猪舍空气细颗粒物对猪肺泡巨噬细胞精氨酸代谢和糖酵解的影响.pdf

南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:沈家鲲硕士研究生通信作者:李春梅教授博导主要从事畜禽养殖环境控制与智慧生产的研究:.沈家鲲周子琳沈丹等.猪舍空气细颗粒物对猪肺泡巨噬细胞精氨酸代谢和糖酵解的影响.南京农业大学学报():.(.).():.猪舍空气细颗粒物对猪肺泡巨噬细胞精氨酸代谢和糖酵解的影响沈家鲲周子琳沈丹刘俊泽李春梅(南京农业大学动物科技学院家畜环境控制与智慧生产研究中心江苏 南京)摘要:目目的的 本试验旨在探究猪舍空气细颗粒物(.)对猪肺泡巨噬细胞极化相关的精氨酸代谢和糖酵解以及 信号通路的影响 方方法法 选用猪肺泡巨噬细胞系(/)作为细胞模型设置不同质量浓度(、和 )的.和不同处理时间(、和 )处理细胞收集细胞测定精氨酸代谢、糖酵解以及 信号通路相关指标 结结果果.处理细胞 后细胞上清液中一氧化氮()浓度随.处理浓度的升高而逐渐上升当.浓度大于 时 浓度极显著升高(.)以 .处理细胞培养不同时间发现.处理 内细胞上清液中 浓度逐渐升高随着细胞处理时间的延长.对细胞的影响逐渐减轻 此外不同浓度.处理 细胞内精氨酸酶活性降低其中 .处理组与对照组相比差异极显著(.)同时随着.浓度的升高细胞内乳酸生成量/葡萄糖消耗量(/)值升高(.)标志着细胞内葡萄糖向乳酸转化的比率增高糖酵解相关基因 和 表达水平显著提高(.).处理显著提高了细胞内 表达水平(.).处理后 巨噬细胞标志物 表达水平显著降低(.).显著增加细胞 和 表达水平(.)和 蛋白表达水平(.)激活 信号通路 结结论论 猪舍空气.能够诱导猪肺泡巨噬细胞发生炎症反应促进细胞内精氨酸和葡萄糖代谢向 表型特征的代谢转换关键词:细颗粒物(.)猪肺泡巨噬细胞巨噬细胞极化精氨酸代谢糖酵解 蛋白中图分类号:文献标志码:文章编号:()(.)():(.).(/).()().().(.).(.)./(/)(.)(.).南 京 农 业 大 学 学 报第 卷(.).(.).(.).:(.)猪舍空气颗粒物污染是猪呼吸道疾病发生的重要原因之一也是疾病传播的重要媒介.粒径小进入肺泡后约 的.会沉积在肺泡中短期内无法排出 在这种情况下.一方面被肺泡巨噬细胞吞噬清除但另一方面当.浓度超过一定范围或在长期暴露条件下肺泡的局部微环境会发生改变出现炎症反应进而引发级联反应加剧肺组织的损伤 研究表明高浓度猪舍.会导致小鼠体重下降肺组织出现病理损伤和炎症 然而大多数的研究集中于探究颗粒物对巨噬细胞的细胞凋亡和自噬水平的影响颗粒物对肺泡巨噬细胞的功能影响报道仍然较少 肺泡巨噬细胞在肺部扮演着清道夫的作用在清除肺泡中颗粒物的同时这些颗粒物反过来也会影响肺泡巨噬细胞的功能猪肺泡巨噬细胞()在不同微环境的刺激下能转为不同功能的表型这种改变也被称为巨噬细胞的极化 巨噬细胞受不同刺激能够极化为功能完全不同的 和 表型 型主导炎症反应在发挥促炎作用的同时杀伤病原微生物 型主要发挥抗炎修复的作用在炎症反应后期的恢复中起到重要作用 不同表型巨噬细胞的功能发挥依赖一系列的代谢改变其中精氨酸代谢和葡萄糖代谢是不同表型巨噬细胞发挥不同功能的重要基础 此外巨噬细胞的极化是一个多因子相互作用的复杂过程受到胞内多种信号分子及通路的调控 其中 的激活在 表型巨噬细胞发挥功能中起着关键作用而 样受体()又是猪舍空气.中脂多糖()的主要受体因此 通路在.