let-7b-3p靶向调控ANKRD49抑制鼻咽癌细胞侵袭和迁移.pdf
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1、现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期回论著Original Article基础研究?【Ba s i c Re s e a r c h MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.22.4097:let-7b-3p靶向调控 ANKRD49抑制鼻咽癌细胞侵袭和迁移王意,苟小霞,朱琳,黄钢,陈念,周凯,申莎莎遵义医科大学第二附属医院头颈肿瘤科,贵州遵义56 30 0 3【摘要】目的:探究let-7b-3p调控锚蛋白重复结构域49(ANKRD49)表达影响鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)细胞侵袭和迁移能力的潜在机制。方法:利用
2、GEO、T CG A 数据库分析鼻咽癌及头颈部肿瘤组织中let-7b 表达水平及其与临床病理参数的关系。免疫组化技术检测 ANKRD49 在 NPC 及鼻咽炎症组织中的表达水平。RT-PCR检测 let-7b-3p 在鼻咽癌细胞系中的表达。Transwell 侵袭实验与划痕实验分别检测let-7b-3p在鼻咽癌细胞侵袭与迁移能力中的作用。采用双荧光素酶基因报告实验进行let-7b-3p与ANKRD49靶向关系验证。RT-PCR、W e s t e r m Bl o t 及回复实验验证let-7b-3p对ANKRD49 的调控作用。结果:基于鼻咽癌miRNA芯片分析,相比正常鼻咽组织,let-7
3、b-3p 在鼻咽癌组织中表达下调,并且let-7b-3p表达水平与肿瘤浸润深度及淋巴结分期有关(P0.05)。免疫组化示ANKRD49在鼻咽癌组织中高表达。侵袭、迁移实验结果示,let-7b-3pmimic组及inhibitor组分别抑制和促进鼻咽癌细胞的侵袭能力及迁移能力(P均 0.0 5)。通过双荧光素酶报告基因实验显示let-7b-3pmimic可抑制ANKRD49-wt荧光素酶活性(0.350.0 8 vs0.610.05,P0.05)。RT-PC R及WesternBlot结果表明,let-7b-3pinhibitor组的ANKRD49mRNA和蛋白表达水平均高于正常组与let-7b
4、-3pmimic组。回复实验发现,干扰 ANKRD49影响 let-7b-3p inhibitor 组和let-7b-3p mimic 组对鼻咽癌细胞侵袭及迁移的促进和抑制作用。结论:let-7b-3p靶向调控ANKRD49的表达抑制鼻咽癌细胞侵袭及迁移,let-7b-3p/ANKRD49轴可能是鼻咽癌潜在的治疗靶点。【关键词】let-7b-3p;ANKRD49;鼻咽癌;侵袭;迁移【中图分类号】R739.63【文章编号】16 7 2-4992-(2 0 2 3)2 2-40 97-0 8let-7b-3p targeting and regulating ANKRD49 inhibits th
5、e invasion and migration of na-sopharyngeal carcinoma cellsWANG Yi,GOU Xiaoxia,ZHU Lin,HUANG Gang,CHEN Nian,ZHOU Kai,SHEN ShashaDepartment of Head and Neck Oncology,the Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563003,China.Abstract】O b j e c t i v e:T o e x p l o r e t h
6、e p o t e n t i a l me c h a n i s m b y w h i c h l e t -7 b -3p r e g u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o fankyrin repeat domain 49(ANKRD49)and affects the invasion and migration of nasopharyngeal carcinoma(NPC)cells.Methods:GEO and TCGA databases were used to analyze the expression level of l
7、et-7b in NPC and head andneck tumor tissues and its relationship with clinicopathological parameters.The expression level of ANKRD49 in NPCand nasopharyngeal inflammatory tissues was detected by immunohistochemical technique.RT-PCR detected let-7b-3p expression in NPC cell lines.Transwell invasion a
8、ssay and scratch assay were used to detect the role of let-7b-3p in the invasion and migration of NPC cells.The targeting relationship between let-7b-3p and ANKRD49 wasverified by dual luciferase gene reporter assay.RT-PCR,Western Blot and reply experiments verified the regulatoryeffect of let-7b-3p
