2种十字花科检疫性病菌快速检测方法的建立.pdf

西南农业学报1962Southwest China Journal of Agricultural Sciences引用格式：于璇，魏霜，姜子德，王卫芳.2 种十字花科检疫性病菌快速检测方法的建立J.西南农业学报,2 0 2 3，36（9）：196 2 197 1.Yu X,Wei S,Jiang Z D,Wang W F.Establishment of rapid detection method for two quarantine pathogens in CruciferaeJJ.Southwest China Journal ofAgricultural Sciences,2023,36(9):1962-1971.D01:10.16213/ki.scjas.2023.9.016.2种十字花科检疫性病菌快速检测方法的建立2023年36 卷9期Vol.36No.9于璇，魏霜,姜子德”,王卫芳1（1.广州海关技术中心，广州510 6 2 3;2.华南农业大学植物保护学院，广州510 6 40）摘要：【目的】人工构建一段随机序列并作为扩增内标（Internal amplification control，IA C）添加进实时荧光PCR体系中，建立含有扩增内标的十字花科细菌性黑斑病菌（Pseudomonas syringae pv.maculicola）和油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans）的多重实时荧光PCR方法，检测上述2 种检疫性病菌，旨在在提高检测通量的同时，指示PCR假阴性问题。【方法】通过对实时荧光PCR体系中各个引物及探针比例进行优化，从特异性、灵敏度以及实际样品检测等多个方面对该方法进行系统评价。【结果】在2 0.0 uL体系中加入1.11410 3拷贝的IAC不影响靶目标的扩增，特异性强，对十字花科细菌性黑斑病菌及油菜茎基溃疡病菌的灵敏度分别为6.910-4、1.6 10-4ng/L。应用该方法对52 批进口油菜籽和十字花科蔬菜种子样品进行检测，结果显示可以实现上述2种检疫性病菌的快速检测，同时有效指示PCR反应的假阴性。【结论】两种检疫性病菌含IAC多重实时荧光PCR检测方法不仅能提高检测准确性而且能防止漏检，在口岸进口种子检疫中具有良好的推广应用前景，对引种安全具有重要意义。关键词：油菜籽；油菜茎基溃疡病菌；细菌性黑斑病菌；扩增内标中图分类号：S41(1.Guangzhou Customs Technology Center,Guangzhou 510623,China;2.College of Plant Protection,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,China)Abstract:Objective A random sequence was artificilly constructed and added toreal-time fluorescent PCR as internal amplification con-trol(IAC).A multiplex real-time PCR method containing Pseudomonas syringae pv.maculicola and Leptosphaeria maculans was estab-lished.The detection of the above two quarantine pathogens aimed to indicate the false negative problem of PCR and improve the detectionthroughput.Method By optimizing the proportion of primers and probes in real-time fluorescence PCR system,this method was systemati-cally evaluatedfrom theaspectsofspecificitysensitivity and actual sampledetection.ResultAdding1.140copiesofIACintothe20L system did not ffect the amplification of the target,and had strong specificity.The sensitivity to P.syringae pv.maculicola and L.mac-ulans were 6.9 10-4 and 1.6 10-4 ng/L,respectively.This method was used to detect 52 batches of imported rapeseed and cruciferousvegetable seed samples.The results showed that the method could realize the rapid detection of the above two kinds of quarantine pathogenand indicate the false negative of PCR reaction