BALB_c突变卷毛小鼠基因组学测序差异的分析.pdf

第 40 卷第 5 期2023 年 10 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.5October 2023论著收稿日期:2023-06-07基金项目:军队实验动物专项基金面上项目(SYDW2016005,SYDW202005)作者简介:共同第一作者汤紫荣(1980),女,副主任技师,研究方向:疾病统计与遗传分析.E-mail:110975300 李晓娟(1980),女,主管技师,研究方向:主要从事实验动物模型研究.E-mail:sxlily55 通信作者:李瑞生(1969),男,博士,副研究员,主要从事实验动物模型研究.E-mail:314329216 BALB/c 突变卷毛小鼠基因组学测序差异的分析汤紫荣1 李晓娟2 姜棋予2 李兴杰2 孙慧伟2 李瑞生2(1.中国人民解放军总医院第五医学中心住院与病案管理科,北京100039)(2.中国人民解放军总医院第五医学中心感染病医学部研究所,北京100039)摘要:目的利用全基因组测序方法比较 BALB/c 突变卷毛鼠与正常 BALB/c 小鼠基因组之间的差异。方法采用 Illumina PE 150 测序平台对 BALB/c 突变卷毛鼠与正常 BALB/c 小鼠进行全基因组测序并对遗传变异信息(SNP、INDEL、SV 和 CNV)进行对比分析。结果正常小鼠与卷毛小鼠产生的 Raw Data 分别为 122.85 Gb 和118.04 Gb,过滤后的 Clean Data 分别为 119.82 Gb 和 112.18 Gb,表明测序质量合格。正常小鼠与卷毛小鼠的 GC含量分别为 40.63%和 40.48%,说明 GC 分布正常。卷毛小鼠的杂合分型 SNPs 总数显著高于正常小鼠,同时正常小鼠与卷毛小鼠之间的累计 SNPs 深度分布也存在显著的差异。卷毛小鼠与正常小鼠插入缺失(Indels)以及累计Indels 深度分布均存在差异。卷毛小鼠与正常小鼠的 SV 类型中大片段的插入卷毛小鼠大于正常小鼠,而其他类型则小于正常小鼠。而拷贝数变异(CNVs)结果显示正常小鼠和卷毛小鼠的拷贝数增加的个数分别为 1 270 和 967个;而拷贝数减少的个数分别为 5 027 和 3 505 个。结论本研究发现正常小鼠与突变卷毛鼠的基因组存在一定的差异。关键词:卷毛鼠;全基因组测序;遗传变异信息中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)05-0033-05DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.05.006Analysis of Genomic Sequencing Differences in BALB/c Mutant Curly Mice TANG Zirong1,LI Xiaojuan2,JIANG Qiyu2,LI Xingjie2,SUN Huiwei2,LI Ruisheng2(1.Department of Inpatient and Medical Record Management,the Fifth Medical Center of the PLA General Hospital,Beijing 100039,China)(2.Department of Infectious Disease Medicine,the Fifth Medical Center of the PLA General Hospital,Beijing 100039,China)Abstract:ObjectiveWhole genome sequencing was used to compare the genomic differences between BALB/c mutant curly mice and normal BALB/c mice.MethodThe whole genome of BALB/c mutant curly mice and normal BALB/c mice were sequenced by Illumina PE 150 sequencing platform,and the genetic variation information(SNP,INDEL,SV and CNV)were compared and analyzed.ResultThe raw data produced by normal mice and curly mice were 122.85 Gb and 118.04 Gb respectively,the