CircBACH1调节miR-140-5p_MDM2轴对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响 (1).pdf
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1、Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.11CircBACH1调节miR-140-5p/MDM2轴对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响刘荟敏,许旋旋,王远丽,熊涛,唐元艳摘要:目的探讨CircBACH1对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响以及在此过程中对miR-140-5p/MDM2轴的调节机制。方法收集MM组和正常对照组骨髓浆细胞,将人MM细胞系U266细胞分为未转染(Control)组、si-NC 组、si1-CircBACH1 组、si2-CircBACH1 组、si-CircBACH1+anti-miR-NC 组、si-C
2、ircBACH1+anti-miR-140-5p组。实时荧光定量PCR检测细胞中CircBACH1、miR-140-5p、鼠双微体2(MDM2)mRNA的表达;CCK-8法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡及对硼替佐米的敏感性;Western blot检测细胞中B细胞淋巴因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解的胱天蛋白酶(cleaved caspase)-3蛋白的表达;双萤光素酶报告基因实验验证CircBACH1、miR-140-5p、MDM2三者的靶向关系。结果与正常对照组相比,MM组的骨髓浆细胞及U266细胞中 CircBACH1、MDM2 mRNA 表达升高,m
3、iR-140-5p 表达降低(P0.05);与 Control 组和 si-NC 组相比,si-CircBACH1组细胞中CircBACH1、MDM2的mRNA表达、细胞增殖活性、Bcl-2蛋白表达均降低,miR-140-5p的表达、细胞凋亡率、化疗敏感性及cleaved caspase-3、Bax表达均升高(P0.05);而回补实验中,si-CircBACH1对MM细胞的影响被anti-miR-140-5p逆转,且MDM2的表达也升高(P0.05)。双萤光素酶基因报告实验验证了CircBACH1、MDM2均与miR-140-5p存在靶向关系。结论敲低CircBACH1能够上调miR-140-
4、5p表达,下调MDM2的表达,抑制MM细胞的增殖,促进MM细胞凋亡,提高化疗敏感性。关键词:多发性骨髓瘤;细胞增殖;细胞凋亡;CircBACH1;miR-140-5p;MDM2轴;化疗敏感性中图分类号:R733.3文献标志码:ADOI:10.11958/20230126Impacts of CircBACH1 on proliferation,apoptosis and chemosensitivity of multiple myelomacells by regulating miR-140-5p/MDM2 axisLIU Huimin,XU Xuanxuan,WANG Yuanli,XI
5、ONG Tao,TANG YuanyanDepartment of Hematology,Jingzhou Central Hospital,Jingzhou 434020,ChinaCorresponding AuthorE-mail:Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of CircBACH1 on proliferation,apoptosis and chemotherapy sensitivityof multiple myeloma(MM)cells and the regulatory mechanism on miR-140-
6、5p/MDM2 axis during this process.MethodsBone marrow plasma cells were collected from the MM patient group and normal control group.Human MM cell line U266cells were divided into the untransfected group,the si-NC group,the si1-CircBACH1 group,the si2-CircBACH1 group,thesi-CircBACH1+anti-miR-NC group
7、and the si-CircBACH1+anti-miR-140-5p group.The mRNA expressions ofCircBACH1,miR-140-5p and mouse double microsoma 2(MDM2)were detected by real-time quantitative PCR.Cellproliferation activity was detected by CCK-8 assay.Flow cytometry was used to detect apoptosis and sensitivity to基金项目:湖北省卫生计生委科研项目(
8、WJ2019F125)作者单位:荆州市中心医院血液内科(邮编434020)作者简介:刘荟敏(1984),女,主治医师,主要从事白血病和骨髓造血干细胞方面研究。E-mail:通信作者E-mail:MaterBiolAppl,2019,104:109909.doi:10.1016/j.msec.2019.109909.16 JUNEJA T,PANDYA M D,SHAH S.Molecular Landscape andcomputational screening of the natural inhibitors against HPV16 E6oncoproteinJ.Asian Pac