effectively at the same time.ConclusionThis method can not only improve the accuracy ofdetection but also prevent missing detection.It has the prospect of popularization and application in the quarantine of imported seeds atports,and is of great significance for the safety of seed introduction.Key words:Rapeseed;Leptosphaeria maculans;Pseudomonas syringae pv.maculicola;Internal amplification control【研究意义】十字花科细菌性黑斑病菌（Pseudo-monas syringae pv.maculicola）和油菜茎基溃疡病菌（Le p t o s p h a e r i a ma c u l a n s）能够侵染油菜籽，随农产品文献标识码：AEstablishment of rapid detection method for twoquarantine pathogens in CruciferaeYU Xuan,WEI Shuang,JIANG Zi-de,WANG Wei-fang文章编号：10 0 1-48 2 9(2 0 2 3)9-19 6 2 10贸易经油菜籽传人我国的风险高，给我国农业生产带来重大安全隐患1-4，上海、厦门等多个口岸曾从进口油菜籽中多次检出上述病菌5-7 。传统检测方收稿日期:2 0 2 2 -11-11基金项目：海关总署科研项目（2 0 2 0 HK147）；广州海关科研项目（2 0 2 0 GZCK-004）第一作者：于璇（198 9-），农艺师，主要从事植物检疫研究。E-mail：6 0 98 90 2 6 2 q q.c o m通讯作者：王卫芳（196 4），研究员，主要从事植物检疫研究。E-mail：w f w a n g 6 16 3.c o m9期法周期长、灵敏度低,无法满足口岸通关需求。【前人研究进展】目前，油菜茎基溃疡病病菌和十字花科细菌性黑斑病菌常用的鉴定和检测方法包括分离培养法、常规PCR8-9、实时荧光定量PCRL10-1LAMP-LFD检测方法12 、重组聚合酶等温扩增技术13、血清学检测方法14 等。随着分子生物学的快速发展,PCR技术逐渐应用于植物致病菌的检测2,9,但是检测中遇到的假阴性问题仍未得到有效解决，因此,多数学者认为在PCR检测方法中加人扩增内标（Internal amplification control,IAC)非常必要15-16 。【本研究切人点】IAC-PCR方法已广泛应用于食品微生物和植物病毒检测16-2 4,但尚未有应用于油菜籽中油菜茎基溃疡病病菌和十字花科细菌性黑斑病菌检测的研究报道。【拟解决的关键问题】通过人工构建一段随机序列并作为IAC添加进实时荧光PCR体系中,对体系进行优化,建立含有扩增内标的十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的多重实时荧光PCR方法,并且从特异性、灵敏度以及实际样品检测等多个方面对该方法进行系统评价,以期建立能同时检测十字花科黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌的含扩增内标的多重实时荧光PCR方法,指示PCR反应中假阴性的情况，提高实验室检测效率及口岸对病菌的拦截率,为防止上述2种病菌随进口种子的传入提供技术保障。1材料与方法1.1实验材料试剂：LB培养液（广州环凯微生物科技有限公司）、NA培养基（广州环凯微生物科技有限公司）、PDA培养基（广州环凯微生物科技有限公司）、Premix Ex Taq试剂（日本TaKaRa公司）、DL2000DNAMarker(日本TaKaRa公司）6 Loading Buffer（日本TaKaRa公司）、TAE缓冲液（日本TaKaRa公司）生理盐水、灭菌水、无水乙醇。仪器：光照培养箱（IPP110plus）、研磨仪（G T 2 0 0）、台式冷冻离心机（2-16 KL）、核酸光标记仪（HG-EMA）、荧光定量PCR仪（QuantStudios5）、PCR仪（T100TMThermalCycler）、凝胶成像系统（G e l d o c XR+）、核酸蛋白分析仪（ND2000）。菌株：十字花科细菌性黑斑病菌菌株（P.syrin-gae pv.maculicola）、油菜茎基溃疡病菌（L.macu-lans)菌株为广州海关技术中心植物检疫研究所在进口油菜籽中分离、鉴定、保存的菌株，其他菌株为广州海关技术中心植物检疫研究所保存菌株，编号为：油菜茎基溃疡病菌（L.maculans）（137 1,1358，1362）、油菜黑胫病菌（L.biglobosa）（Z-5,Z-11）、番于璇等：2 种十字花科检疫性病菌快速检测方法的建立1963茄茎点霉（P.lycopersici）（P-118 7）、葡萄茎枯病菌（P.g l o m e r a t a）（P-342 8）、炭疽菌属（Colletotrichumsp.）（2 30 9）、链格孢属（Alternariasp.）