filtered clean data were 119.82 Gb and 112.18 Gb respectively,and the GC contents were 40.63%and 40.48%respectively.The sequencing quality was qualified,the GC distribution was normal,and the library was established and sequenced successfully.The total number of heterozygous SNPs in curly mice was significantly higher than that in normal mice,and there were significant differences in the depth distribution of cumulative SNPs between normal mice and curly mice.There were differences in indels 实验动物科学40 卷and cumulative indels depth distribution between curly mice and normal mice.The insertion of large fragments in SV types of curly mice and normal mice was larger than that of normal mice,while other types were smaller than that of normal mice.The copy number variation(CNVs)result showed that the number of copies increased in abnormal mice and curly mice were 1 270 and 967,respectively;the number of copies decreased by 5 027 and 3 505 respectively.ConclusionThis study found that there were some differences between the genomes of normal mice and mutant curly haired mice.Key words:curly hair mice;whole genome sequencing;genetic variation information全基因组测序是指应用新型测序仪器测量不同机体基因组间的差异,并通过生物信息手段对与性状关联的遗传变异信息及基因组结构进行分析与注释1。测序技术已经由基于双脱氧末端终止法的 Sanger 测序技术2发展到现在的第二代、第三代测序技术3,实现了从低读长到超高读长、从光学检测到电子传导检测的双重跨越测序技术,在动物基因组测序发展中起了非常重要的作用4。BALB/c突变卷毛鼠是本实验室发现的突变小鼠,经近交培育已成为较为成熟、遗传稳定的近交系突变卷毛小鼠品系5。前期对其外观特征以及血液学指标进行了基础性探讨研究6-7,尤其应用微卫星位点标记对 BALB/c 突变卷毛鼠进行检测分析,发现该小鼠存在较高的突变率,且与无毛小鼠突变是两个完全不同的突变系8。因此本实验利用 Illumina PE 150 对 BALB/c 突变卷毛鼠与 BALB/c 小鼠进行测序,并进行生物信息学分析,以期全面了解突变鼠与BALB/c 小鼠之间的基因组差异性,为今后更好地开发和利用该鼠作为优良的动物模型提供可靠的生物学信息基础。1材料和方法1.1实验动物正常 BALB/c 小鼠和 BALB/c 突变卷毛鼠各 1只,SPF 级,雌性,6 周龄。正常 BALB/c 小鼠来自突变群体中的正常小鼠,BALB/c 卷毛鼠来自于本实验室近 交 培 育,生 产 许 可 证 号【SCXK(军)2012-0004】。动物饲养在中国人民解放军总医院第五医学中心动物实验中心,使用许可证号【SYXK(军)2017-0016】。本实验通过了动物伦理委员会审查,伦理审批号:IACUC-2017-006。1.2实验方法 1.2.1动物组织采集和 DNA 提取:从 BALB/c 小鼠和 BALB/c 突变卷毛鼠后肢分别取一小块肌肉,立即用 PBS 或 0.9%氯化钠溶液漂洗,去除血渍,并剔除结缔组织和脂肪组织,吸干水分;将肌肉块修剪成长宽高均0.5 cm 的小块(组织块越小,保存效果越好);将处理好的组织样品置于 2 mL 的旋盖冻存管中,立即液氮速冻,送去北京美吉桑格生物医药科技有限公司。