诱导的巨噬细胞极化中可能发挥重要作用猪肺泡巨噬细胞系/是一种成熟的永生化细胞通常用于免疫、感染等方面的研究 本课题组前期研究发现猪舍.能够诱导原代 向 型巨噬细胞极化引发一氧化氮()的大量产生和精氨酸酶活性的降低但是.对肺泡巨噬细胞代谢的影响尚不清楚 因此本研究旨在进一步从精氨酸代谢和糖酵解的角度确定.诱导 极化的代谢特征以及.诱导 极化后对 信号通路的影响为深入了解.对巨噬细胞代谢的影响提供参考 材料与方法.试验材料猪肺泡巨噬细胞系/购自北京北纳创联生物技术研究所特氟龙滤膜购自 公司胎牛血清()、培养基购自 公司抗生素青霉素链霉素两性霉素 均购自武汉普诺赛生命科技有限公司含 的胰酶购自 公司、标记山羊抗小鼠、试剂盒购自上海碧云天生物公司 兔单克隆抗体购自 公司.磷酸缓冲盐溶液()、牛血清白蛋白()、聚乙二醇辛基苯基醚()购自北京索莱宝有限公司 试剂盒、乳酸脱氢酶()试剂盒、试剂盒、葡萄糖试剂盒、乳酸试剂盒购自南京建成生物工程研究所多聚甲醛固定液购自 公司三羟甲基氨基甲烷盐酸盐()、硫酸、磷酸购自国药集团化学试剂公司氯化锰、尿素、精氨酸购自源叶生物有限公司异亚硝基苯丙酮购自上海萨恩化学有限公司总 提取试剂盒和反转录试剂盒均购自南京诺唯赞生物有限公司 试剂盒购自擎科生物有限公司.细胞培养与分组处理/细胞于 完全培养基(含 的、的抗生素)中培养细胞培养条件为、细胞处理分为对照组和.组(、和 ).组使用含不同浓度.的完全培养基处理细胞对照组使用同等体积生理盐水替换的完全培养基细胞处理 在.时间效应研究中细胞分为对照组和.组()设置 个时间点(、和 )并设置 个生物学重复分别在相应的时间收集细胞及上清液用于后续检测 第 期沈家鲲等:猪舍空气细颗粒物对猪肺泡巨噬细胞精氨酸代谢和糖酵解的影响.的采集与提取.的采集方法详见本课题组 等的报道将采样器置于集约化猪舍中采样器流速为.样本被采集在直径为 的特氟龙滤膜上每天采集样本 从早上:至第 天早上:采集样本于 保存 采集后的滤膜加入超纯水经超声波振荡后用 层无菌纱布过滤过滤后悬浊液置于离心管中于 离心 保留沉淀冷冻干燥后的含沉淀离心管于干燥器室温平衡 每个离心管标记后称重所得质量为(次称重恒定)加入一定量的生理盐水混匀后吸出颗粒物汇聚于玻璃瓶中 离心管于 干燥 干燥后于干燥器室温平衡 取出称重所得质量为(次称重恒定)计算离心管中的.质量()玻璃瓶中加入生理盐水配制成终质量浓度为 的.母液经高压灭菌后于 保存用于处理细胞.细胞活力测定.试验/细胞以每孔 个接种于 孔板培养 细胞经不同分组处理再培养不同时间按 试剂盒说明书方法检测细胞活力 试验方法如下:细胞处理到达设定的时间后每孔加入 的 在培养箱中避光培养 吸出培养液每孔加入 的二甲基亚砜()以溶解沉淀摇床上振荡 取样检测吸光值().释放试验/细胞以每孔个接种于 孔板中培养 后对细胞进行不同分组及(培养时间)处理 离心 收集细胞上清液使用 试剂盒测定 含量按照说明进行操作.含量测定/细胞以每孔 个接种于 孔板中培养 后对细胞进行不同分组处理 离心 吸取上清液并使用 试剂盒测定 含量.精氨酸酶活性测定/细胞以每孔 个接种于 孔板参照本课题组的研究方法将处理后的细胞先用 洗涤 次加入 .室温裂解 再加入 的()和 的()温育 加入 的 精氨酸(.)水解精氨酸 加入 浓()和浓()混合水溶液(体积比)终止最后加 的 异亚硝基苯乙酮(溶于 乙醇)避光温育 显色测定吸光值()以尿素作为标准品绘制标准曲线得标准方程.(.)计算样品中的尿素浓度()以每分钟催化精氨酸产生 尿素的酶量为精氨酸酶的一个活性单位().