（452 3，4546）、十字花科细菌性黑斑病菌（P.syringae pv.maculicola）（10 37,38 46）、丁香假单胞菌番茄致病变种(P.syringae pv.tomato)（10 59,10 6 7,112 5）、丁香假单胞菌豌豆致病变种（P.syringae pv.pisi）（48 32,48 45）、丁香假单胞菌黍致病变种（P.syrin-gae pv.panici)（P-36）、丁香假单胞菌斑生致病变种（P.s y r i n g a e p v.ma c u l i c o l a）（M-2 3）、丁香假单胞菌大豆致病变种（P.syringae pv.glycinea）（1146）、黄单胞属（Xanthomonas sp.）（X-51,X-37）、假单胞属（Ps e u d o m o n a s s p.）（58 6 1）、荧光假单胞（P.fluores-cens）（2 312,2 315）。用新型植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，目录号DP302，北京）分别提取病原真菌与病原细菌基因组 DNA;用 DNA 提取试剂盒（达安基因,DA0591）提取实际样品的总DNA，测定DNA浓度。引物与探针：十字花科细菌性黑斑病实时荧光PCR引物与探针序列参照国家标准十字花科细菌性黑斑病检疫鉴定方法（GB/T368442018），油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR引物与探针序列参照行业标准油菜茎基溃疡菌病检疫鉴定方法（SN/T 36 8 52 0 13）;I A C 探针应用Primer Premier5.0软件设计，在NCBI网站中进行BLAST分析比较和评估,保证特异性。引物和探针序列如表1所示，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2方法1.2.1IAC的构建利用在线软件（http:/www.bio- NCBI中进行比照,若没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上、下游分别连接十字花科细菌性黑斑病菌目标片段的引物序列，构成十字花科细菌性黑斑病菌目标DNA的扩增内标DNA序列。将扩增内标DNA序列委托人工基因合成，合成片段载体pUC57,计算拷贝数，-2 0 保存备用,菌液置于甘油管中-7 0 保存。1.2.2含IAC的多重实时荧光PCR体系优化十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选。十字花科细菌性黑斑病菌特异性引物PM1/PM3分别与油菜茎基溃疡病菌的4 对特异性引物(Forward Primer/Reverse Primer,LM3/LM4,LMf/LMr,Lmb3/R2)进行普通多重PCR反应,反应体系为:DNA 2.0 L（各 1 L),2 Permix Ex Taq(Probe qPCR)12.5 L,10 mol/L PM1/PM3 各 1.0L,10mol/L油菜茎基溃疡病菌特异性引物各1.01964L,ddH,0补足至2 5.0 L。用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。PCR反应程序为95 1 min;95 5s,60 1 m in,40 个循环。十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物探针比例优化。通过对2 种菌的引物比例、探针比例进行优化,最终建立多重实时荧光PCR反应体系，优化参数如表2 所示。反应体系为：DNA2.0L(各1.0 L),2Permix Ex Taq（Pr o b e q PCR)10.0L,10mol/L引物按表2 比例添加,10 umol/L探针按表2 比例添加,ddH,0补足至2 0.0 L。PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。1.2.3优化IAC的添加量检测灵敏度。通过拷贝数计算公式：（6.0 2 10 2 3）（ng/L10-）/（D NA l e n g t h 6 6 0）=c o p i e s/L计算出IAC拷贝数为1.11410 /L,10倍梯度稀释至1.11410%L。选取拷贝数为1.11410、1.11410 4、1.114103、1.114 10 2、1.11410 、1.114 10/L 的IAC作为模板，进行实时荧光PCR扩增，反应体系为:DNA 1.0 L,2 Permix Ex Taq(probe qPCR)10.0L,10mol/LPM1/PM3各1.0 L,10 mol/L IAC 探针1.0 L,ddH,0补足至2 0.0 L。