而后对 2 个样本进行基因组 DNA的提取、质检和定量检测,以及后续的建库测序。1.2.2文库构建及测序:2 个样品分别构建 1 个Illumina PE 测序文库,共计 2 个 Illumina 测序文库;插入片段 400 bp。Illumina PE 150 每个样品提供 84 G clean data,Q30 值80%。1.2.3信息分析1.2.3.1原始数据质控和过滤:测序结果得出的原始测序序列(Raw Reads)由于含有带接头的、低质量的 Reads,因此为了提高信息分析的质量,必须对Raw Reads 过滤,得到 Clean Reads,后续分析都在Clean Reads 的 基 础 上 进 行。对 下 机 得 到 的 Raw Data 进行质控得到 Clean Data。1.2.3.2数据比对:进行单碱基突变(SNP)和 插入缺失(Indel)的检测及注释;Indel 是指基因组中小片段的插入和缺失序列。利用 SAMTOOLs 检测长度小于 50 bp 的小片段插入与缺失(Indel)。对结构变异(SV)和拷贝数变异(CNV)进行检测和注释。2结果2.1基因组基本信息对比结果本次测序正常小鼠与卷毛小鼠产生的 Raw Data分别为 122.85 Gb 和 118.04 Gb,过滤后的 Clean Data 分别为 119.82 Gb 和 112.18 Gb,GC 含量分别为 40.63%和 40.48%,表明测序质量合格。GC 分布也正常,说明建库测序成功(表 1)。正常小鼠与卷毛小鼠的基因组覆盖深度统计(表 2)。2.2遗传变异检测对比分析卷毛小鼠的杂合分型 SNPs 总数显著高于正常43第 5 期汤紫荣等:BALB/c 突变卷毛小鼠基因组学测序差异的分析 小鼠,而其他数值却没有显著差异(表 3),同时正常小鼠与卷毛小鼠之间的累计 SNPs 深度分布也存在显著的差异(图 1)。卷毛小鼠与正常小鼠插入缺失(Indels)以及累计 Indels 深度分布均存在差异(图2,3)。卷毛小鼠与正常小鼠的 SV 类型中大片段的插入卷毛小鼠大于正常小鼠,而其他类型则小于正常小鼠(表 4)。而拷贝数变异(CNVs)结果显示,正常小鼠和卷毛小 鼠的拷贝数 增 加 的 个 数 分 别 为1 270 和 967 个;而拷贝数减少的个数分别为 5 027和 3 505 个。表 1测序质量统计表Table 1Sequencing quality statistics样品编号原始测序总碱基数(Gb)高质量测序总碱基数(Gb)高质量的 Reads 数(M reads)高质量测序比例(%)质量30 碱基百分比(%)GC 含量(%)正常小鼠122.85119.82407.6797.5395.5240.63卷毛小鼠118.04112.18381.5695.0495.4740.48表 2样品覆盖深度和覆盖度统计Table 2Sample coverage depth and coverage statistics样品编号覆盖总碱基数(bp)覆盖深度为 1X 碱基比例(%)覆盖深度为 5X 碱基比例(%)平均覆盖深度正常小鼠2 624 360 003939232.54卷毛小鼠2 629 168 964939330.43表 3SNP 数据统计表(个)Table 3SNP data statistics(个)样品编号SNP 数量转换的 SNP数量颠换的 SNP数量转换与颠换的比值(Ts/Tv)杂合分型 SNP 总数纯合分型SNP 总数正常小鼠3 933 7462 572 8531 359 6641.89237 5113 696 235卷毛小鼠3 707 2202 427 2331 278 9411.901 012 7982 694 422注:红线为卷毛小鼠;蓝线为正常小鼠。Note:The red line is curly mice;The blue line is normal mice.图 1累积 SNP 深度分布Fig.1Cumulative SNP depth distribution3讨论全基因组重测序的特点是具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化,指在参考已知基因组序列的物种信息基础上,对不同个体整个基因组进行测序,再通过生物信息学分析及在个体或群体水平进行序列差异性分析9。那么在测序过程中可以检测到大量与性状关联的遗传变异信息(包括 SNP、Indel、SV 和 CNV 甚至新基因等)。研究人员利用全基因 组 测 序 方 法 比 较 近 交 系 小 鼠 C57BL/10 和C57BL/6 的基因组差异,筛选出 4 个小鼠免疫应答差异基因10。