乳酸生成量/葡萄糖消耗量(/)值的测定/值测定参照陈莎娜等的方法/细胞以每孔 个接种细胞于 孔板待细胞贴壁后按照试验分组处理收集处理前和处理后的细胞上清液 离心 收集上清液于 保存 按照葡萄糖试剂盒和乳酸试剂盒说明书方法测定 处理前的细胞上清液葡萄糖浓度和乳酸浓度分别为 和 处理后的细胞上清液葡萄糖浓度和乳酸浓度分别为 和 计算/值 公式如下:/()/().细胞 提取及精氨酸代谢和糖酵解相关基因表达水平的 检测将/细胞按每孔个接种于 孔板细胞贴壁后进行细胞分组和处理 处理到达预定时间后弃上清液用 洗涤 孔板内的细胞 次用 总 试剂盒提取细胞中的总 提取后的总 浓度和纯度用 测定 使用 反转录试剂盒将 反转录为 于 保存 按照 试剂盒的方法进行操作 反应体系:()上、下游引物()各.().模板 总体积 使用 仪进行实时荧光定量 反应()检测 反应程序:预变性 变性 退火延伸 共 个循环熔解曲线 每个反应均进行 个重复以 为持家基因使用 法测定相对 表达水平 基因引物序列等参数如表 所示南 京 农 业 大 学 学 报第 卷表 基因引物序列 基因名称 登录号.引物对序列 ()产物长度/./././././././././././././注:肌动蛋白基因 :诱导型一氧化氮合酶基因 :精氨酸酶 基因:葡萄糖转运蛋白 基因 :己糖激酶 基因 :甘油醛磷酸脱氢酶基因 :乳酸脱氢酶 基因 :白细胞介素 基因 :肿瘤坏死因子 基因 :抗原分化簇 基因 :抗原分化簇 基因 :样受体 基因 :髓样分化因子 基因 .免疫荧光组化法检测 通路相关蛋白 的表达/细胞以每孔 个接种于铺有细胞爬片的 孔板培养 待细胞黏附至爬片后弃培养液加入不同浓度的.处理 吸弃培养液 洗 次后按照免疫荧光组化操作进行 细胞爬片在多聚甲醛中固定 洗 次每个爬片加入 的.通透 后 清洗 次 每孔加入 含 的 室温封闭 吸弃封闭液用含 的 按 稀释一抗()每个爬片上加入 的一抗 孵育 弃一抗后用 清洗 次 用含 的 按 稀释二抗(标记的山羊抗小鼠)避光孵育 弃二抗后 清洗 次每孔加入 室温避光孵育 弃 后 清洗 次取出爬片倒扣在滴加 的抗淬灭剂的载玻片上激光共聚焦显微镜下镜检.数据统计与分析数据整理计算后利用 .软件对试验数据进行分析对不同处理时间的对照组和.组进行单因素方差分析()和独立样本 测验 试验结果数据用平均值标准误()表示 结果与分析.对猪肺泡巨噬细胞(/)活力的影响细胞活力检测结果显示:.处理细胞 后与对照组相比/细胞活力呈现浓度依赖性降低其中 .处理组细胞活力极显著降低(.).对/细胞 分泌和精氨酸酶活性及相关基因表达的影响如图 所示:和 的.处理细胞 后显著提高了/细胞上清液中 浓度(.图).处理后细胞上清液中 浓度先升高()后降低()在 达到最高在各时间点均显著高于对照组(.图).处理 后精氨酸酶活性极显著降低(.图).处理后精氨酸酶活性与对照组相比先降低后升 第 期沈家鲲等:猪舍空气细颗粒物对猪肺泡巨噬细胞精氨酸代谢和糖酵解的影响高(图)和 .处理细胞 细胞内 表达水平显著提高(.图)这些结果表明.处理细胞 时细胞内精氨酸代谢发生了最明显的改变后续以处理 进一步探究.巨噬细胞葡萄糖代谢和表型变化图 猪舍.对/细胞活力()及细胞外 含量()的影响().()()/.图 猪舍.对/细胞 浓度(、)和精氨酸酶活性(、)的影响().()()/.图 猪舍.对/细胞()和()基因相对表达水平的影响().()()/南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 猪舍.