PCR西南农业学报表1引物与探针序列Table 1 Primer and probe sequence引物与探针Primer and probe十字花科细菌性黑斑病菌PM1P.syringae pv.MaculicolaPM3PM-P油菜茎基溃疡病菌Forward PrimerL.maculansReverse PrimerFR-PLM3LM4LMfLMrLmb3R2扩增内标IAC-PIAC表2 反应体系优化参数Table 2(Optimization parameters of reaction system类别Category引物比例Primerratio探针比例Proberatio36卷序列(5 3)产物长度(bp)SequenceProduct lengthgcgaaacgacagcaacagtg307cgagtcgatagcggcaacFAM-gcgccacttcgaggctgctt-TAMRAccccctactagaagagttatagcacttcctaagatcctcctattagagagccVIC-cttataaagagcgctaagta-MGBcaccaattggatcctaaggcgagtccaagtggaacagttccttggtggcttgctgttactgacgctgactgcattcaccaattggatcccctaggcgcaaaatgtgctgcgctCY5-atgaccaaagctccgcgtag-BHQ3参数ParameterPSM/LM:0.2/1;0.4/1;0.6/1;0.8/1;1/1PSM/LM:0.5/0.5.0.5/0.25.0.25/0.5.0.25/0.25、1/0.0/1反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。IAC添加拷贝数与探针浓度优化。以十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌 DNA 为模板加IAC进行多重实时荧光PCR反应，分别添加拷贝数为1.11410 4、1.11410 3、1.11410 2 1.11410/L的IAC1.0L,IAC探针添加量分别为0.3、0.5和0.7 L,反应体系为：DNA3.0L（各1.0L,IAC拷贝数按文中添加）,2 Permix Ex Taq(ProbeqPCR)10.0 L,10 mol/LPM1/PM3各1.0L,10 mol/L探针0.2 5L,10 mol/L ForwardPrimer/Reverse Primer各1.0 L,10mol/L探针0.5L,添加0.30.0.50.0.7 0 L10mol/LIAC探针，添加ddH,0补足至2 0.0 L,并设十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌的多重实时荧光PCR扩增作为对照。PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。IAC特异性验证。以十字花科细菌性黑斑病菌DNA、油菜茎基溃疡病菌DNA、IA C 分别为模板进行实时荧光PCR反应,反应体系为:DNA2.0 L,2Permix Ex Taq（Pr o b e q PCR）10.0 L,10 mol/LPM1/PM3各1.0 L,10 mol/L IAC探针0.50 L,156276723289期ddH,0补足至2 0.0 L,并设以无菌水为模板的实时荧光PCR扩增作为阴性对照,PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。1.2.4含IAC的多重实时荧光PCR体系特异性验证选取十字花科细菌性黑斑病菌2 株、油菜茎基溃疡病菌靶标菌3株、非靶标菌19 株,分别提取DNA作为模板，进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增,反应体系为:DNA 2.0L,2Permix Ex Taq(Probe qPCR)10.0 L,10 mol/L PM1/PM3各1.0L,10 mol/L 探针0.2 5 L,10 mol/L ForwardPrimer/Reverse Primer各1.0 L,10mol/L探针0.50L,10mol/LIAC探针0.50 L,ddH,0补足至2 0.0 L。PC R反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。1.2.5含IAC的多重实时荧光PCR体系灵敏度测试分别将浓度为6.910 与1.6 10 ng/L的十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的DNA10倍梯度稀释至6.910-和1.6 10-ng/L,作为模板分别进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增,分别以无菌水为模板的含IAC多重实时荧光PCR和以无菌水为模板不含IAC的多重实时荧光PCR为阴性对照。反应体系为:DNA 2.0 L,2 Permix Ex Taq（Pr o b e q PCR）10.0 L,10 mol/LPM1/PM3 或 10 mol/L Forward Primer/ReversePrimer 各1.0 L,10 mol/L 探针 0.2 5L,10mol/L探针0.5 L,10mol/L IAC 探针0.5L,ddH,O补足至2 0.0 L,PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。