍15。因此，SYP表达水平能有效反映突触的结构和功能状组别Sham组Model组miR-NC组miR-139-5p mimic组miR-139-5p mimic+Nec-1组F1 d30.283.7553.655.02a53.234.8642.363.25bc33.552.38d88.8972 d26.623.3750.404.16a50.064.2237.143.54bc28.101.95d125.7183 d24.392.7248.454.21a48.644.2633.712.92bc25.551.67d154.9594 d20.382.3045.323.85a45.534.0829.422.39bc22.831.23d199.1065 d16.601.8741.063.77a41.653.5125.372.14bc18.621.15d241.944Tab.2Comparison of escape latency in Morris water maze positioning navigation experiment between the five groups of rats表2各组大鼠Morris水迷宫定位航行实验逃避潜伏期比较（n=12，s，xs）P0.01；a与Sham组比较，b与Model组比较，c与miR-NC组比较，d与miR-139-5p mimic组比较，P0.05；表35同。Tab.3Comparison of GSH-Px,SOD,MDA,TNF-and IL-6 levels in hippocampus between the five groups of rats表3各组大鼠海马组织GSH-Px、SOD、MDA、TNF-、IL-6水平比较（n=6，xs）组别Sham组Model组miR-NC组miR-139-5p mimic组miR-139-5p mimic+Nec-1组FGSH-Px/（kU/g）28.043.368.670.95a8.960.7816.831.22bc27.742.30d140.124SOD/（kU/g）50.472.6312.240.88a11.820.9526.412.38bc43.103.59d343.236MDA/（mmol/g）0.780.083.240.25a3.120.211.180.09bc0.800.03d383.479TNF-/（ng/L）95.159.24316.4226.32a309.4827.26248.3725.40bc176.4516.34d108.404IL-6/（ng/L）12.531.1458.636.05a57.035.7630.282.51bc16.491.73d178.559组别Sham组Model组miR-NC组miR-139-5pmimic组miR-139-5pmimic+Nec-1组FmiR-139-5p1.000.000.310.03a0.300.030.660.08bc0.890.09191.724RIPK11.000.002.240.20a2.200.211.640.13bc1.150.06d94.870RIPK31.000.001.970.18a1.950.191.580.09bc1.230.03d71.818MLKL1.000.002.160.20a2.120.211.650.10bc1.280.04d81.511Tab.4Comparison of miR-139-5p,RIPK1,RIPK3 andMLKL mRNA levels between the five groups of rats表4各组大鼠miR-139-5p及RIPK1、RIPK3、MLKLmRNA水平比较（n=6，xs）1190天津医药 2023 年 11 月第 51 卷第 11 期态，与认知功能密切相关16。PSD95是突触后膜的标志性蛋白，能接受突触信号并将其整合传递至突触后细胞，同时作为一种神经细胞骨架蛋白，在突触功能活性和突触信息传导中发挥重要作用17。研究显示，SYP 和 PSD95 表达水平在认知缺陷模型和CCH大鼠中降低，上调SYP和PSD95表达可改善认知功能18-19。-SYN大量存在于神经细胞中，在突触间信息传递、突触可塑性等神经功能中起到重要作用。研究发现，-SYN的异常聚集会损害突触，可以通过减少突触蛋白表达、激活钙调磷酸酶等机制影响突触功能，并通过炎症、细胞凋亡、氧化应激等机制介导神经元死亡，导致神经传递功能障碍，与认知功能密切相关20-21。研究显示，在大鼠的黑质内输注-SYN低聚物会诱发神经炎症，导致认知障碍22。本研究通过2VO法建立大鼠CCH模型，结果发现，与Sham组相比，Model组大鼠分辨系数、目标象限停留时间、GSH-Px、SOD水平、SYP、PSD95蛋白表达水平显著下降，逃避潜伏期、MDA水平、-SYN蛋白表达水平显著上升，说明大鼠CCH 模型建立成功。miRNA在中枢神经系统中广泛表达，且作为多种细胞生物学过程的关键调节因子23。Wang等24研究发现，上调 miR-139-5p 可以负调节 c-Jun/NLRP3炎症小体信号传导，对氧-葡萄糖剥夺/复氧诱导的神经损伤发挥神经保护作用。Yao等7研究发 现 人 参 皂 苷 Rd 通 过 上 调 miR-139-5p 抑 制FOXO1，随后激活Nrf2抗氧化途径，减轻缺血性卒中。