对/细胞/值的影响()./.对/细胞糖酵解的影响在糖酵解中 分子的葡萄糖最后分解生成 分子的乳酸通过测定葡萄糖的消耗()和乳酸的生成量()计算/值 结果表明与对照组相比/值随.处理浓度的增加而升高.组显著增加(.图).处理 后细胞 和 相对表达水平显著提高(.图)图 猪舍.对/细胞内糖酵解相关基因相对表达水平的影响()./.对/细胞内炎症相关基因表达的影响如图 所示:.处理细胞 细胞内 和 相对表达水平升高其中 组显著提高了 表达水平(.)图 猪舍.对/细胞内 和 相对表达水平的影响()./图 猪舍.对/细胞内 和 相对表达水平的影响()./.对/细胞内不同巨噬细胞表型标志物基因表达的影响如图 可知:随着.处理浓度的升高细胞内 表达水平有一定的提高但是差异不显著(.).处理 表达显著受到抑制(.)第 期沈家鲲等:猪舍空气细颗粒物对猪肺泡巨噬细胞精氨酸代谢和糖酵解的影响.对/细胞内 信号通路相关蛋白和基因表达水平的影响免疫组化检测结果表明.处理 后/细胞内 的荧光强度随.浓度升高而逐渐增强(图、.)细胞内 和 表达水平显著提高(.图、)这些结果表明.处理后/细胞内的 信号通路被激活图 猪舍.对/细胞内 信号通路相关蛋白荧光强度(、)和基因(、)相对表达水平的影响().()()/讨论细胞内精氨酸代谢的改变是巨噬细胞极化中一个重要的过程 本课题组前期研究发现猪舍.促进了巨噬细胞向 型发生极化诱导原代 内 的大量产生降低了精氨酸酶活性 这说明 的精氨酸代谢在.处理后发生明显的改变这一现象在前人的研究中也得到了证实 等发现.处理小鼠巨噬细胞能够产生大量 同时精氨酸酶活性降低 等比较了 和.对小鼠肺泡巨噬细胞的影响发现与 相比.诱导了 炎症表型调控 产生的 增加而调节精氨酸酶活性的 表达减少 等进一步在基因和蛋白水平上发现.增加了巨噬细胞内 等 极化标志物的表达促进了 极化 等通过长期对小鼠鼻腔内滴注颗粒物发现气管周壁和肺泡壁出现明显的嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润 和 的表达增加 在巨噬细胞精氨酸代谢中 和 通过竞争共同的底物 精氨酸而影响彼此活性 在本试验中我们观察到.处理显著提高肺泡巨噬细胞 的产生提示 活性的升高与此同时细胞内精氨酸酶活性降低在基因水平上细胞内 表达显著提高但 表达无明显变化以上结果提示猪舍空气.诱导的精氨酸代谢改变是以高表达 和产生大量 为特征同时通过底物竞争抑制精氨酸酶活性在本试验中随着.处理时间的延长.诱导的 高分泌在 后逐渐降低这一结果应引起关注 有研究报道对比单次暴露.多次暴露.的小鼠炎症反应和氧化应激反应更高 在细胞模型中重复暴露.会诱导肺上皮细胞()表观遗传沉默可能诱发肺癌的发生但单次.处理并没有观察到这一现象 巨噬细胞的极化是一个动态事件随着微环境的不断改变而变化在促炎表型和抗炎表型之间不断转换 结合这几点推测在体外试验中单次.处理对巨噬细胞的极化影响可能是有限的.诱导的巨噬细胞 型极化可能需要多次处理来维持此外需要通过多次.处理和不同时间点相关指标测定来确定这一变化不同表型巨噬细胞具有截然不同的糖代谢方式 表型需要通过糖酵解快速提供能量 在活化的南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 表型巨噬细胞中丙酮酸被阻止进入三羧酸循环()从而有利于乳酸的产生乳酸被认为是糖酵解的标志物 此外当糖酵解通路被抑制时细胞内 和 会下调乳酸可能是连接糖酵解和炎症反应的重要物质 葡萄糖完全通过糖酵解途径完成代谢时/值是 本研究发现.