1-辛烯-3-醇对禾谷镰刀菌的抑制活性及作用机理.pdf
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1、生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 931-辛烯-3-醇对禾谷镰刀菌的抑制活性及作用机理钱沈安1,胡 政2,于伊楠3,孟佳佳2,张志岐2,黄晴雯2,赵志辉2,聂冬霞2,韩 铮1,2,3,范 楷2,*(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海 201403;3.上海理工大学健康科学与工程学院,上海 200093)摘要:以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)PH-1为研究对象,研究1-辛烯-3-醇熏蒸对菌株生长和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)生物合成的抑制作用,并通过考察
2、其对镰刀菌细胞膜完整性、氧化应激水平以及DON合成关键基因表达等的影响,探讨可能涉及的抑制机理。结果表明,1-辛烯-3-醇熏蒸处理能显著抑制镰刀菌的菌落生长、孢子萌发和DON合成(P0.05),并呈现剂量依赖效应。100 L/L(空气计)的1-辛烯-3-醇熏蒸7 d后,菌落直径、孢子萌发和DON产量的抑制率分别为60.70%、100.00%和97.50%。进一步实验发现1-辛烯-3-醇熏蒸处理有效破坏了禾谷镰刀菌细胞膜完整性和细胞膜通透性,造成麦角固醇含量下降,细胞内容物严重泄漏;此外,1-辛烯-3-醇可导致禾谷镰刀菌氧化应激平衡受到改变,TRI4、TRI5、TRI8、TRI10、TRI12和
3、TRI101等DON合成关键基因显著下调。综上所述,1-辛烯-3-醇能有效抑制禾谷镰刀菌菌丝生长、孢子萌发和DON生物合成,主要通过影响细胞膜完整性、引起氧化应激和调控相关基因表达等产生抑制作用。关键词:1-辛烯-3-醇;禾谷镰刀菌;脱氧雪腐镰刀菌烯醇;抑制机理Inhibition Activity and Mechanism of 1-Octen-3-ol on the Growth and Deoxynivalenol Biosynthesis of Fusarium graminearumQIAN Shenan1,HU Zheng2,YU Yinan3,MENG Jiajia2,ZHAN
4、G Zhiqi2,HUANG Qingwen2,ZHAO Zhihui2,NIE Dongxia2,HAN Zheng1,2,3,FAN Kai2,*(1.College of Food Science&Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Institute for Agro-food Standards and Testing Technology,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 201403,China;3.School of Heal
5、th Science and Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China)Abstract:The inhibitory effect of fumigation with 1-octen-3-ol against the growth and deoxynivalenol(DON)biosynthesis of Fusarium graminearum PH-1 was determined,and the possible mechanism involved was
6、 investigated by evaluating cell membrane integrity,oxidative stress level and the expression of key genes related to DON biosynthesis.The results showed that 1-octen-3-ol significantly inhibited the mycelial growth,spore germination and mycotoxin production of F.graminearum in a concentration-depen
7、dent manner(P 0.05).After 7 days of fumigation with 100 L/L 1-octen-3-ol,the inhibition rates of mycelial growth,spore germination and deoxynivalenol production were 60.70%,100.00%and 97.50%,respectively.Further studies showed that 1-octen-3-ol treatment effectively damaged the cell membrane integri
8、ty and increased the membrane permeability of F.graminearum,leading to a significant reduction of ergosterol levels and serious leakage of cell contents.Moreover,1-octen-3-ol interfered with the oxidative stress balance of F.graminearum and downregulated the expression of DON biosynthesis-related ge
9、nes such as TRI4,TRI5,TRI8,TRI10,TRI12,and TRI101.In conclusion,1-octen-3-ol can effectively inhibit the growth and DON biosynthesis of F.graminearum by damaging cell membrane integrity,interfering with oxidative stress balance and regulating key gene expression.Keywords:1-octen-3-ol;Fusarium gramin