1.2.6含IAC 的多重实时荧光 PCR体系检测实际样品从进口的52 批油菜籽与十字花科蔬菜种子样品中随机取样，提取DNA,分别进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增，反应体系为:DNA2.0L，2 Permix Ex Taq(Probe qPCR)10.0 L,10 mol/LPM1/PM3各1.0 L,10 mol/L探针0.2 5 L,10mol/L Forward Primer/Reverse Primer 各 1.0 L,10mol/L探针0.50 L,10 mol/LIAC 探针0.50L,ddH,0补足至2 0.0 L。另设人工感染十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的样品对照。PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。2结果与分析2.1IAC 的构建利用在线软件（http:/www.bio- NCBI于璇等：2 种十字花科检疫性病菌快速检测方法的建立PCR结果;10：阴性对照。M:DL 2000 DNA Marke;1:Multiplex PCR results of PMI/PM3 andLM3/LM4;2:Multiplex PCR results of PMI/PM3 and LMf/LMr;3:Multiplex PCR results of PMI/PM3 and Forward Primer/ReversePrimer;4:Results of multiplex PCR PMI/PM3 and Lmb3/R2;5:Re-sult of PCR PMI/PM3 and LM3/LM4;6:Result of PCR LMf/LMr;7:Result of PCR Forward Primer/Reverse Prime;8:Result of PCRLmb3/R2;9:Result of PCR PMV/PM3;10:Negative control.Fig.1Two kinds of pathogenic bacteria primers screened for thePCR reactions1965中进行比照,没有出现与之同源的DNA片段,在这段随机DNA序列上、下游分别连接十字花科细菌性黑斑病菌目标片段的引物序列，构成十字花科细菌性黑斑病菌目标DNA的扩增内标 DNA序列。扩增内标序列：GCGAAACGACAGCAA-CAGTGACGTGTCGTCCCACAGGGGTCTATTGGGGATCATGACCAAAGCCTCCGGGCGTAGTCATCTCTGTGGAGGGACCTTGCCATCGTGTTGCCGCTATCGACTCG。单划线部分是十字花科细菌性黑斑病菌上、下游引物，双划线部分是IAC探针。2.2含IAC多重实时荧光PCR体系优化2.2.1十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选以十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌 DNA为模板,十字花科细菌性黑斑病菌特异性引物 PM1/PM3分别与油菜茎基溃疡病菌的4 对特异性引物（Lmb3/R2、LM 3/LM 4、LM f/LMr、Fo r w a r d Pr im e r/Re v e r s e Pr im e r）进行普通多重PCR反应。从图1可知,与普通PCR对比,仅For-wardPrimer/ReversePrimer与PM1/PM3同时扩增出阳性条带，LMb3/R2、LM 3/LM 4产物32 8、2 7 6 bp与PM1/PM3产物30 7 bp条带大小相近,不好辨别，因此选取ForwardPrimer/ReversePrimer作为多重PCR体系中油菜茎基溃疡病菌的引物。M123456789102000bp1000bp500bp250 bp100 bpM:DL2000 DNA Marke;1：PM I/PM 3与Lm3/Lm4普通多重PCR结果;2：PMI/PM3与LMf/LMr普通多重PCR结果；3：PMI/PM3与ForwardPrimer/ReversePrime普通多重PCR结果；4：PMI/PM3与Lmb3/R2普通多重PCR结果;5:Lm3/Lm4普通PCR结果;6：LMf/LMr普通PCR结果;7:Forward Primer/Reverse Prime普通PCR结果;8:Lmb3/R2普通PCR结果;9：PMI/PM3普通图12 种病菌引物筛选PCR反应19662.2.2十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物探针比例优化?当十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌的引物比例为0.8/1.0,探针比例为0.2 5/0.50 时Ct值最小，扩增效率最好，理论上应该选择0.8/1.0 作为本实验引物比例，但是由于IAC 与十字花科细菌性黑斑病菌共用1对引物，会消耗掉一定量的引物，当探针比例为1/1时，十字花科细菌性黑斑病菌条带更亮,因此本研究确定多重实时荧光PCR反应体系中十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物比例为 1/1,探针比例采用0.2 5/0.50。2.3IAC添加量优化2.3.1IAC检测灵敏度分别以1.11410、1.114 104、1.114 10 3、1.114 10 2、1.114 10 、1.11410%L拷贝数的IAC为模板进行实时荧光PCR扩增。