9、J Cancer Prev,2021,22(8):2461-2469.doi:10.31557/APJCP.2021.22.8.2461.17 SHI S,MA B,SUN F,et al.Theaflavin binds to a druggable pocketof TMEM16A channel and inhibits lung adenocarcinoma cellviability J.J Biol Chem,2021,297(3):101016.doi:10.1016/j.jbc.2021.101016.18 BUYUK B,JIN S,YE K.Epithelial-to-me
10、senchymal transitionsignaling pathways responsible for breast cancer metastasis J.CellMol Bioeng,2022,15(1):1-13.doi:10.1007/s12195-021-00694-9.19 PENG J,WU H J,ZHANG H F,et al.miR-143-3p inhibitsproliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells byregulating its target gene FGF1J.Clin Tra
11、nsl Oncol,2021,23(3):468-480.doi:10.1007/s12094-020-02440-5.20 NOGUCHI S,HIRANO K,TANIMOTO N,et al.SLUG isupregulated and induces epithelial mesenchymal transition incanine oral squamous cell carcinoma J.Vet Comp Oncol,2022,20(1):134-141.doi:10.1111/vco.12755.(2023-02-17收稿2023-05-12修回)(本文编辑李国琪)细胞与分子
12、生物学1170天津医药 2023 年 11 月第 51 卷第 11 期多发性骨髓瘤(MM)是一种血液系统恶性肿瘤,其特征是肿瘤性浆细胞的异常增殖和积累1。目前蛋白酶体抑制剂如硼替佐米已被广泛用于MM治疗,虽显著提高了MM患者的生存率,但由于耐药性及初始治疗后复发率较高,该病仍无法治愈2-3。研究MM的耐药机制和寻找新的治疗靶点对改善MM化疗敏感性具有重要意义。环状RNA BTB域名和CNC同系物1(CircBACH1)可作为miR-656-3p的海绵,提高纤溶酶原激活物抑制剂1 RNA结合蛋白1表达,加速肝癌进展4,但其在 MM 中的作用还未知。许多miRNA的异常表达与MM的发展有关,如mi
13、R-140-5p 在 MM 中表达下调,上调 miR-140-5p可通过靶向血管内皮生长因子A抑制MM细胞增殖,其也可以通过被Linc00515靶向上调抑制MM细胞的自噬和化学耐药性5-6。鼠双微体2(MDM2)是一种E3泛素连接酶,与白血病和淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤的放化疗耐药相关,在MM中过表达,可增强MM细胞的增殖和存活能力7。研究显示,miR-140-3p 可以通过调节 KLF5/N-cadherin/MDM2/Slug轴促进多能间充质干细胞在椎间盘退变中的再生作用8,但CircBACH1、miR-140-5p与MDM2三者间的靶向关系尚不明确。本研究旨在分析CircBACH1对MM细
14、胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响,以及对miR-140-5p/MDM2轴的靶向调节机制。1材料与方法1.1样本和细胞选取2021年1月2022年12月荆州市中心医院收治的未接受放化疗的18例MM患者(MM组)骨髓,其中男11例,女7例,年龄5075岁。同时抽取18例骨髓移植健康供者骨髓作为正常对照组,其中男10例,女8例,年龄4268岁。所有临床检验样本的采集均经受检者知情同意并获得医院伦理学委员会批准(批号:202001136)。人MM细胞系U266细胞购自于武汉普赛诺生命科技有限公司。1.2试剂与仪器EDTA.2K抗凝剂(上海源叶生物科技有限公司);人全血单个核细胞分离液(Ficoll配制,
15、上海吉至生化科技有限公司);FITC标记抗人CD138抗体(艾美捷科技有限公司);RNA提取试剂、一步法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司);All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 和 All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit(美 国 GeneCopoeia 公 司);LipofectamineTM2000 转染试剂(北京百奥创新科技有限公司);CCK-8细胞增殖检测试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司);Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限
16、公司);硼替佐米(正大天晴药业集团股份有 限 公 司,国 药 准 字 H20204018);si1-CircBACH1、si2-CircBACH1及阴性对照(NC)、miR-140-5p mimic及NC、anti-miR-140-5p 及 NC、p-mirGLO-CircBACH1-WT、p-mirGLO-MDM2-WT及p-mirGLO-CircBACH1-MUT、p-mirGLO-MDM2-MUT质粒构建(上海吉凯基因公司);qRT-PCR引物合成(上海生工生物工程股份有限公司);B细胞淋巴因子2(Bcl-2)、Bcl-2 相 关 X 蛋 白(Bax)、裂 解 的 胱 天 蛋 白 酶(c
