棕榈酰三肽-8脂质体的制备及在化妆品中的应用.pdf

原料与配方2023年8月第4期Aug.2023,No.4香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS66www.ffc-www.ffc-收稿日期：2022-07-27；修回日期：2022-10-20作 者深圳市维琪医药研发有限公司，广东深圳 518000 彭 晏 丁文锋#赵文豪 莫敏慧棕榈酰三肽-8 脂质体的制备及在化妆品中的应用摘 要通过高压均质技术制备得到高含量（质量分数0.1%）棕榈酰三肽-8脂质体，考察其在皮肤表皮层的渗透率，并研究棕榈酰三肽-8脂质体的修复作用。试验发现，该脂质体粒径均一，粒径范围在10 100 nm，稳定性好，显著改善其在水溶液中的溶解度，同时提高棕榈酰三肽-8透过角质层到达表皮的比例，并产生缓释长效作用。人体试验结果表明，使用添加质量分数3%棕榈酰三肽-8脂质体的精华，受试者的经表皮水分流失（TEWL）在1天内减少了21.4%，皮肤含水量在1 h内增加39.58%，说明其具有良好的皮肤屏障修复作用。关键词棕榈酰三肽-8 化妆品 高压均质 脂质体 修复作用Preparation of Palmitoyl Tripeptide-8 Liposome and Its Application in CosmeticsPENG Yan DING Wenfeng#ZHAO Wenhao MO Minhui(Shenzhen Winkey Pharmaceutical R&D Co.,Ltd.,Shenzhen 518000,Guangdong,China)Abstract:High-content(0.1%in mass)palmitoyl tripeptide-8 liposome was prepared by high-pressure homogenization technology,and the permeability and repair effect of palmitoyl tripeptide-8 liposome in the skin epidermis were investigated.Results have found that the liposome has a uniform particle size in the range of 10-100 nm.It has good stability and can significantly improve its solubility in aqueous solutions.At the same time,it increases the ratio of palmitoyl tripeptide-8 to the epidermis through the stratum corneum,and produces a slow-release and long-acting effect.The results of human trials showed that using the serum with 3%(mass fraction)palmitoyl tripeptide-8 liposomes,the subjects transepidermal water loss(TEWL)value decreased by 21.4%within 1 d,and the skin water content increased 39.58%within 1 h,indicating its good repair effect on skin barrier.Keywords:palmitoyl tripeptide-8 cosmetics high-pressure homogenization liposome repair effect脂质体是最广为人知的药物递送系统，是直径在 25 1 000 nm 的人造球形亚显微囊泡。囊泡有两亲性分子组成，具有独特的亲水基团和亲油基团 1。脂质体具有和生物膜相似的结构，这种相似性使脂质体对正常的组织和细胞无损性和抑制作用，具有亲和性和组织相容性，因而脂质体作为活性成分的载体在化妆品领域具有广阔的应用前景 2。棕榈酰三肽-8 通过与黑素皮质素受体-1（MC1-R）结合，减少由紫外线 B（UVB）照射所引起的炎症细胞因子 IL-8 的释放 3，在敏感肌肤的护理方面有很好的应用。