9、 on ANKRD49.Results:Based on NPC miRNA microarray analysis,let-7b-3p expression wasdown-regulated in NPC tissues compared with normal nasopharyngeal tissues,and the expression level of let-7b-【收稿日期】2023 05 08【基金项目】贵州省卫生健康委科学技术基金项目(编号:gzwkj2021-053);贵州省科技厅基础研究计划编号:黔科合基础-ZK(2 0 2 3)一般525】;贵州省遵义市科技厅项目编
10、号:遵市科合HZ字(2 0 2 2)40 7 号】【作者简介】王意(1997 一),男,贵州遵义人,医师,硕士,主要从事鼻咽癌分子靶向治疗的临床研究工作。E-mail:【通信作者】苟小霞(198 2 一),女,贵州赤水人,博士,主任医师,硕士生导师,主要从事鼻咽癌分子靶向治疗的临床研究工作。Ema i l:gouxx2020 【文献标识码】A【修回日期】2 0 2 3-0 6-2 8D01:10.3969/j.issn.1672 4992.2023.22.001:4098 3p was correlated with tumor invasion depth and lymph node st
11、age(P 0.05).Immunohistochemistry showed thatANKRD49 was highly expressed in NPC tissues.The results of invasion and migration experiments showed that the let-7b-3p mimic group and the inhibitor group respectively inhibited and promoted the invasion ability and migrationability of NPC cells(both P0.0
12、5).The double-luciferase reporter assay showed that let-7b-3p mimic could in-hibit the luciferase activity of ANKRD49-wt(0.35 0.08 vs 0.61 0.05,P0.05).The results of RT-PCR and Western Blotshowed that the expression levels of ANKRD49 mRNA and protein in the let-7b-3p inhibitor group were higherthan
13、those in the normal group and let-7b-3p mimic group.Reversion experiments found that interference withANKRD49 affects the promoting and inhibiting effects of let-7b-3p inhibitor group and let-7b-3p mimic groupon the invasion and migration of NPC cells.Conclusion:let-7b-3p regulates the expression of
14、 ANKRD49 to inhibitthe invasion and migration of NPC cells.The let-7b-3p/ANKRD49 axis may be a potential therapeutic target forNPC.Key words let-7b-3p,ANKRD49,nasopharyngeal carcinoma,invasion,migration鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)是起源于鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤,在我国东南部和台湾地区发病率较高。病因常与遗传易感性和EB病毒感染等有关。鼻咽癌具有高侵袭性及高转移
15、性等特征,约2/3的患者在就诊时已经发展到局部晚期,而且常伴有颈部淋巴结转移 。鼻咽癌虽然对放疗敏感,但远处转移是治疗失败的首要原因。一旦出现远处转移,往往提示患者生存预后较差,中位生存时间小于2 0个月2 。因此,在分子水平上探讨鼻咽癌的侵袭、转移机制,为寻找新的分子靶向治疗及其重要。微小RNA(m i RNA)是一类内源性非编码RNA。m i RNA s靶向于mRNA的3非翻译区,从而抑制靶基因的翻译或促进靶基因mRNA 的降解。miRNAs 在“癌基因或抑癌基因”中发挥调控作用,并构成miRNA/靶基因调控轴,从而参与到恶性肿瘤的发生发展过程3-4。let-7 是最早被发现抑制肿瘤生长的
16、miRNA家族之_5。近年来,相关研究发现,let-7一些家族成员在肿瘤中发挥了重要作用,可应用于多种癌症诊断和预后评估,包括肺瘤、乳腺癌、头颈部肿瘤等6-8 1。let-7b-3p是let-7家族重要成员之一,以前被称为let-7b,多种研究已证实let-7b-3p可参与肺腺癌、宫颈癌的发生发展。在肺腺癌细胞和组织中发现let-7b-3p下调,且靶向BRF2介导的MAPK/ERK通路在体内和体外抑制肺腺癌细胞的增殖和转移 。在宫颈癌细胞中,let-7b-3p可影响其增殖及凋亡(10)。但1let-7b-3p在鼻咽癌中的作用尚未被证实。本研究首先应用TCGA及CEO数据库证明let-7b-3p
17、在鼻咽癌中表达显著下调,进一步探讨了let-7b-3p与鼻咽癌患者临床病理特征的相关性,并通过体外实验揭示let-7b-3p在鼻咽癌恶性表型中的作用。本研究有望揭示let-7b-3p在鼻咽癌发生发展中的作用及其机制,为鼻咽癌临床治疗相关靶点提供理论基础。1材料与方法1.1生信分析非编码RNA矩阵数据来自GEO数据库(https:/wwwncbi.nlm.nih.gov/geo/)。鼻咽癌miRNA表达谱包括GSE32960(正常鼻咽组织18 例,鼻咽癌组织312 例)、GSE36682(正常鼻咽组织6 例,鼻咽癌组织6 2 例)及GSE70970(正常鼻咽组织17 例,鼻咽癌组织2 46 例)