的处理提高了/值提示.处理可能使存活的 葡萄糖代谢倾向于无氧糖酵解 在 等的研究中发现颗粒物激活小鼠巨噬细胞后葡萄糖代谢更加活跃并伴随着乳酸的增加但细胞活力无显著变化 上述研究结果提示/值能够更客观反映巨噬细胞糖酵解的变化 在炎症型巨噬细胞中 是葡萄糖的主要限速转运体 本研究结果表明不同浓度.均明显提高了 的表达这与 表型巨噬细胞的高葡萄糖转运相符因此猪舍空气.促进了猪肺泡巨噬细胞向 型巨噬细胞葡萄糖代谢的表征转化无氧糖酵解速度受到多种酶的调控己糖激酶()是无氧糖代谢中的主要限速酶 等用 激活巨噬细胞发现由 激活的巨噬细胞对葡萄糖的吸收增强此外巨噬细胞中 和 的表达分别增加了.和.倍表明巨噬细胞的葡萄糖代谢可能受到激活巨噬细胞极化的物质调节而不是极化状态的调节 甘油醛磷酸脱氢酶()是在真核细胞胞质中葡萄糖糖酵解的第 步发挥作用在活化的巨噬细胞中 是一种限速酶调节糖酵解的速度 上调糖酵解反应和增加 活性是巨噬细胞活化的重要特征 等发现抑制糖酵解通路中的 能够阻止巨噬细胞激活同时巨噬细胞炎症反应减轻 乳酸脱氢酶可逆地催化丙酮酸与乳酸之间的转换其主要由 个亚基 及 组成 对丙酮酸有较高的亲和力 表达提高对乳酸产生相当重要 等发现抑制巨噬细胞中的 能够减轻 诱导的炎症细胞乳酸水平降低炎症反应被抑制 在本试验中发现糖酵解通路中、以及 表达水平增加这些结果表明.诱导的巨噬细胞激活伴随着糖酵解的改变 是 巨噬细胞的关键调节蛋白 一方面在精氨酸代谢中 和 结合后激活 启动子区调控 的激活促进 的产生 另一方面 调控炎症因子的转录激活促进炎症发生 能够识别 经由 传递信号最后通过激活下游的 而发挥作用 在 激活的 表型中葡萄糖代谢从氧化磷酸化变成糖酵解 是 的主要亚基磷酸化 的水平可反映 信号通路的活化程度 等研究发现.处理小鼠巨噬细胞显著上调 蛋白水平 通路中的/值升高.诱导了 极化 本研究发现猪舍空气中的.激活 的 信号通路 这些结果说明 信号通路参与了猪舍空气.诱导的 极化 是调控.诱导巨噬细胞极化的潜在靶点综上所述猪舍空气.能够促进/细胞向 型巨噬细胞极化并呈现剂量依赖性.促进/细胞产生大量 表达上调并伴随精氨酸酶活力降低葡萄糖代谢中/值上升糖酵解相关基因、和 表达水平上调 信号通路被激活.促进猪肺泡巨噬细胞内精氨酸代谢和葡萄糖代谢向 型巨噬细胞的代谢特征转换参考文献:唐倩戴鹏远吴胜等.猪舍颗粒物对肺泡巨噬细胞功能的影响.畜牧兽医学报():.():().:.():.陈冠希刘明张宏福等.封闭式育肥猪舍内环境颗粒物对小鼠肺组织损伤的影响.中国畜牧杂志():.():().():./.:.:.:.:.第 期沈家鲲等:猪舍空气细颗粒物对猪肺泡巨噬细胞精氨酸代谢和糖酵解的影响 .():.阮静瑶陈必成张喜乐等.巨噬细胞/极化的信号通路研究进展.免疫学杂志():./.():()./.:.沈家鲲唐倩崔洋洋等.猪舍细颗粒物促进猪原代肺泡巨噬细胞向 极化.畜牧兽医学报():.():().陈莎娜鲜敬荣王娟等.探讨髓系白血病细胞株糖酵解表型特征.中国细胞生物学学报():.():().:.():./.():.():.:.():.加慧夏书月寇新荣等.单次及多次暴露对大鼠肺组织的急性损伤及可能机制.重庆医科大学学报():.():().():.():.():.:.():.(.).():.:().():.:.():.():.:.():.:.:.(/):.:.():.():.责任编辑:周广礼