17、leaved caspase)-3兔单克隆抗体(英国Abcam公司);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(沈阳万类生物科技有限公司);MiniMACSTM磁珠细胞分选仪(德国Miltenyi公司);SpectraMax iD5 多功能酶标仪(美谷分子仪器有限公司);CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 仪(美国伯乐公司);CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)。1.3研究方法1.3.1免疫磁珠分离骨髓液中 CD138+浆细胞取加入EDTA-K2抗凝剂的骨髓液3 mL,使用Ficoll分离液分离骨髓单个核细胞,然后利用CD138标记磁珠抗体进行孵育,并加入磁珠分选缓冲液,经
18、过MACS磁珠分选器分离CD138+浆细胞,通过流式细胞术验证浆细胞。剩余细胞离心后,TRIzol法提取总RNA,并放置-20 保存,用于后续实验。1.3.2细胞培养将人MM细胞系U266细胞接种于含10%胎牛血清(FBS)和 1%双抗的 PMI-1640 培养基中,并置于37、5%CO2的培养箱中培养,待细胞汇合率生长至80%后bortezomib.The expression levels of B-cell lymphofactor 2(Bcl-2),Bcl-2 associated X protein(Bax)and cleaved caspase-3 were detected by
19、 Western blot assay.Dual luciferase reporter gene assay was used to verify the targeting relationship ofCircBACH1,miR-140-5p and MDM2.ResultsCompared with the normal control group,the mRNA expression levels ofCircBACH1 and MDM2 were increased in bone marrow plasma cells and U266 cells in the MM grou
20、p,while the expressionof miR-140-5p was decreased(P0.05).Compared with the control group and the si-NC group,the mRNA expression ofCircBACH1 and MDM2,cell proliferation activity and Bcl-2 protein expression were decreased in the transfected si-CircBACH1 group.The expression of miR-140-5p,cell apopto
21、sis rate,chemotherapy sensitivity,cleaved caspase-3 andBax expressions were increased(P0.05).In the anti-miR-140-5p supplementation experiment,the effect of si-CircBACH1 on MM cells was reversed,and the expression of MDM2 was increased(P0.05).Dual luciferase gene reportingexperiment verified the tar
22、geting relationship between CircBACH1 and MDM2 and miR-140-5p.ConclusionKnock downof CircBACH1 can up-regulate the expression of miR-140-5p,down-regulate the expression of MDM2,inhibit theproliferation of MM cells,promote the apoptosis of MM cells and improve the chemosensitivity.Key words:multiple
23、myeloma;cell proliferation;apoptosis;CircBACH1;miR-140-5p;mouse double minute 2;chemosensitivity1171Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.11进行传代。1.3.3qRT-PCR 检 测 细 胞 中 CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA的表达分别收集MM组和正常对照组的浆细胞以及U266细胞,用TRIzol法提取总RNA。miRNA逆转录试 剂 盒(All-in-One miRNA First-Strand cDNA Synthesis
24、Kit)进行逆转录,生成 miRNA 对应的 cDNA 第一链,再以cDNA 为模板使用 miRNA qPCR 定量试剂盒(All-in-OnemiRNA qPCR Kit)对 miR-140-5p 进行定量,随后以总 RNA为模板,按照一步法qRT-PCR试剂盒对CircBACH1和MDM2进行定量。qRT-PCR反应体系:2One Step SYBR Green Mix10 L,Enzyme 1 L,上下游引物各 0.5 L,RNA 1 L,补ddH2O 至总体积20 L。反应程序:95 预变性30 s;二步法,95 变性10 s,60 退火30 s,40个循环。CircBACH1、MDM
25、2 以 GAPDH 为内参,miR-140-5p 以 U6 为内参,采用2-Ct法计算细胞中 CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA的相对表达量,引物序列见表1。所有实验均重复3次。1.3.4细胞转染和分组先构建两个靶向 CircBACH1 的siRNA 质 粒,分 别 为 siRNA1-CircBACH1 和 siRNA2-CircBACH1,将两个不同敲低位点的质粒利用Lipofectamine2000转染试剂转染至U266细胞中,记为si1-CircBACH1组和si2-CircBACH1组,同时以未转染(Control组)和转染空载体(si-NC组)作为阴性对照。
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