18、。其中GSE36682、G SE7 0 97 0 包括患者基本资料,如年龄、性别、肿瘤王意,等let-7b-3p靶向调控ANKRD49抑制鼻咽癌细胞侵袭和迁移Modern Oncology 2023,31(22):4097-4104分期等。R语言“limma”包检测GSE32960中miRNAs的差异表达,调整后的P 1或-1被定义为筛选miRNAs差异表达的阈值。使用“Bioc-Manager“limma“sva等程序包对GSE70970及CSE36682的数据集进行合并、差异分析及批次矫正。使用TCGA数据库(https:/tcgadata.nci.nih.gov/tcga/)分析let-
19、7b-3p及ANKRD49在头颈部肿瘤表达水平,R包ggplot2进行组间差异性分析。基于R语言的GSVA、c lu s t e r Pr o f ile r 包对TCGA头颈部肿瘤患者的差异表达基因矩阵,计算 GO-KEGG和Hallmark基因集在每个样本中的通路富集分值。使用R包“limma”包对ANKRD49高低表达组的通路富集分值进行差异分析。1.2细胞系及主要试剂本课题组存有鼻咽癌 Sune-1细胞、6-10 B细胞,CNE2细胞来自遵义医科大学肿瘤学实验室。胰蛋白酶、DEPC处理水、10%过硫酸铵、10%SDS、T EM ED、丽春红S、青链双抗购自北京索莱宝科技有限公司;Tri
20、zol、Li p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 购自美国Invitrogen公司;氯仿、异丙醇、无水乙醇购自上海国药;SYBRGreenPCR试剂盒、逆转录试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司;DH培养基、16 40 培养基购自上海格来赛生命科技公司;双荧光检测试剂盒、辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自上海碧云天公司;CTIF、GAPDH购自美国Proteintech公司;PVDF膜、发光液购自美国Millipore;BSA购自广州赛国生物科技有限公司;FBS购自上海图翎生物科技有限公司;Tanswell小室购自美国Corning公司。1.3细胞培养
21、及转染鼻咽癌细胞株6 10 B、Su n e-1、C NE2 细胞均用含10 0mL/L胎牛血清、10 0 g/mL链霉素、10 0 IU/mL的DMEM培养基50 mL/L于5%CO2、37 的培养箱内培养。取对数生长期的6-10 B细胞,细胞培养到8 0%左右融合度按照试验分组进行转染,具体分组为:let-7b3p NC、le t -7 b-3pmimic,let-7b-3p inhibitor,let-7b-3p mimic+siRNA NC、let-7b-3p mimic+ANKRD49 siRNA、l e t -7 b -3p i n h i b i t o r+siRNA NC,l
22、et-7b-3p inhibitor+ANKRD49 siRNA。1.4荧光实时 PCR(RT-PCR)检测 let-7b-3p及ANKRD49的表达Trizol裂解液裂解各组细胞,提取RNA。制备cDNA模现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期板以及PCR扩增,扩增条件为9 410 min,(9 42 0 s,552 0 s,7 2 2 0 s)40 个循环。所用到的引物序列如下,let-7b-3p上游及下游引物序列分别为:AGCTACATCTGGCTACTAGCTACATCTGGCTACT,CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGGAAG
23、GC;U6上游及下游引物序列分别为:CTCGCTTCGGCAGCACA、A C G C T T C A C G A A T T T GCGT;ANKRD49上游及下游引物序列分别为:CACCTTATTCCTACTGG、A T C T G C T T G G G T C T T T T;G A PD H 上游及下游引物序列分别为:GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT、G G CT G T T G T CATACTTCTCATGG;采用2-AC 法计算let-7b-3p以及ANKRD49的平均相对表达量。1.5免疫组化检测ANKRD49蛋白表达水平收集遵义医科大学附属医院病理科鼻咽癌石蜡组织
24、标本2 6 例及鼻咽炎症组织标本2 0 例,所有病例病理诊断明确。将石蜡组织蜡块脱蜡水化、抗原修复、抗原封闭、显色等。按染色强度评分:0 分(无着色),1分(淡黄色),2 分(棕黄色),3分(棕褐色)。按肿瘤细胞染色阳性率评分:0 分(1%),1 分(1%2 5%),2 分(2 6%50%),3 分(51%75%),4分(7 6%10 0%)。以“染色强度评分”和“肿瘤细胞染色阳性率”的乘积为总评分,得出0、1、2、3、4、6、8、9、12分值,具体分组:0 分为阴性(),14分为弱阳性(+),58 分为中度阳性(+),912 分为强阳性(+)。染色评分 6 分为 ANKRD49低表达组,6
25、分为 ANKRD49高表达组。1.6Western Blot检测 ANKRD49 蛋白表达各组细胞中加人适量RIPA裂解液将细胞分离并提取蛋白,加入适量的PMSF,置于冰上裂解30 min;使用BCA定量试剂盒按照说明书要求检测蛋白浓度;对蛋白进行电泳,转膜,加人5%脱脂牛奶进行封闭。加人一抗CTIF(1:10 0 0)、GAPDH(1:1000)与膜4孵育过夜,使用TBST洗涤5次,随后加人辣根酶标记山羊抗兔IgG(1:10 0 0)、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(1:1000)室温下温育1h,一体式化学发光仪拍摄照片。以GAPDH为内参,评价各目的蛋白的相对表达水平。1.7Transwell
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