LncRNA NEAT1对垂体瘤细胞系GH3侵袭和迁移的作用机制研究.pdf

中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期LncRNA NEAT1对垂体瘤细胞系GH3侵袭和迁移的作用机制研究郑锴1，罗秀玲2，张玮豪1，刘宇利1，李玉明1，廖尚高3贵州医科大学1.附属医院神经外科，2.附属医院头颈肿瘤科，3.药学院，贵阳550004【摘要】目的探讨lncRNA NEAT1对垂体瘤细胞侵袭、迁移的作用及机制。方法qRT-PCR检测 lncRNA NEAT1、miR-134和 ITGB1表达；Transwell检测侵袭和迁移；双荧光素酶报告基因实验检测miR-134与lncRNA NEAT1、ITGB1的调控关系；Western blot检测ITGB1/FAK/PI3K通路相关蛋白表达。结果敲低 lncRNA NEAT1 抑制 GH3 细胞侵袭和迁移（P0.05）；抑制 miR-134 可逆转下调 lncRNANEAT1对GH3细胞侵袭、迁移的抑制作用（P0.05）。miR-134与lncRNA NEAT1和ITGB1存在负靶向调控关系（P0.05）。上调miR-134抑制GH3细胞侵袭和迁移，抑制ITGB1/FAK/PI3K通路激活（P0.05）；ITGB1过表达削弱上调miR-134对GH3细胞的影响（P0.05）。结论下调lncRNA NEAT1靶向miR-134可能通过抑制ITGB1/FAK/PI3K通路激活抑制垂体瘤细胞侵袭、迁移。【关键词】lncRNA NEAT1；miR-134；垂体瘤；侵袭；迁移【中图分类号】R736.4【文献标识码】A【DOI】10.13418/j.issn.1001-165x.2023.5.08Mechanism of LncRNA NEAT1 on invasion and migration of pituitary tumor cellsZheng Kai1,Luo Xiuling2,Zhang Weihao1,Liu Yuli1,Li Yuming1,Liao Shanggao31.Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,GuizhouProvince,China;2.Department of Head and Neck Oncology,Affiliated Hospital of Guizhou MedicalUniversity,Guiyang 550004,Guizhou province,China;3.School of Pharmacy,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou province,China【Abstract】ObjectiveTo explore the effect and potential mechanism of lncRNA NEAT1 on theinvasion and migration of pituitary tumor cells.MethodsThe expressions of lncRNA NEAT1,miR-134,and ITGB1 were detected by qRT-PCR.Transwell was used to detect the invasion and migration.Theregulatory relationship between miR-134 and lncRNA NEAT1 and ITGB1 was detected by a double luciferasereporter gene experiment.The expression of ITGB1/FAK/PI3K pathway-related proteins was detected byWestern blot.ResultsKnockdown of lncRNA NEAT1 inhibited the invasion and migration of GH3 cells(P0.05);inhibition of miR-134 could reverse the inhibitory effect of down-regulated lncRNA NEAT1 on theinvasion and migration of GH3 cells(P0.05).miR-134 had a negative targeted regulation relationship withlncRNAs NEAT1 and ITGB1(P0.05).Up-regulation of miR-134 inhibited the invasion and migration ofGH3 cells and inhibited the activation of the ITGB1/FAK/PI3K pathway(P0.05).ITGB1 overexpressionattenuated the effect of up-regulated miR-134 on GH3 cells(P0.05).ConclusionsDown-regulation oflncRNA NEAT1 targeting miR-134 may inhibit the invasion and migration of pituitary tumor cells byinhibiting the activation of the ITGB1/FAK/PI3K pathway.