10、earum;deoxynivalenol;inhibitory mechanismDOI:10.7506/spkx1002-6630-20221223-227中图分类号:TS201.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)18-0093-09收稿日期:2022-12-23基金项目:国家自然科学基金面上项目(32272442)第一作者简介:钱沈安(1998)(ORCID:0000-0001-9448-7419),男,硕士研究生,研究方向为农产品质量安全。E-mail:*通信作者简介:范楷(1983)(ORCID:0000-0002-3649-5039),男,副研究员,博士,研
11、究方向为农产品质量安全。E-mail:94 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程引文格式:钱沈安,胡政,于伊楠,等.1-辛烯-3-醇对禾谷镰刀菌的抑制活性及作用机理J.食品科学,2023,44(18):93-101.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221223-227.http:/QIAN Shenan,HU Zheng,YU Yinan,et al.Inhibition activity and mechanism of 1-octen-3-ol on the growth and deoxynivalenol biosynthesis of Fus
12、arium graminearumJ.Food Science,2023,44(18):93-101.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221223-227.http:/禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是镰刀菌属的重要真菌,可侵染小麦、大麦等禾谷类作物,引起赤霉病等严重的真菌病害1。禾谷镰刀菌不仅影响作物产量和质量,造成巨大的经济损失,其产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等真菌毒素,具有急性毒性(腹泻、呕吐、直肠出血等)和慢性毒性(厌食、体重减轻、发育不
13、良等),严重威胁食品安全和人畜健 康2。目前,我国常采用多菌灵、戊唑醇等化学杀菌剂来控制禾谷镰刀菌生长和DON产生,但这些人工合成杀菌剂的长期使用可能导致环境污染、菌株耐药性增强、引入新的食品安全风险等一系列问题。因此,寻求和开发高效、安全、环保的新型抑菌剂迫在眉睫。近年来,天然植物成分因其具有抑制效率高、效果稳定、可降解、毒性低、不改变食品口味和营养价值等优势,已逐渐成为当前真菌毒素防控研究的新趋势3。1-辛烯-3-醇,又名蘑菇醇,是主要存在于植物和菌类中的一种脂肪族不饱和醇。1-辛烯-3-醇毒性低、对环境无污染,已被列入我国食品添加剂目录4,在食品及香精中均有广泛使用。作为信号分子,1-辛
14、烯-3-醇主要参与植物细胞防御反应,在植物-草食动物相互作用和植物-植物相互作用中发挥作用5。此外,研究表明1-辛烯-3-醇对多种细菌及真菌均表现一定的抑菌活性,如Xiong Chuan等6发现1-辛烯-3-醇对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等细菌均表现较强的抑菌活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的最低抑菌浓度(minimum inh
15、ibitory concentration,MIC)分别为1 mg/mL和 2 mg/mL;Berendsen等7研究表明1-辛烯-3-醇可以抑制菌生轮枝孢(Lecanicillium fungicola)的孢子萌发,而有效控制该真菌所引起的蘑菇干泡病;Yin Guohua8和Chitarra9等则分别证实1-辛烯-3-醇可以抑制产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和酒青霉(Penicillium paneum)等青霉菌的孢子萌发和产孢。然而,目前对 1-辛烯-3-醇的研究仅集中在抑制真菌生长上,而对真菌毒素产生情况的影响还不清楚,其抑菌机制也有待深入;此外,1-辛烯-3
16、-醇对镰刀菌的抑制作用也尚鲜见报道。本实验研究1-辛烯-3-醇对禾谷镰刀菌生长以及DON生物合成的抑制作用,在此基础上通过测定细胞膜完整性/通透性、细胞内容物释放量、麦角甾醇含量、氧化应激状态和关键基因表达量等探讨可能的作用机理,以期为将1-辛烯-3-醇开发为新型天然抑菌剂提供理论依据,为农产品和食品中禾谷镰刀菌和DON的污染防控提供新的思路。1 材料与方法1.1 材料与试剂禾谷镰刀菌PH-1 美国典型菌种保藏中心。1-辛烯-3-醇 上海国药集团化学试剂有限公司;DON标准品(纯度大于99%)美国Romer公司;过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽还原酶(glutathione r
17、eductase,GR)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;葡萄糖、琼脂 上海源叶生物科技有限公司;乙腈、甲醇、乙酸铵(均为色谱纯)美国Merck公司。马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基:马铃薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,琼脂20 g/L;马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,PDB)液体培养基:马铃薯200 g/L,葡萄糖20 g/L;羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose,CMC)培养基:羧甲基纤维素15 g/L,NH4NO3 10 g
