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医学博士科研计划书LncRNA-ANCR基因表达对大鼠退行性脊柱侧凸影响的实验研究退行性脊柱侧凸(degenerative scoliosis,DS)通常指机体骨骼成熟后出现的脊柱腰段的侧凸,冠状面 Cobb?角大于 10,同时可以存在矢状面失衡与/或脊椎的旋转异常。随着全球人口老龄化及老年人生活方式转变生活质量的一种腰椎退行性疾病。由于,DS 已成为导致脊柱畸形、影响DS 的具体病因还未明确解释,当前关于DS 的研究绝大多数就是针对治疗,涉及病因学方面的基础研究很少。因此,进一步研究 DS 的病因及发病机制具有非常重要的意义。长链非编码 RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)就是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。研究表明,LncRNA 在调控表观遗传、细胞周期与细胞分化等细胞分化与个体发育的生命活动中发挥重要作用,并与人类疾病的发生密切相关,其中,成为当前研究包括癌症、退行性疾病在内的多种严重危害人类健康的重大疾病热点。其中,ANCR(anti-differentiation ncRNA,抗分化 ncRNA)为一个 855 bplncRNA,在细胞分化期间下调。ANCR 在包含祖细胞群体中的减少,没有任何其她刺激,导致快速分化基因诱导。本研究正就是选择LncRNA-ANCR 这一基因,旨在通过研究该基因与大鼠间作用关系,为进一步从分子生物学水平研究关键环节上预防该类型疾病发生。参考文献(1)Dalle-Carbonare L,Innamorati G,Valanti MT.Transcription factor Runx2 and itsapplication to bone tissue engineeringJ.Stem Cell Rev,2012,8(3):891897、(2)Liu TM,IR EH Tran.scriptional regulatory cascades in Runx2 dependent bonedevelopmentJ.Tissue Eng Part B Rev,2013,19(3):254 263、(3)Lin Zhu,Pei-Cheng Xu,Downregulated LncRNA-ANCR promotes osteoblastdifferentiation by targeting EZH2 and regulating Runx2 expressionJ,BiochemicalDS 之DS 的发病机理,希望从发病的初始医学博士科研计划书and Biophysical Research Communications 432(2013)612 617、(4)Glass DA、Canonical Wnt signaling in differentiated osteoblasts controlsosteoclast differentiationJ.Dev Cell,2010,104(9):16702 16707、(5)刘锡梅,马越鸣,丁伯平等,大鼠两种骨质疏松模型的建立J、皖南医学院学报,2001,20(1):4-5、(6)刘晓阳,邱贵兴,翁习生等,长链非编码 RNA 在青少年特发性脊柱侧凸中的表达研究J、中国骨与关节外科,2014,3(7):235-240、(7)Daffner SD,Vaccaro AR、Adult degene rative lumbarscoliosis、Am J Orthop,2003,32(2):77-82、(8)Kretz M,Webster DE,Flockhart RJ?etc,Suppression of progenitor differentiationrequires the long noncoding RNA ANCRJ,Genes Dev、2012,26(4):338 343、(9)李慧章,叶君健。骨形态发生蛋白在椎间盘退变中的研究报,2005,39(1):53-55、(10)Cui M;Wan Y;Anderson DG、Mouse growth and differentiation factor-5 proteinand DNA therapy potentiates intervertebral disc cell aggregation and chondrogenicgene expressionJ、Spine Journal,2008,8(2):287-295、创新点:LncRNA 就是当前的研究热点,在癌症方面研究相对较多,本研究借此热点探讨LncRNA-ANCR 在大鼠 DS 发生发展过程中的作用。若探明 LncRNA-ANCR 与 DS 之间的作用关系,从而人为地调控 LncRNA-ANCR的作用机制,从早期防治 DS,为防治 DS 开辟一个新思路。实验设计与技术路线:1.重组 LncRNA-ANCR 腺病毒表达载体的构建、鉴定J、福建医科大学学医学博士科研计划书(1)根据 LncRNA-ANCR 前体序列应用 Primer premier 5 软件设计引物。(2)利用 PCR 技术扩增出 LncRNA-ANCR 前体的 DNA 序列。(3)LncRNA-ANCR 前体的 DNA 序列重组入腺病毒miRNA 表达载体。(4)应用 Lipofeetamine 2000将重组 LncRNA-ANCR 腺病毒表达载体与辅助包装质粒共转染如 293T 细胞进行病毒包装。(5)收集、浓缩、纯化与滴定重组LncRNA-ANCR 腺病毒。BMSCs 的细胞学研究2、重组 LncRNA-ANCR 腺病毒表达载体转染大鼠(1)大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、培养选取 2 月龄大鼠,无菌条件下获取自体骨髓,用 Ficoll 淋巴细胞分离液梯度离心法进行分离、培养,获得自体原代骨髓干细胞,传代培养。应用 CD45、CD34、CD29、CD105 单克隆抗体,FACS(流式细胞仪)检测 BMSCs 表面抗原表达。细胞分组:基因组:LncRNA-ANCR 载体转染的 BMSCs无关序列组:无关序列载体转染的BMSCs空载体组:空载体的 BMSCs空白对照组:无特殊处理的 BMSCs(3)检测 BMSCs 分化指标TaqMan RT-PCR与 Western-blot方法分别检测各组BMSCs 内 BMP7 mRNA、Runx2 mRNA 与 GDF5 mRNA 以及相应蛋白表达3、重组 LncRNA-ANCR 腺病毒表达载体对大鼠DS 的动物实验研究(1)实验动物:刚断乳的 SD 大鼠 50 只,分 5 组,每组 10 只。(2)实验分组:医学博士科研计划书空白对照组:无特殊处理模型组:仅双上肢截肢空载体组:双上肢截肢+注射空载体转染的BMSCs无关序列组:双上肢截肢+注射无关序列载体转染的BMSCs基因组:双上肢截肢+注射 LncRNA-ANCR 载体转染的 BMSCs(3)影像学观察测量大鼠脊柱形态变化(4)病理学:观察椎体与椎间盘病理变化(5)基因表达:TaqMan RT-PCR检测 BMP7 mRNA、Runx2 mRNA 与 GDF5 mRNA表达(6)蛋白表达:Westernblot检测 BMP7、Runx2 与 GDF5 蛋白表达预期目标与意义:成功构建与鉴定重组LncRNA-ANCR 腺病毒载体。将重组 LncRNA-ANCR 腺病毒载体转染到BMSCs 细胞中,阻断或显著抑制BMSCs 分化,最终导致大鼠发生DS。本研究如达到预期结果,可在国际核心学术期刊发表课题研究的阶段性安排:(1)2016.01-2016.05 完成载体的构建。(2)2016.06-2016.12 完成细胞学实验及动物学实验。(3)2017.01-2017.06 整理实验数据,写出论文总结,发表相关文章1-2 篇论文。