在角质细胞中，棕榈原料与配方彭 晏，等作 者 简 介彭晏（1980），女，硕士，主要从事分析化学工作。#通信作者：丁文锋（1976），博士，副主任药师，主要从事化妆品多肽原料的开发工作。联系电话：[phone]Email:ponywinkey-DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2022.0175第 4 期原料与配方67www.ffc-酰三肽-8 能够抑制 IL-1 诱导的 IL-8 的产生，这表明棕榈酰三肽-8 可以抑制炎症级联反应的前期步骤。棕榈酰三肽-8 具有高度特异的抗炎活性 1，可以有效地预防和减缓由化学刺激引发的症状，特别适用于敏感与不耐受性肌肤的护理，缓解血管扩张，预防和减少外部刺激，缓解瘙痒、刺痛、红斑、水肿等症状，维持正常皮肤屏障的健康状态。屏障受损是指角质层屏障受损 4，意味着内源性水源散发增加和对外界通透性增加。皮肤屏障受损后，经皮水分流失（TEWL）值越高则皮肤屏障功能受损越严重，反之 TEWL 值越低，皮肤屏障功能越好 5。Resende 等 3对 88 种跨国品牌的敏感肌面部化妆品进行成分分析，发现 17%的产品均添加了肽成分，其中棕榈酰三肽-8 的相对使用率排名第二。Loing 6在体外模型研究中，发现棕榈酰三肽-8 对 UVB 照射的角质形成细胞中的 IL-8 显示出高达 32%的抑制作用。临床测试已表明棕榈酰三肽-8 对十二烷基硫酸钠（SDS）引起的皮肤温度升高现象平均减少 78%，减少皮肤发红，能够预防和缓解刺激性反应。采用甘油、辛酸/癸酸甘油三酯、卵磷脂、棕榈酰三肽-8 作为主要成分，制备高含量棕榈酰三肽-8 脂质体并应用到化妆品中。解决了游离的棕榈酰三肽-8 水溶性较差、在产品中容易析出、消费者使用体验严重下降的问题，提高了棕榈酰三肽-8 在水溶液中的溶解度，改善了透皮吸收率。考察了棕榈酰三肽-8 脂质体的制备方法和应用到化妆品中的舒缓、修复屏障效果。采用人体试验结合仪器测量的方法，对该脂质体的保湿性 7和屏障修复功效进行评价，为棕榈酰三肽-8 脂质体在化妆品中的应用提供理论依据。1 试验部分1.1 主要试剂与仪器棕榈酰三肽-8 粉末，深圳市维琪医药研发有限公司；GTCC（辛酸/癸酸甘油三酯），巴斯夫（中国）有限公司；CO40（PEG-40 氢化蓖麻油），巴斯夫（中国）有限公司；甘油，斯文化工（香港）有限公司；卵磷脂 PC50、1,2-戊二醇、1,2-己二醇，朗盛化学（中国）有限公司；DL-Tocopheryl acetate（维生素 E），帝斯曼（中国）有限公司。试验用巴马香猪皮，中国科学院动物研究所北方大动物研究基地；SPF 白莱航鸡（white Leghorn chicken）受精鸡胚，新兴大华农禽蛋有限公司 SPF 级实验动物中心。T25 型均质器，IKA 集团；JN-02HC 型高压纳米均质机，广州聚能纳米生物科技股份有限公司；Malvern Zetasizer Nano ZS90 型 zeta 电位分析仪，马尔文帕纳科有限公司；LC-20AT 型高效液相色谱仪，岛津公司；Tewameter TM Hex 型经表皮水分流失测试仪，德国 CK 集团；Finn Chambers AQUA 型斑试器，美国 Smartpractice 公司。1.2 试验方法1.2.1 空白脂质体的制备称取卵磷脂、GTCC、CO40、1,2-戊二醇、1,2-己二醇、维生素 E，于 75 恒温水浴搅拌至完全溶解；加入纯化水（水温约 90 ）搅拌溶解完全，在 75 恒温水浴搅拌均匀，加入甘油，搅拌均匀（搅拌时间 t 10 min、转速 40 50 r/min）。使用均质机对混合相溶液进行微米级处理，均质机转速 7 000 r/min，均质时间 1 min，制得微米级粗乳。使用高压均质机对微米级粗乳进行纳米级处理，将恒温循环水泵调节至 25 ，均质压力 500 bar（5104 kPa），均质 3 个循环，可制备得到空白脂质体。1.2.2 棕榈酰三肽-8 脂质体的制备油相：卵磷脂、GTCC、CO40（总添加质量的 50%）、戊二醇、己二醇、VE，于 75 恒温水浴搅拌至完全溶解。称取棕榈酰三肽-8 粉末和配方剩余 50%CO40，分别加入纯化水（水温约90 ）搅拌超声溶解完全。