从图2 可知,IAC的检测灵敏度为1.11410/L。为了使IAC对检测灵敏的影响降到最低，在确保内标能够清晰的指示假阴性的同时,尽量选择较低浓度，因此选择1.11410 4、1.11410 3、1.11410、1.11410/L进行下一步实验,确定扩增内标的添加量。2.3.2IAC拷贝数与探针添加量优化科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌 DNA 为模板进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增，根据2.3.1检测灵敏度结果,在确保内标能够清晰指示假阴性的同时,尽量选择较低浓度的原则,使其对检测灵敏的影响降到最低。因此排除拷贝数1.114 10/L,分别添加拷贝数为1.11410 4、1.114103、1.11410、1.11410 /L的IAC,添加量分别为0.3、0.5和0.7 L,从表3中可知，当添加拷贝含IAC多重实时荧光PCR检测结果Test results of multiple real-time qPCR with IAC探针添加量（uL）Probe amountPSM0.3LMIACPSMLMIACPSMLMIAC西南农业学报01图2 IAC检测灵敏度Fig.2IAC detection sensitivity数为1.11410*/L时Ct值增大，影响灵敏度，当拷贝数添加1.11410 3、1.11410/L时对PSM与LM的 Ct值影响最小,考虑到当添加IAC 的拷贝数为1.11410/L时,Ct值接近35,不容易判断，因此选择1.11410 L为本体系的拷贝数添加量；对比探针添加量可以看出，当探针添加0.5L时,PSM与LM的Ct值最小。所以在2 0.0 L体系中,选择添加IAC拷贝数为1.11410/L,IAC探针添加量为0.5L。2.3.3IAC特异性验证以十字花科细菌性黑斑病菌DNA、油菜茎基溃疡病菌DNA、IA C为模板分别进行实时荧光PCR扩增。从图3可知，仅IAC扩以十字花增出阳性曲线,目标菌为阴性,说明该IAC 特异性良好。2.4含IAC多重实时荧光PCR体系特异性验证选取十字花科细菌性黑斑病菌2 株与油菜茎基溃疡病菌3株靶标菌、19 株非靶标菌提取DNA,作为模板进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增与实时荧光PCR扩增。从图4可知,该反应特异性高，对非目标菌检测结果均为阴性,对目标菌检测结果均为阳性。表3IAC拷贝数与探针添加量Table 3 IAC copy number and probe addition添加拷贝数(L)Added copy number1.114 1041.114 10329.91 0.6527.82 1.1930.81 0.3728.67 0.2529.33 0.5731.35 0.310.530.65 1.1530.15 1.2030.93 0.230.729.78 0.4130.74 1.1729.37 0.4536卷y=-2.1672x+37.135R=0.961323拷贝数对数(uL)Log.copies多重实时荧光PCR检测结果Test results of multiplereal-time qPCR1.114 1021.114 10128.31 0.5027.62 0.5228.55 0.4928.42 0.7832.61 1.09一27.75 0.5627.80 0.8928.57 0.0828.59 0.1031.12 0.3233.12 0.8528.15 0.5027.96 1.7128.71 0.4128.64 0.1230.63 0.4932.99 0.544PSM27.65 1.3727.74 0.5628.58 0.61一28.22 0.1528.61 0.41一5LM28.49 0.1469期700 0005000002300100.00010.504.509617013:IAC为模板的实时荧光PCR验证结果；4 6：十字花科细菌性黑斑病菌DNA为模板的实时荧光PCR验证结果7 9：油菜茎基溃疡病菌DNA为模板的实时荧光PCR验证结果;NC:以无菌水为模板的阴性对照。1-3:Results of real-time PCR validation using IAC as template;4-6:Results of real-time PCR validation using DNA as templateof P.syringae pv.Maculicola;7-9:Results of real-time PCRvalidation using DNA as template of L.maculans;NC:Negativecontrol.图3IAC实时荧光PCR特异性验证结果Fig.3 Results of specificity verification by IAC real-time PCRaLM550000400000R2500001000000C475.0004000002500001000003599-3427350a 和c分别为油菜茎基溃疡病菌含IAC多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的灵敏度测试结果;1 6:1.6 10 l1.610-4ng/L的DNA浓度。