【Key words】lncRNA NEAT1;miR-134;Pituitary tumor;Invasion;MigrationCorresponding author:Zheng Kai,E-mail：ZK1972Z【收稿日期】2022-04-22【基金项目】贵州省高层次创新型人才资助项目（黔科合平台人才20206011）【作者简介】郑锴（1972-），男，医学博士，副主任医师，研究方向：神经创伤与肿瘤，E-mail：ZK1972Z长 链 非 编 码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）参与基因转录激活、调控蛋白功能及转录后调控等多个生物学过程1。lncRNA 核富含转录本 1（lncRNAnuclear-enrichedabundanttranscript1，lncRNA NEAT1）在乳腺癌中上调，可通过调控微小RNA-133b（microRNA-133b，miR-133b）促进肿瘤细胞的侵袭和迁移2，暗示 lncRNA NEAT1 可能与垂体瘤的迁移和侵袭有关。微小 RNA-134（microRNA-134，miR-134）垂体腺瘤组织中的表达下调可能是肿瘤发生且呈侵袭样生长的重要原因之一3。通过 StarBase网站预测得出，miR-134 可能是 lncRNA NEAT1 的靶基因。然而，对于 lncRNA NEAT1 在垂体瘤发生发展中的作用机制研究较少，本研究首次探讨垂体瘤细胞中 lncRNA NEAT1 与 miR-134 的靶向调控关系及机制，为垂体瘤的发病机制与靶向治疗提供理论基础。1材料与方法1.1研究对象垂体瘤细胞系 GH3、MMQ、GT1-1 和 AtT-20 购自深圳OTWO。1.2研究方法 实验研究 543CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 20231.2.1细 胞 培 养 与 分 组垂 体 瘤 细 胞 系（GH3、MMQ、GT1-1 和 AtT-20）RPMI-1640 培养基，传代 3 次取对数期生长细胞用于实验。选取 GH3 细胞接种于6孔板，分为A组和B组，A组分为：Control组（不做任何处理）、si-NC 组（转染 si-NC）、si-lncRNA NEAT1 组（转染 si-lncRNA NEAT1）、si-lncRNA NEAT1+miR-NCinhibitor 组（共 转 染 si-lncRNA NEAT1 和 miR-NCinhibitor）、si-lncRNA NEAT1+miR-134 inhibitor 组（共转染 si-lncRNA NEAT1+miR-134 inhibitor）；B 组分为：Control 组（不做任何处理）、miR-NC mimics 组（转染miR-NC mimics）、miR-134 mimics 组（转 染 miR-134mimics）、miR-134 mimics+vector 组（共转染 miR-134mimics 和 vector）、miR-134 mimics+ITGB1 组（共转染miR-134 mimics和ITGB1）。按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书转染后培养48 h。1.2.2qRT-PCR 检 测 lncRNANEAT1、miR-134 和ITGB1 在 GH3 细胞中表达 使用 TRIzol 法提取 GH3细胞总 RNA，制备 cDNA，以 cDNA 为模板按照 qRT-PCR试剂盒说明书分别检测lncRNA NEAT1、miR-134和ITGB1表达情况，使用2-ct计算以上基因的相对表达 量。引 物 序 列：lncRNA NEAT1 上 游 5-GUCUGUGUGGAAGGAGGAATT-3，下 游 5-UUCCUCCUUCCACACAGACTT-3；miR-134 上 游 5-CCGCCTGTGACTGGTTGAGG-3，下游 5-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3；ITGB1 上 游 5-CCTTGGGATGACTTGATTG-3，下游 5-ACCTTTCGGTCACTTAGGGGG-3；GAPDH 上游 5-CAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3，下游 5-GACTGAGTACCTGAACCGGC-3；U6 上游5-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3，下 游 5-TATGGAACGCTTCAGCAATTTGC-3。1.2.3Transwell 法 检 测 细 胞 侵 袭/迁 移将 GH3、MMQ、GT1-1 和 AtT-20 及转染后 GH3 细胞使用无血清的培养基悬浮（1103个/mL），吸取 200 mL 悬浮液至 Transwell小室上室（含干燥基质胶），下室添加 500mL正常培养基，24 h后使用多聚甲醛固定，结晶紫染色。最后，拍照并统计 5 个不同视野穿过膜的细胞数，以其平均值表示侵袭细胞数量。细胞迁移实验使用未添加基质胶的 Transwell 小室，统计转染后细胞迁移数量，其余方法同上。1.2.4双 荧 光 素 酶 报 告 基 因 实 验 检 测 miR-134 与lncRNA NEAT1、ITGB1 靶向调控关系通过 Starbase（ 站 预 测 miR-134 与 lncRNANEAT1、ITGB1 之间的结合位点。