C9orf72蛋白介导的自噬在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用.pdf
《C9orf72蛋白介导的自噬在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《C9orf72蛋白介导的自噬在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用.pdf(5页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、中国科技期刊数据库 医药 68 C9orf72 蛋白介导的自噬在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用 李程凯1 马宇洁1 池思浛1 张敬各2(通讯作者)张 敏2 1.河北医科大学麻醉系,河北 石家庄 050017 2.河北医科大学病理生理学教研室,河北 石家庄 050017 摘要:摘要:缺血性卒中是一种高发病率的多因素疾病,致死率和致残率较高。脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIP)可以通过激活内源性保护效应来保护神经元免受后续的严重缺血性损伤,建立脑缺血耐受。自噬是衰老损伤细胞自我降解和回收细胞内成分的过程。适度激活自噬有利于促进细胞生存和维持
2、细胞稳态,适当地激活溶酶体-自噬功能对建立脑缺血耐受至关重要,适度上调自噬可以改善缺血性损伤,提示自噬-溶酶体系统是缺血性脑卒中的潜在治疗靶点。C9orf72 是一种与膜转运和细胞自噬有关的基因,研究揭示,C9orf72 蛋白可作为 Rab1a 效应子与起始复合物 ULK1 相互作用参与自噬起始的调节,或与 Smith-Magenis 综合征染色体区域 8(SMCR8)和含有 WD 重复序列的蛋白 41(WDR41)构成一种蛋白复合体调节自噬。本文探讨了 C9orf72 蛋白可能通过影响自噬参与脑缺血耐受的建立和脑缺血损伤的修复。关键词:关键词:C9orf72 蛋白;自噬;脑缺血预处理;脑缺血
3、耐受 中图分类号:中图分类号:R74 0 引言 中风仍然是世界范围内死亡和致残的主要原因,很少有临床批准的治疗方法可用于最常见的缺血性中风。缺血预处理被认为是缺血性脑卒中的一种有效的预防性治疗方法。许多基础和临床研究已经证实,缺血预处理可以通过启动内源性保护机制产生显著的神经保护作用,有效减少脑缺血再灌注损伤1-3。在许多缺血预处理方法中,远端缺血预处理被认为是一种很有前景的方法,因为它使用了一种简单、非侵入性手术,可以用于临床实践。近年来的大量临床试验表明,远端缺血预处理可以有效诱导脑缺血耐受,从而减少缺血再灌注损伤,改善患者预后。然而,其根本机制尚未得到充分理解。了解远端缺血预处理诱导的神
4、经保护机制将有助于最大限度地减少缺血性脑损伤。1 实验分组 共有 50 只清洁级健康雄性 Wistar 大鼠,810周龄,体重 280300 g,由河北医科大学实验动物中心提供。电凝法永久凝固和关闭双侧椎动脉。恢复 2 d后,随机分为 4 组:(1)Sham 组(n=10):暴露大鼠双侧颈总动脉,不阻断血流。(2)CIP 组(n=10):钳取大鼠双侧颈总动脉 3 min,恢复再灌注。(3)缺血打击组(II)(n=10):夹闭双侧颈总动脉 8 min 后恢复再灌注。(4)CIP+缺血打击组(II)(n=10):夹闭双侧颈总动脉 3 min 作为 CIP,再灌 2d 后,再次夹闭双侧颈总动脉 8
5、min 作为损伤性缺血,然后恢复再灌注。每组或亚组取 3 只大鼠进行硫氨酸染色,观察末次手术后 7 d 延迟性神经元死亡(DND)情况。为了观察 p38 C9orf72 的表达,在末次给药后 12 h,取 4 只大鼠进行免疫组化染色,另外 4 只大鼠进行 Western blot 分析。2 实验方法 2.1 缺血预处理实验方案 用麻醉大鼠,然后将其固定在仰卧位。用 1%普鲁卡因溶液局部麻醉后,沿血管路径在股三角上切开。分离双侧股动脉,用无创小动脉夹夹持,夹持10分钟,再灌注 10 分钟,重复 3 个周期。术后局部应用真菌毒素预防感染并缝合伤口。2.2 全脑缺血模型 采用经典的 Pulsinel
6、li 四血管闭塞法。首先,采用 10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位固定。在颈背侧枕骨后方,直接在第一颈椎上做一个皮肤切口(约 1.5 cm)。中间分离棘旁肌群,充分暴露第中国科技期刊数据库 医药 69 一颈椎双侧翼孔。将预热好的电针插入鼻翼孔,电灼双侧椎动脉。2 天后,麻醉大鼠,取仰卧位固定。分离双侧颈总动脉,夹持 8 min,诱导全脑缺血。选择光反射和翻正反射消失,恢复后无血尿和瘫痪的患者进行进一步实验。整个手术过程中,大鼠体温维持在 37左右。Sham 组除不夹持双侧颈总动脉外,其余操作同。2.3 硫蛋白染色 末次手术后第 7 d 给予 10%水合氯醛(350 mg/
7、kg,腹腔注射)麻醉。生理盐水(150 mL,04)和 4%多聚甲醛(200 mL,04)经升主动脉快速序贯灌注。然后,头颅切除脑,冠状面切除包括视交叉后双侧海马在内的 4 mm 脑切面,用 4%多聚甲醛固定。将脑组织切成 56 m 厚的切片进行硫蛋白染色。光镜下以组织学分级(HG)和神经元密度(ND)进行神经病理学评价。根据 Kitagawa 和 Kato 的分类方法,将 HG 分为 4 个等级:0,无神经元死亡;,分散的单个神经元死亡;,大量神经元死亡;,几乎全部神经元死亡。然后,通过计数细胞膜完整、细胞核完整、核仁清晰的锥体神经元存活数来测定海马 CA1 区的 ND。在每个截面测量三个不