研究人员完成了美洲大蠊的全基因组测序,也是大蠊属 Periplaneta 昆虫的第一个基因组,为美洲大蠊遗传进化分析和药用基因资源挖掘打下了重要基础11。但目前对突变小鼠与正常小鼠之间进行对比分析的基因组测序报道甚少。因此本实验对实验室单独发现的 BALB/c 突变卷毛鼠与群体中未发生突变的正常 BALB/c 小鼠进行测序,并进行了生物信息学分析,结果显示:正常小鼠与卷毛小鼠产生的 Raw Data 分别为 122.85 Gb和 118.04 Gb,过 滤 后 的 Clean Data 分 别 为119.82 Gb 和 112.18 Gb,GC 含量分别为 40.63%和40.48%,GC 分布正常,测序建库成功。自人类基因组计划完成以来,获得高质量的序列图谱成为了不同物种进行功能基因研究的基础12。而遗传变异统计结果显示:卷毛小鼠的杂合分型 SNPs 总数显著高于正常小鼠,同时正常小鼠与卷毛小鼠之间累计 SNPs 深度分布也存在显著的差异。卷毛小鼠与53 实验动物科学40 卷注:A.卷毛小鼠;B.正常小鼠。Note:A.Curly mouse;B.Normal mouse.图 2插入缺失(Indel)分布情况Fig.2Distribution of insertion and deletion表 4SV 预测结果统计表Table 4Statistical table of SV prediction results样本大片段缺失大片段的插入DNA 片段的倒位染色体内部的易位染色体之间的易位正常小鼠7 01725483619729卷毛小鼠5 21730315486560注:红线为卷毛小鼠;蓝线为正常小鼠。Note.The red line is curly mice;The blue line is normal mice.图 3累积 Indel 深度分布Fig.3Cumulative Indel depth distribution正常小鼠插入缺失(Indels)以及累计 Indels 深度分布均存在差异。卷毛小鼠与正常小鼠的 SV 类型中大片段的插入卷毛小鼠大于正常小鼠,而其他类型则小于正常小鼠。而拷贝数变异(CNVs)结果显示,正常小鼠和卷毛小鼠的拷贝数增加的个数分别为1 270 和 967 个;而拷贝数减少的个数分别为 5 027和 3 505 个,卷毛小鼠均小于正常小鼠。遗传变异检测分析结果显示 SNPs、Indels、SV 和 CNVs 在两种小鼠之间均存在差异,不仅证明了两种小鼠存在遗传差异,且也极大的丰富了遗传资源多样性的研究内容13。那么在全基因组水平上,利用 SNPs 等分子遗传标记存在的差异,也能够较全面解析物种受到的自然选择和人工选择导致的遗传变化14。本实验对两种小鼠进行了初步的基因差异对比,但又考虑到即使正常繁育 SNP 等位点也会发生变异,因此下一步我们将借助一些基因分析软件15对新发现的遗传变异差异进行详细的注释,对差异表达基因的功能进行分类,期待能够挖掘这些变异对某些分子和细胞事件有所指示。综上所述,本研究对 BALB/c 突变卷毛鼠与同种群中正常 BALB/c 小鼠进行了全基因组测序,并且发现二者之间存在遗传变异差异,进一步验证了前期实验中两种小鼠各项指标的差异存在。众所周知,全基因组测序可以全面、快速、准确地解析不同品种的分子遗传特征,为品种的不断选育提高及开发利用奠定坚实的基础16。我们将对其基因的变异情况进行深入分析,以期更好地开发和应用该突变小鼠。参 考 文 献 1 李晓明,杨莹,彭辉,等.全基因组测序在医学应用进展J.基因组学与应用生物学,2015,34(5):1071-1075.2 SANGER F,NICKLEN S,COULSON A R.DNA sequencing with chain terminating inhibitor J.Proc Natl Acad Sci,1977,74(12):5463-5467.3 ARDIS E R.Next-generation DNA sequencing methods J.63第 5 期汤紫荣等:BALB/c 突变卷毛小鼠基因组学测序差异的分析 Annu Rev Genomics Hum Genet,2008,9(1):387.4 GOODWIN S,MCPHERSON J D,MCCOMBIE W R.Coming of age:ten years of next-generation sequencing technologies J.Nat Rev Genet,2016,17(6):333-351.5 李晓娟,张巧云,李蓓,等.BALB/c 突变卷毛小鼠部分生长发育指标 初 探 J.中 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