将 lncRNA NEAT1-MT 或 lncRNA NEAT1-MUT 插入荧光素酶报告基因载体中，并与 miR-134 mimics 或 miR-134 NC 共转染GH3细胞，24 h后使用双荧光素酶测定系统进行荧光素 酶 活 性 检 测。以 同 样 的 方 式 检 测 miR-134 与ITGB1的结合。1.2.5Western blot检测 GH3细胞中 ITGB1/FAK/PI3K通路相关蛋白使用RIPA裂解缓冲液收集GH3细胞总蛋白。经 10%SDS-PAGE 分离后转移到 PVDF 膜。使 用 5%BSA 封 闭 2 h，添 加 抗 体（ITGB1、p-FAK、FAK、p-PI3K、PI3K、-actin），4 过夜孵育。添加二抗孵育 2 h，使用 ECL 发光混合液显影。使用 Image J软件分析蛋白印迹的灰度值。1.3统计学分析采用 SPSS 25.0 进行统计分析。实验数据以均值标准差表示，两组间比较通过 t检验，多组间比较采用单因素方差分析和 LSD 检验。P0.05 表明有统计学差异。2结果2.1不同垂体瘤细胞系侵袭情况图 1 结果显示，GH3 细胞的侵袭数量（261.3917.27）个，高于 MMQ（210.3613.59）、GT1-1（184.5312.84）及 AtT-20 细胞（197.3911.87）个，F=34.508，P0.05，故后续选择GH3细胞作为研究对象。2.2miR-134 对 lncRNA NEAT1 调控 GH3 细胞侵袭、迁移影响与 si-NC 组相比，si-lncRNA NEAT1 组 GH3 细胞中 lncRNA NEAT1 的表达降低，miR-134 的表达增加；侵袭、迁移数量减少（P0.05）；与 si-lncRNA NEAT1+miR-NC inhibitor 组相比，si-lncRNA NEAT1+miR-134inhibitor 组 GH3 细胞中 lncRNA NEAT1 的表达增加，miR-134 的表达降低，侵袭、迁移数量明显增多（P图1Transwell检测不同垂体细胞系侵袭情况（0.5%结晶紫染色，深紫色表示细胞核，n=6）Fig.1Transwell detection of the invasion of different pituitary cell lines(0.5%crystal violet staining,dark purple indicated cell nuclei,n=6)544中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期0.05）。见图2，表1。2.3双 荧 光 素 酶 检 测 miR-134 与 lncRNA NEAT1、ITGB1靶向调控关系经 starbase 数 据 库 预 测，miR-134 与 lncRNA图2Transwell检测A组GH3细胞侵袭、迁移情况（0.5%结晶紫染色，深紫色表示细胞核）Fig.2Transwell detection of invasion and migration of GH3 cells in group A(0.5%crystal violet staining，dark purpleindicated cell nucleus)545CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023NEAT1、ITGB1 存在靶向调控位点，见图 3。结果显示，与 miR-NC mimics 组相比，lncRNA NEAT1-WT、ITGB1-WT 均降低 miR-134 mimics 组 GH3 细胞的相对荧光素酶活性（P0.05），见表2。表2双荧光素酶检测miR-134与lncRNA NEAT1、ITGB1靶向关系（xs，n=6）Tab.2The targeting relationship between miR-134 and lncRNA NEAT1 andITGB1 detected by dual-luciferase reporter gene assay(MeanSD,n=6)组别 GroupmiR-NC mimicsmiR-134 mimicstPlncRNA NEAT1-WT1.030.020.320.0438.8880.000lncRNA NEAT1-MUT1.020.011.020.030.0001.000ITGB1-WT1.000.010.410.0528.3430.000ITGB1-MUT1.030.011.040.021.0950.299表1miR-134对lncRNA NEAT1调控GH3细胞侵袭、迁移影响（xs，n=6）Tab.1Effect of miR-134 on the invasion and migration of GH3 cells regulatedby lncRNA NEAT1(MeanSD,n=6)组别 GroupControlsi-NCsi-lncRNA NEAT1si-lncRNA NEAT1+miR-NC inhibitorsi-lncRNA NEAT1+miR-134 inhibitorFPlncRNA NEAT11.000.021.020.010.350.03*0.330.020.570.05#799.0470.000miR-1341.020.021.030.011.870.14*1.950.181.490.13#85.470.000侵袭细胞数量Number of invasive cells/unit262.3419.85269.5922.12124.0314.29*116.8515.48173.0518.55#99.1250.000迁移细胞数量Number of migrating