本研究中，与Model组、miR-NC组相比，miR-139-5p mimic组大鼠miR-139-5p水平、分辨系数、目标象限停留时间、GSH-Px、SOD水平、SYP、PSD95蛋白表达上升，逃避潜伏期、海马组织MDA水平、-SYN蛋白表达下降，说明上调miR-139-5p可能减轻CCH大鼠的认知障碍。RIPK1的激活能够启动细胞RIPK3/MLKL依赖性坏死和细胞FADD/caspase-8依赖性凋亡8。研究发现，短暂性脑缺血可以显著激活RIPK1激酶，进而激活RIPK3和MLKL激酶，使神经细胞发生程序性坏死；而Nec-1能够通过抑制缺血性卒中后大鼠脑中RIPK1介导的RIPK3/MLKL依赖性坏死性凋亡来防止缺血性神经元死亡8，与本研究结果一致。本研究结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠海马组织RIPK1、RIPK3、MLKL的mRNA和蛋白表达上升，说明CCH状态下，RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路被激活。与 Model 组、miR-NC 组相比，miR-139-5pmimic组大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL的mRNA和蛋白表达下降，且双萤光素酶实验证实miR-139-5p可靶向调节RIPK1表达，说明上调miR-139-5p可能通过靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路减轻CCH大鼠的认知障碍。为了验证此猜想，笔者用RIPK1抑制剂Nec-1来干预miR-139-5p mimic组大鼠，结果发现，Nec-1促进了上调miR-139-5p对CCH大鼠认知功能的恢复。组别Sham组Model组miR-NC组miR-139-5p mimic组miR-139-5p mimic+Nec-1组FRIPK10.210.020.860.08a0.830.080.550.03bc0.380.02d164.338RIPK30.240.020.900.09a0.920.080.410.04bc0.290.02d196.456MLKL0.170.020.810.08a0.790.080.480.03bc0.230.01d191.366SYP0.870.080.230.02a0.210.020.560.05bc0.750.08d166.360PSD950.820.080.190.02a0.180.020.420.06bc0.800.08d188.145-SYN0.150.020.760.07a0.770.070.380.03bc0.200.02d232.096Tab.5Comparison of RIPK1/RIPK3/MLKL signaling path-related proteins and SYP,PSD95 and-SYN proteinexpression levels between the five groups of rats表5各组大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路相关蛋白与SYP、PSD95、-SYN蛋白表达比较（n=6，xs）RIPK1RIPK3MLKLSYPPSD95-SYNGAPDHABCDEFig.1The expression of related proteins detected by Western blot assay图1Western Blot检测相关蛋白表达A：Sham组；B：Model组；C：miR-NC组；D：miR-139-5p mimic组；E：miR-139-5p mimic+Nec-1组。Fig.2Binding sites of miR-139-5p and RIPK1图2miR-139-5p和RIPK1的结合位点1191Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.11综上所述，上调miR-139-5p可能通过靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路减轻CCH大鼠的认知障碍。然而，本研究还仅在体内水平上进行了探究，后续需在体外水平进一步验证该靶点作用。参考文献1 DUNCOMBE J，KITAMURA A，HASE Y，et al.Chronic cerebralhypoperfusion：A key mechanism leading to vascular cognitiveimpairment and dementia.Closing the translational gap betweenrodent models and human vascular cognitive impairment anddementiaJ.Clin Sci（Lond），2017，131（19）：2451-2468.doi：10.1042/CS20160727.2 YAN N，XU Z，QU C，et al.Dimethyl fumarate improves cognitivedeficits in chronic cerebral hypoperfusion rats by alleviatinginflammation，oxidative stress，and ferroptosis via NRF2/ARE/NF-B signal pathwayJ.Int Immunopharmacol，2021，9