8、同的光场,并计算平均值,以确定 DND 的程度。2.4 免疫组织化学染色 在最后一次手术后 12 小时,用硫蛋白染色法去除脑组织,并以 5mm 厚的厚度进行冠状切片。二甲苯脱蜡和梯度乙醇水合后,将切片在室温下在 3%H,0 中孵育 15 分钟,以消除内源性过氧化物。然后,将切片在抗 p-p38 MAPK(Abcam,目录:ab4822)或 p-ERK(Afinity,目录:AF1015)的抗体中在 4C 下用 10%正常山羊血清孵育 1 小时后过夜孵育。用 PBS 洗涤 3 次后,将二次抗体加入切片中,并在 37下孵育 45 分钟。用 HRP 偶联的链霉亲和素作为第三抗体。最后,用 DAB 底
9、物试剂盒进行过氧化物酶活性的测定。为了确保反应条件的一致性,对用于比较的切片进行相同的免疫组织化学运行。使用磷酸缓冲盐水代替一级抗体作为阴性对照。每只大鼠随机抽取 5 个切片进行定量,使用JEDA801D 图像分析软件(捷达科技有限公司)测量海马 CAl 亚区免疫反应细胞的积分吸光度和总面积。只有轮廓被免疫颗粒清楚地定义的细胞才被算作免疫反应细胞。2.5 蛋白质印迹 末次手术后 12 h,处死大鼠,分离海马 CAl 区,用裂解缓冲液匀浆。离心后,用 BCA 蛋白检测试剂盒测定上清蛋白浓度。将样品与上样缓冲液混合,在95-100下加热 5 分钟,然后上样。每条车道装 100ug蛋白质样品。蛋白质
10、经 12%sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到 PVDF 膜上。在含 5%脱脂奶粉的 TTBS 中阻断非特异性抗原结合 60 分钟后,用与免疫组化染色相同的一抗(p-p38 MAPK和p-ERK抗体)在4下孵育过夜;b-肌动蛋白抗体,Proteintech,Cat。:66009-1-lg)和二抗(KPL,Cat;电话:074-1806)37c。用TTBS洗涤后,用 ECL 显示标记的结合物。为了分析 p-p38 MAPK 和p-ERK 的相对蛋白水平,采用 Gel-Pro 分析仪图像分析系统检测积分吸光度。用目标带与 b-肌动蛋白吸光度的积分比值进行统计分析。3 统计学分析 数据以均数+sem
11、表示。神经学评分以中位数和四分位数范围表示,并使用 Kruskal-allis H 检验进行分析。当 Kruskal-Wallis H 检验显示显著性差异时,采用 Mann-Whitney U 检验并进行 Bonferroni 校正。所有其他数据采用单因素方差分析,然后采用最小显著差异(LSD)或 Bonferroni 方法来评估组间差异,如果方差是同质性的,则使用 Games-Howell 检验。P 0.05 为差异有统计学意义。采用 SPSS 23.0 统计软件(SPSS,IBM,Chicago,IL,USA)进行统计分析。4 结果 4.1 CIP 可建立脑缺血耐受,减轻神经损伤 采用永久
12、凝闭椎动脉的 Wistar 大鼠,具体分组如下(n=10):Sham 组:只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;CIP 组:夹闭双侧颈总动脉 3 min 后恢复再灌注;缺血打击组(II):夹闭双侧颈总动脉 8 min 后恢复再灌注;CIP+缺血打击组(II):夹闭双侧颈总动脉 3 min 作为 CIP,再灌 2d 后,再次夹闭双侧颈总动脉 8 min 作为损伤性缺血,然后恢复再灌注。硫堇染色结果显示,Sham 组、CIP 组和 CIP+II 组海马 CA1 区神经元完整,排列整齐,细胞核完整,核仁清晰;而缺血打击组的神经元形态明显异常,细胞排列紊乱,胞核不完整,核仁无法分辨。说明 CIP 可以诱导脑
13、缺血耐受,减轻缺血打击造成的影响。如图 1。中国科技期刊数据库 医药 70 图 1 硫堇染色下的神经元形态 4.2 CIP 激活大鼠海马 CA1 区的神经元自噬 上述各组于 sham 手术或末次缺血后 48 h 时间点取海马脑组织。通过透射电镜观察大鼠海马 CA1 区神经元中的自噬体变化,发现 CIP 后 48 小时神经元内即出现自噬小体(箭头表示自噬小体,图片中左下角的放大图显示了来自红星区域的放大的自噬小体)。此外,我们还对大鼠海马区的自噬小体做了定量分析,检查了每只大鼠的 10 个视野(n=5),结果显示,与 Sham组相比,缺血预处理后,大鼠海马区自噬小体的数量明显增多(P 0.05)
14、。此结果说明缺血预处理能够引发大鼠海马 CA1 区神经元自噬的激活。见图 2。图 2 透射电镜观察大鼠海马 CA1 区神经元中自噬体的变化 Western blot 检测 CIP 对大鼠海马 CA1 区自噬相关蛋白 Beclin 1 和 LC3-II/LC3-I 表达量的影响;免疫荧光检测 CIP 对神经元中自噬相关蛋白 LC3 表达的影响。发现 CIP 时,Beclin 1 和 LC3-II/LC3-I 的表达会明显升高,差异有统计学意义(P 0.05)。见图 3、4。图 3 Western blot 检测自噬相关蛋白 图 4 免疫荧光检测自噬相关蛋白 4.3 CIP 对大鼠海马 CA1 区
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- C9orf72 蛋白 缺血 预处理 诱导 耐受 中的 作用
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。