cells/unit305.8725.16310.5622.01168.7517.39*172.5616.28235.4618.29#70.3920.000*P0.05，与 si-NC组比较#P0.05，与 si-lncRNA NEAT1+miR-NC inhibitor组比较Compared with si-NC group,*P0.05;Compared with si-lncRNA NEAT1+miR-NC inhibitor group,#P0.05图3miR-134与lncRNA NEAT1、ITGB1靶向位点预测结果Fig.3Prediction results of miR-134 and lncRNA NEAT1 and ITGB1 targeting sites2.4ITGB1对miR-134调控GH3细胞侵袭、迁移影响与 miR-NC mimics 组 相 比，miR-134 mimics 组GH3 细胞中 miR-134 表达增高，ITGB1 表达降低，侵袭、迁移细胞数量减少（P0.05）；与 miR-134 mimics+vector 组相比，miR-134 mimics+ITGB1 组细胞中 miR-134 表达降低，ITGB1 表达增高，侵袭、迁移细胞数量增多（P0.05），见图4、表3。2.5ITGB1 对 miR-134 调控 GH3 细胞中 ITGB1/FAK/PI3K通路相关蛋白表达影响与 miR-NC mimics 组 相 比，miR-134 mimics 组GH3 细胞中 ITGB1 表达水平、p-FAK/FAK 及 p-PI3K/PI3K 比值降低（P0.05）；与 miR-134 mimics+vector 组相比，miR-134 mimics+ITGB1 组 GH3 细胞中 ITGB1表达水平、p-FAK/FAK 及 p-PI3K/PI3K 比值增高（P0.05），见图5、表4。3讨论垂体瘤的临床表现主要有头痛、视力减退、视野缺损和激素分泌异常等4。据报道，多数垂体瘤恶性程度较低，但有部分垂体瘤为侵袭性瘤，治疗难度大，术后复发率高5,6。因此，寻找在肿瘤生长、侵袭等恶性生物学行为中具有重要作用的关键分子，对侵袭性垂体瘤的治疗具有重要意义。本研究组前期实验发现 GH3 细 胞 的 侵 袭 性 强 于 其 他 垂 体 瘤 细 胞 系（MMQ、GT1-1 和 AtT-20），故本次研究针对 GH3 细胞侵袭、迁移的生物学行为展开分析。既往研究发现，lncRNA 可通过参与多个生物学过程在肿瘤细胞中发挥重要作用7。lncRNA NEAT1在肝癌组织和细胞中上调，下调其表达可促进肝癌细 546中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期图4Transwell检测B组GH3细胞侵袭、迁移情况（0.5%结晶紫染色,深紫色表示细胞核）Fig.4Transwell detection of invasion and migration of GH3 cells in group B(0.5%crystal violet staining,dark purple indicated cell nucleus)胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖和侵袭8；lncRNA NEAT1在人脑胶质瘤组织表达水平明显增高，与胶质瘤患者预后显著相关9。表明 lncRNA NEAT1可能作为癌基因参与肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移等生物学过程，有必要对其在垂体瘤中的功能进行研究。本研究显示，敲低 lncRNA NEAT1 表达可抑制 GH3 细胞侵袭、迁 547CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023表3ITGB1对miR-134调控GH3细胞侵袭、迁移影响（个，xs，n=6）Tab.3Effect of ITGB1 on the invasion and migration of GH3 cells regulatedby miR-134(MeanSD,n=6)组别 GroupControlmiR-NC mimicsmiR-134 mimicsmiR-134 mimics+vectormiR-134 mimics+ITGB1FPmiR-1341.030.041.010.012.180.15*2.230.171.670.14#139.7140.000ITGB1 mRNA1.000.041.020.030.410.06*0.450.050.680.08#169.3400.000侵袭细胞数量Number of invasive cells/unit266.2931.04253.2620.18125.3614.39*119.8513.14159.8717.36#72.0110.000迁移细胞数量Number of migrating cells/unit315.2426.32318.4925.34183.2820.37*175.3219.87245.6228.55#48.0600.000*P0.05，与 miR-NC mimics组比较#P0.05，与 miR-134 mimics+vector组比较Compared with the miR-NC mimics group,*P0.05;Compared with the miR-134 mimics+vector group,#P0.05移，提示 lncRNA NEAT1 在垂体瘤侵袭、迁移中发挥作用；生物信息学分析发现，lncRNA NEAT1 与 miR-134 存在相互作用位点。