b和d分别为十字花科细菌性黑斑病菌含IAC多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的灵敏度测试结果;1 7:6.410 6.410-5ng/L的DNA浓度。IAC：含IAC的多重实时荧光PCR扩增结果;NC:阴性对照。a and c show the sensitivity test results of multiple real-time PCR and single real-time PCR containing IAC for L.maculans,respectively;1-6:DNAconcentration of1.6101-1.610-ng/L.b and d show the sensitivity test results of muliple real-time PCR and single real-time PCR containingIAC for P.syringae pv.Maculicola,respectively.1-7:DNA concentration of 6.4 101-6.4 10-5ng/L;IAC:Real-time PCR amplification resultsof all IAC in the system;NC:Negative control.于璇等：2 种十字花科检疫性病菌快速检测方法的建立4.9NC101020循环数Cycle1020循环数CycleLM10图5含IAC多重实时荧光PCR方法与单重实时荧光PCR方法检测灵敏度比较Fig,5 Comparison of the sensitivity of multiple real-time PCR with IAC and single real-time PCR1967150000100.00050.00010 00003040304052030循环数Cycle4-532030循环数Cycle13:油菜茎基溃疡病菌含IAC多重实时荧光PCR扩增结果；45：十字花科细菌性黑斑病菌含IAC多重实时荧光PCR扩增结果；6 2 4:非靶标菌含IAC多重实时荧光PCR扩增结果;IAC：靶标菌与非靶标菌IAC实时荧光PCR扩增结果。1-3:Results of IAC-containing multiplex real-time PCR amplificationof L.maculans;4-5:Results of IAC-containing multiplex real-timePCR amplification of P.syringae pv.Maculicola;6-24:Results of multi-ple real-time PCR amplification of non-target bacteria containing IAC;IAC:Real-time PCR amplification results of all IAC in the system.图4含IAC的多重实时荧光PCR反应结果Fig.4Multiple real-time qPCR reaction results of IAC-containingtest strainsbPSM90 00060 00030 000100000dPSM80.00060 00030.00010.00002-203518464040IAC451020循环数Cycle31020循环数CycleN304045306NG4019682.5含IAC多重实时荧光PCR体系灵敏度测试提取的十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌DNA浓度分别为6.910 和1.6 10 ng/L,进行10 倍稀释,稀释至6.910-和1.6 10-6ng/uL,共8 个浓度,作为模板进行含IAC 的多重实时荧光PCR扩增。从图5可知，含IAC的实时荧光PCR对油菜茎基溃疡病菌的检测低限为 1.6 10-4ng/L;重复试验发现，当DNA浓度为6.910-sng/L时虽有扩增，但Ct值并不稳定，因此本方法对十字花科细菌性黑斑病菌的检测低限为6.910-4ng/L。2 种病菌同样DNA浓度梯度,分别按照标准中荧光PCR与含IAC的多重实时荧光PCR扩增,检测低限相同,证实在PCR体系中添加适宜供试样品Tested sample编号样品NumberSample1甘蓝种子2青花菜种子3芥蓝种子4大白菜种子5花椰菜种子6油菜籽7白菜种子8菜心种子9甘蓝种子10萝卜种子11油菜籽12花椰菜种子13菜苔种子14芥蓝种子15青花菜种子16白菜种子17菜心种子18青花菜种子19芥菜种子20油菜籽21甘蓝种子22大白菜种子23萝卜种子24菜苔种子25菜心种子26青花菜种子西南农业学报浓度的IAC片段不会降低检测灵敏度。2.6含IAC多重实时荧光PCR检测实际样品对进境的52 批油菜籽和十字花科蔬菜种子分别提取DNA后，进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增（表4）,通过与人工添加十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的样品和以无菌水为模板的