混合相 I：在 75恒温水浴搅拌下，将前面已溶好的棕榈酰三肽-8 和CO40 缓慢加入到油相中，搅拌均匀（搅拌时间t 10 min）；再加入甘油，搅拌均匀（搅拌时间t 10 min、转速 40 50 r/min）。微米级粗乳及高压均质步骤与空白脂质体制备相同，制得棕榈酰三肽-8 脂质体。1.2.3 舒缓保湿精华的配制舒缓保湿精华配方见表 1，将制得的质量分数为 0.1%的棕榈酰三肽-8 脂质体应用到化妆品中去。将 A 相在 80 90 下加热搅拌至溶解透明；B 相预分散均一无颗粒；A 相加热溶解后，对其进行均质，500 r/min，2 3 min；再将 B 相加至 A相中，持续搅拌；搅拌降温至 35 40 ，将 C 相和 D 相加至（A+B）相中，搅拌均匀，即可得到舒缓保湿精华。彭 晏，等：棕榈酰三肽-8脂质体的制备及在化妆品中的应用原料与配方2023 年 8 月香料香精化妆品68www.ffc-www.ffc-1.2.4 稳定性用 1.2.2 工艺制备 3 批棕榈酰三肽-8 脂质体样品，分别放置在 40、25、4 8 下，观察样品性状、含量是否有变化；分别于 0、1、2、4、6月取样测定；若无，可视为稳定性良好。1.2.5 鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）血管试验（1）称取 0.9 g 氯化钠，加 100 mL 纯化水溶解，制备得生理盐水；棕榈酰三肽-8 脂质体用生理盐水进行稀释，制备得质量分数 3%棕榈酰三肽-8脂质体溶液；称取 1.0 g 丙烯酰胺，加 9.0 g 水溶解，制备为质量分数 10%丙烯酰胺溶液。（2）选择 10 11 d 胚龄的鸡胚，用照蛋器照看标记气室位置，用镊子剥去气室上层的蛋壳部分，暴露白色的卵壳膜，滴加适量生理盐水使卵壳膜湿润。在血管密集处放置特氟龙环，分别取40 L 的待测样品至置环内，在恒温恒湿箱内培养 30 min 后，评价并记录特氟龙环内血管损伤情况。根据 CAM 8的血管反应作出评分，每个测试样品做3 10枚有效鸡胚，记录样品的刺激性分值，按下列式子算出加权平均值，该平均值即为 NC 值（正常使用浓度刺激值）。NC=（n1 2n2 3n3 4n4 5n5 in）/n其中，n为该组对应评分（NC）的鸡胚个数，n 为该组鸡胚总数。NC 值：根据 CAM 血管效应对应的现象做出评分，取平均值，确定刺激性大小。刺激性评判标准如表 2 所示。表 1 舒缓保湿精华配方类别原料名称质量分数/%A 相水85.00丁二醇2.00Aristoflex AVC（丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP 共聚物）0.20B 相透明质酸钠（相对分子质量 1.2106 1.4106）0.10透明质酸钠（相对分子质量 2105 4105）0.10甘油2.00C 相-葡聚糖3.00甜菜碱0.10泛醇1.001,2-戊二醇2.001,2-己二醇0.50D 相棕榈酰三肽-8 脂质体3.00表 2 刺激性评判标准评分表现备注0 NC 2无损伤性刺激应激性刺激，此时毛细血管未有出血损伤。2 NC 3轻微刺激轻微损伤性刺激，此时毛细血管出现轻微性出血损伤。3 NC 5中度刺激较为严重的损伤性刺激，此时毛细血管出现较为严重的出血损伤，可能为不可逆损伤。NC 5严重刺激极为严重的损伤性刺激，此时毛细血管大面积出血，且出血量较大，为不可逆损伤。1.2.6 粒径/zeta 电位的测定用 1.2.2 工艺制备 3 批棕榈酰三肽-8 脂质体样品，用马尔文粒度分析检测仪检测测试样品，zeta 电位采用电泳光散射法测定结果在所需范围取平均值。1.2.7 皮肤吸收体外试验参考 GB/T 278182011化学品皮肤吸收体外试验方法 9进行。以乳猪皮为载体，将其固定在 Franz 扩散池的供给室和接收室之间，将扩散池固定于透皮吸收扩散仪中，在开启磁搅拌子和恒温水浴的情况下，向室中皮肤表面加入不同样品进行透皮试验。图 1 为 Franz 扩散池模型，采用垂直式 Franz 扩散池法 10进行离体猪皮的透皮试验。图 1 Franz 扩散池模型（1）以棕榈酰三肽-8 脂质体为试验组；等含量未经乳化包裹的棕榈酰三肽-8 溶液为对照组。取皮肤厚度约 0.8 1 mm、面积为 20 cm30 cm扩散池接收池磁力搅拌子金属夹皮肤模型第 4 期原料与配方69www.ffc-的 1 月龄雄性巴马香猪腹部及背部皮肤，固定于Franz 扩散池的接受室和供应室之间，分别取 1 mL的试验组和对照组样品于供应室中，以 0.01 mol/L PBS 缓冲液为接收液，32 下 300 r/min 搅拌扩散。