18、/L,MgSO47H2O 0.5 g/L,KH2PO4 1 g/L,酵母提取物1 g/L;Trichothecene biosynthesis induction(TBI)产毒培养基:KCl 0.5 g/L,精氨酸0.871 g/L,KH2PO4 1 g/L,MgSO47H2O 0.5 g/L,FeSO47H2O 0.01 g/L,蔗糖30 g/L,微量元素溶液(柠檬酸50 g/L,ZnSO46H2O 50 g/L,NaMoO42H2O 0.5 g/L,CuSO45H2O 2.5 g/L,MnSO4 0.5 g/L,H3BO3 0.5 g/L)200 L/L。1.2 仪器与设备UPLC XEV
19、O TQ-S超高效液相色谱(ultra-high performance liquid chromatography,UPLC)仪美国 Waters公司;TRIPLE QUADTM 5500三重四极杆质谱(mass spectrometry,MS)仪美国AB SCIEX公司;HSC-24B氮吹仪上海楚定分析仪器有限公司;Milli-Q超纯水仪美国Millipore公司;AL104分析天平 生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 95瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司;SK8210LHC超声波清洗机上海科导超声仪器有限公司;SX-500高压灭菌锅日本TOMY公司;MGC-300H人工
20、气候箱 上海一恒科学仪器有限公司;GZX-CF101-2-BS电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械有限公司;Heraeus Multifuge X3高速离心机、Applied Biosystems 2720 Thermal cycler聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪美国Thermo Fisher公司;LightCycler 96荧光定量PCR仪瑞士Roche公司;Ni-E荧光显微镜日本尼康公司;UV-3300B紫外分光光度计上海美谱达仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 禾谷镰刀菌孢子悬浮液、菌丝的制备取活化后的镰刀菌菌丝,接种于CMC培养基,28
21、、150 r/min培养5 d后,无菌纱布过滤,血球计数板计数,将分生孢子的浓度调为107 个/mL左右,现用现制。将1 mL孢子悬浮液接种至PDB培养基,28、180 r/min摇培48 h后,8 000 r/min、4 离心5 min,弃上清液,无菌水洗涤3 次获得禾谷镰刀菌新鲜菌丝,备用。1.3.2 1-辛烯-3-醇对禾谷镰刀菌生长和DON合成的影响1.3.2.1 对菌落生长的抑制分别采用接触法和熏蒸法考察1-辛烯-3-醇对禾谷镰刀菌菌落生长的影响。接触法:量取适量1-辛烯-3-醇溶于含0.1%(V/V)Tween-20的超纯水,过滤除菌后加入PDA培养基,使得终含量为80、160、32
22、0、640、960、1 280、1 600 L/L,以未经处理的样品为对照。在预先活化的禾谷镰刀菌菌落边缘取直径5 mm的菌饼,接种于含1-辛烯-3-醇的PDA培养基中心,28 恒温培养7 d,十字交叉法测定菌落直径,每个处理重复3 次。熏蒸法:将直径5 mm的禾谷镰刀菌菌饼置于PDA培养基平板中央,把3 片直径5 mm吸附有1-辛烯-3-醇的灭菌滤纸均匀放置于平皿边缘,使培养皿中1-辛烯-3-醇含量为20、40、60、80、100 L/L(空气计,下同),以未经处理的样品为对照。培养皿用封口膜密封,放入自封袋,置于密封盒中,在28 下培养7 d,十字交叉法测定菌落直径,每个处理重复3 次。1
23、-辛烯-3-醇含量按下式计算:1-?-3-?/?L/L?1-?-3-?/L?/L(1)1.3.2.2 对孢子萌发的影响通过凹玻片法测定1-辛烯-3-醇对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响。在培养皿中加入7 mL无菌水,向凹玻片的凹孔中加入50 L的孢子悬浮液和50 L的1%葡萄糖溶液,把3 片直径5 mm、吸附有1-辛烯-3-醇的灭菌滤纸均匀放置于玻片边缘,使培养皿中含量为0.1、1、5、20、40 L/L,以未经处理的样品为对照,28 培养8 h后,光学显微镜(10)下观察孢子萌发情况,当孢子芽管长度超过孢子细端直径的一半时判定为已萌发,每个处理重复3 次。孢子萌发率的计算公式如下:?/%?100(2
24、)1.3.2.3 对DON生物合成的抑制作用将1-辛烯-3-醇熏蒸处理后的PDA培养基于50 烘箱干燥,粉碎混匀后,准确称取2 g样品于50 mL离心管,加入10 mL乙腈-水(84 16,V/V),旋涡振荡1 min,浸泡5 min后,超声提取1 h,4 000 r/min离心10 min,取5 mL上清液,在40 氮气吹干,1 mL的5 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇(80 20,V/V)溶解残渣,涡旋30 s后,适量稀释,过0.22 m滤膜,UPLC-MS/MS测定,每个处理重复5 次。将500 L孢子悬浮液添加到50 mL TBI产毒培养基中,置于250 mL锥形瓶,将1-辛烯-3-醇均
25、匀滴在滤纸并贴于锥形瓶内壁,使瓶中1-辛烯-3-醇含量为20、40、60、80、100 L/L,以未经处理的样品为对照。锥形瓶用封口膜密封,放入自封袋,于25、180 r/min培养7 d后,取培养适量稀释,过0.22 m滤膜,UPLC-MS/MS测定,每个处理重复5 次。色谱条件:色谱柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(100 mm3.0 mm,2.7 mm);流动相:流动相A为5 mmol/L乙酸铵溶液,流动相B为甲醇;梯度洗脱程序:00.5 min,10%A、90%B;0.54 min,10%90%A、90%10%B;44.5 min,90%A、10%B;
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