Wang 等10研究表明 lncRNANEAT1 可通过 miR-144-3p 调控靶基因的表达促进子宫内膜癌增殖、侵袭和迁移。故推测 miR-134 作为lncRNA NEAT1 的靶基因在垂体瘤侵袭、迁移中发挥作用。本研究通过转染 miR-134 上调其表达，显示GH3 细胞侵袭、迁移受到抑制，提示 miR-134 可能为垂体瘤的抑癌基因。另外，经验证，lncRNA NEAT1可靶向结合 miR-134；抑制 miR-134 可部分逆转敲低lncRNA NEAT1 表达对 GH3 细胞侵袭、迁移的抑制作用，表明 lncRNA NEAT1 可通过调控 miR-134 参与垂体瘤细胞侵袭、迁移。但 lncRNA NEAT1 通过 miR-134影响垂体瘤细胞侵袭、迁移的过程还未可知。以往研究报道，miRNA 可能通过调控靶基因在癌症中发挥作用11；本研究证实，ITGB1是miR-134靶标基因。ITGB1是细胞中主要表达的整合素蛋白，对肿瘤发展至关重要12；ITGB1是磷酸化FAK的关键激活剂，抑制 ITGB1/FAK 通路或 FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路激活可减少胃癌细胞侵袭、迁移13,14。本研究 发 现，上 调 miR-134 表 达 可 抑 制 ITGB1、磷 酸 化FAK和磷酸化PI3K，说明上调miR-134表达可能抑制ITGB1/FAK/PI3K 信号通路的激活。进一步研究显示，上调 ITGB1 的表达可部分逆转上调 miR-134 表达对 GH3细胞侵袭、迁移的抑制作用。以上表明，上调miR-134 可通过抑制 ITGB1/FAK/PI3K 信号通路抑制垂体瘤细胞侵袭、迁移。综上所述，本研究初次证明敲低 lncRNA NEAT1可通过靶向上调 miR-134 抑制垂体瘤细胞侵袭、迁移，此过程可能是抑制 ITGB1/FAK/PI3K 信号通路实现。本研究可为垂体瘤的靶向治疗提供帮助。但本研究存在一定的不足，仅使用一种垂体瘤细胞系GH3探究lncRNA NEAT1与miR-134的作用以及对ITGB1/FAK/PI3K 的初步调控，未在其他垂体瘤细胞系或动物模型中进行探究；此外，miR-134 不能完全逆转图 5Western blot 检测 B 组 GH3 细胞中 ITGB1、p-FAK、FAK、p-PI3K与PI3K蛋白表达Fig.5Western blot detection of ITGB1,p-FAK,FAK,p-PI3K and PI3K in GH3 cells in group B表 4GH3 细胞中 ITGB1、p-FAK/FAK 与 p-PI3K/PI3K相对表达量（xs，n=6）Tab.4Relative expression levels of ITGB1,p-FAK/FAKandp-PI3K/PI3KinGH3cells(MeanSD,n=6)组别 GroupControlmiR-NC mimicsmiR-134 mimicsmiR-134 mimics+vectormiR-134 mimics+ITGB1FPITGB11.540.151.480.160.320.05*0.360.040.720.07#184.5400.000p-FAK/FAK0.790.060.760.070.210.03*0.240.050.590.05#161.3960.000p-PI3K/PI3K0.890.080.860.070.320.05*0.380.040.660.08#96.2200.000*P0.05，与 miR-NC mimics 组比较#P0.05，与 miR-134 mimics+vector组比较Compared with the miR-NC mimics group,*P0.05;Compared withthe miR-134 mimics+vector group,#P0.05 548中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期lncRNA NEAT1 的 作 用，说 明 miR-134 并 非 lncRNANEAT1 的唯一靶标。后续将进行更深入的探究，期为了解lncRNA NEAT1功能提供更全面的参考。【参考文献】1 Wang L,Cho KB,Li Y,et al.Long Noncoding RNA(lncRNA)-mediatedcompetingendogenousRNAnetworksprovidenovelpotential biomarkers and therapeutic targets for colorectal cancerJ.IntJ Mol Sci,2019,20(22):5758-5764.DOI:10.3390/ijms20225758.2 Li X,Deng S,Pang X,et al.lncRNA NEAT1 silenced miR-133bpromotes migration and invasion of breast cancer cellsJ.Int J MolSci,2019,20(15):3616-3621.DOI:10.3390/ijms20153616.3 庞其军,赵颖,郗艳国,等.miR-134在人垂体腺瘤组织中的表达及其意义J.现代生物医学进展,2014,14(17):3328-3333.DOI:10.13241/ki.pmb.2014.17.034.4 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