于 0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 取 0.6 mL 接收液，同时补充 0.6 mL 接收液。待 24 h 后，取下皮肤，用超纯水洗去样品残液后剪碎，转入组织匀浆器中充分研磨成匀浆液，加 1 mL 甲醇提取，微孔滤膜过滤后进 HPLC 分析，计算得皮肤中棕榈酰三肽-8 的滞留量。（2）HPLC 方法检测棕榈酰三肽-8 含量，采用 Superb C18（250 mm4.6 mm5 m）液 相 色谱柱，流动相为乙腈（含体积分数 0.09%三氟乙酸）和体积分数 0.1%三氟乙酸溶液（体积比为 8020），流速 1 mL/min，进样量 10 L，柱温35 ，检测波长为 215 nm。1.2.8 人体功效测试（1）TWEL 测试方法志 愿 者 年 龄 分 布 为（283）岁，实 际 统计人数 15 人；每个志愿者统计前臂斑试器区域TEWL 11情况，对测量值包括数量、均值、标准差、最小值、最大值等进行统计。进行单因素方差分析，显著性差异水平 a 取 0.05。（2）建立皮肤屏障受损模型将 25 L 质量分数为 3%的 SDS 溶液注入斑试器小室内，浸润滤纸片，用低致敏胶带贴敷于受试者左臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续 24 h。去除斑试器后，受试者在符合标准的测试环境中静坐 30 min，测量各斑贴区域中心位置的 TEWL 值，每区域测量 3 次，测量结果以单个斑贴区域 TEWL 值的平均值表示，做为第 0 天（day 0）的初始值。在搭建好造模区域后，对志愿者进行分组：BLANK 测试组（不置任何物质的自然皮肤组）；3%SDS 测试组（3%SDS）；3%SDS A 测试组（3%SDS 3%棕榈酰三肽-8 脂质体精华）；3%SDS B 测试组（3%SDS 安慰剂，安慰剂指未添加棕榈酰三肽-8 脂质体的精华基质配方），以上均为质量分数。当日开始志愿者每天早晚在斑试器相应位置涂抹产品 1 g。并分别于使用产品后第 1 天（day 1）、第 3 天（day 3）进行TEWL 测定。（3）结果判定TEWL 代表经皮水分散失率，TEWL 值越高，代表单位时间、单位横截面积的经表皮水分流失量越多，皮肤屏障功能越差；TEWL 值越低，代表单位时间、单位横截面积的经表皮水分流失量越少，皮肤屏障功能越好。TEWL 代表经皮水分散失率改善值。2 结果与讨论2.1 稳定性棕榈酰三肽-8 脂质体的 3 批测试样品性状为棕黄色透明溶液；在 40 、6 个月后性状为棕黄色轻微浑浊溶液，肽含量有降低；在4和25 下，6 个月后性状和肽含量无明显变化。2.2 CAM 血管刺激性分析激性分析检测结果如表 3 所示，阴性对照生理盐水的 NC 评分为 0，无刺激性。阳性对照质量分数 10%丙烯酰胺为严重刺激，NC 值为 6.5，此时毛细血管出现较为严重的损伤性刺激，毛细血管大面积出血，且出血量较大，为不可逆损伤。质量分数 3%棕榈酰三肽-8 脂质体溶液的 NC 评分为 0，无刺激性。表 3 刺激性分析检测结果样品名称质量分数/%NC结果生理盐水0.90无刺激丙烯酰胺106.5严重刺激棕榈酰三肽-8 脂质体溶液30无刺激性2.3 粒径/zeta 电位分析由图 2、3 棕榈酰三肽-8 脂质体表征结果可知，棕榈酰三肽-8 脂质体工艺重复性良好，粒径分布只有一个峰，符合 10 200 nm 要求，zeta 电位 0 mV，粒径分布情况呈良好的正态分布。2.4 皮肤吸收体外试验分析（1）累计透过曲线根据 HPLC 分析结果计算各样品药物浓度，按以下公式计算不同取样时间的单位面积药物累计透过量。QACVCVnniiin11#=+=-h/其中，Qn为单位面积累计渗透量，Cn为第 n次测得扩散池中药物浓度，Ci 为第 i 次取样点药物质量分数，V 为扩散池体积，Vi为取样体积，A彭 晏，等：棕榈酰三肽-8脂质体的制备及在化妆品中的应用原料与配方2023 年 8 月香料香精化妆品70www.ffc-www.ffc-图 6 （a）皮肤 TEWL 值分析（“*”表示与 3%SDS 测试组 day 0 相比较，*P 0.05；“#”表示与 3%SDS A 测试组 day 0 相比较，#P 0.01，#P 0.001；“”表示与 3%SDS+B 测试组 day 0 相比较，P 0.05，P 0.001）；（b）TEWL 统计结果分析（“*”表示与 3%SDS 测试组相比较，*P 0.01；“#”表示与 3%SDS B 测试组相比较，#P 0.05）（n=15）5.16%5.16%21.41%*#14.66%45.50%50.40%44.76%5.33%BLANK3%SDS3%SDS+A3%SDS+BTEWL/%10.000 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00（b）Day 1Day 310.3833.2434.71BLANK3%SDS3%SDS+A3%SDS+B32.7710.8129.6726.60#27.439.6217.71*15.41#17.06TEWL/g (cm2 h)16050403020100Day 0（a）Day 1Day 3为渗透面积 12。以单位面积累计渗透量为纵坐标，时间为横坐标，绘制药物累积透过曲线。由图 4 所示，游离态的棕榈酰三肽-8 及其脂质体在 24 h 内，接受液里的棕榈酰三肽-8 含量均为 0，表明 2 个试验样品中的棕榈酰三肽-8 均不能透过巴马香猪的全皮层，无法穿过真皮层到达皮下组织，即不产生全身性作用，药理作用仅发生在给药位置，提示棕榈酰三肽-8 脂质体不会导致原料产生全身毒性风险。的 3 倍以上，说明棕榈酰三肽-8 脂质体能显著提高棕榈酰三肽-8 的透皮能力，且二者皆不会透过真皮层至皮下组织。图 2 棕榈酰三肽-8 脂质体粒径分布图 3 棕榈酰三肽-8 脂质体 zeta 电位分布图 4 棕榈酰三肽-8 脂质体累积透过曲线图 5 棕榈酰三肽-8 脂质体皮肤滞留比01682442012单位面积累计渗透量/（mg cm 2）时间/h210 1游离棕榈酰三肽-8 溶液棕榈酰三肽-8 脂质体进入皮肤的棕榈酰三肽-8/%50.0040.0030.0020.0010.000.00棕榈酰三肽-8 脂质体游离棕榈酰三肽-82.5 人体功效测试分析图 6（a）结果显示，给与 SDS 刺激后，与BLANK 测试组相比，皮肤屏障受损严重；与自身 使 用 前 相 比，在 day 1、day 3，3%SDS 测 试0.11101001 00010 0002520151050粒径/nm强度/%zeta 电位/mV 1000100200100 00080 00060 00040 00020 0000总数（2）滞留量以分析所得皮肤中的药物滞留量与给药量之比为纵坐标作图。如图 5 所示，匀浆皮肤后的滤液中，棕榈酰三肽-8 脂质体组滞留比为 40.87%，游离组滞留比为 12.17%。与游离棕榈酰三肽-8 相比，脂质体形式的棕榈酰三肽-8 将滞留量提高了 235.82%，结果表明棕榈酰三肽-8 脂质体的透皮量为游离形式第 4 期原料与配方71www.ffc-皮性能、缓释能力和生物利用率，使其可最大程度地保留在皮肤中，从而有效地发挥功效，尤其是能够通过皮肤局部涂抹实现透皮吸收。参考文献 李秀英,曾凡,赵曜,等.脂质体药物递送系统的研究进展J.1 中国新药杂志,2014,23(16):1904-1911,1917.代旭栋,李云,李双双,等.皮肤外用脂质体的研究进展 J.2 国际药学研究杂志,2020,47(11):914-921.RESENDE D I S P,FERREIRA M S,SOUSA-LOBO J M,3 et al.Usage of synthetic peptides in 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测试组相比，day 1 样品组的 TEWL 改善明显（TEWL=21.4%，P 0.01或 P 0.05）。使用 3%棕榈酰三肽-8 于 1 天后即可明显下调 TEWL，改善皮肤红斑现象（见图 7），达到快速修护皮肤屏障功效。彭 晏，等：棕榈酰三肽-8脂质体的制备及在化妆品中的应用3 结论（1）制备含质量分数 3%棕榈酰三肽-8 脂质体的精华，志愿者临床测试试用 1 天，TEWL 降低了 21.4%，说明棕榈酰三肽-8 脂质体具有良好的屏障修护效果。（2）以卵磷脂为载体，采用油脂与非离子表面活性剂复配，制备工艺简单，安全性、稳定性都达到要求。将棕榈酰三肽-8 稳定地包裹在磷脂内，可以很好地应用于化妆品中。（3）该脂质体大大提高了棕榈酰三肽-8 的透