PCR引物设计原理资料PPT课件.ppt
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1、PCR引物设计原理1.PCRPCR反应一般由三个步骤组成反应一般由三个步骤组成:模板的热变性模板的热变性;引物复性到单链模板上引物复性到单链模板上;热稳定热稳定DNADNA聚合酶催化的聚合酶催化的延伸延伸2.3.变性变性p在应用在应用 Taq DNA Taq DNA 聚合酶进行聚合酶进行 PCR PCR 时,变性温时,变性温度在度在94-9594-95下进行,这也是下进行,这也是Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶进行进行3030个或个或3030个以上个以上PCRPCR循环而活力不受到过循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。多损失时能耐受的最高温度。p有时把变性时间设计为有时把变性时
2、间设计为 5min5min,以便大分子模,以便大分子模板板 DNA DNA 彻底变性的概率。彻底变性的概率。p对于对于 GC GC 含量为含量为 55%55%或更低的线性或更低的线性 DNA DNA 模板,模板,推荐推荐 PCR PCR 的变性条件是的变性条件是 94-95 94-95 变性变性45s45s。4.复性温度(复性温度(退火温度退火温度)至关重要)至关重要!退火温度太高,退火温度太高,引物不能与模板很好地复性,引物不能与模板很好地复性,扩增效率会非常低;扩增效率会非常低;退火温度太低,退火温度太低,引物将产生非特异性复性,从引物将产生非特异性复性,从而导致非特异性而导致非特异性DN
3、ADNA片段的扩增;片段的扩增;退火温度,通常比理论设计的引物和模板的退火温度,通常比理论设计的引物和模板的TmTm值值低低 3-5 3-5 下进行。下进行。最好通过对最好通过对复性温度复性温度比两条比两条引物的引物的Tm Tm 值低值低 2-2-10 10 内进行内进行PCRPCR预实验(梯度)来对复性条件预实验(梯度)来对复性条件的优化。的优化。引物和模板引物和模板DNA 的复性的复性5.对对 Taq Taq DNA DNA 聚合酶来说,最适温度为聚合酶来说,最适温度为72-78 72-78,时间约为,时间约为1min1min。引物的延伸引物的延伸与循环数目与循环数目哺乳动物哺乳动物 DN
4、A DNA 为模板时,至少进行为模板时,至少进行2525个循环个循环才能得到足够量的扩增产物。一般为才能得到足够量的扩增产物。一般为30-3330-33个个循环。循环。6.引物设计要点引物设计要点(1 1)碱基组成:)碱基组成:GCGC含量应在含量应在40%-60%40%-60%(45%-55%45%-55%)之间,)之间,4 4中中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列,如聚嘧啶序列,如AAAAAAAAAA等,没有二核苷酸重复等,没有二核苷酸重复序列,如序列,如GCGCGCGCGCGC等;等;(2 2)引物长度:)引物长度:引物中与模板互补的区
5、应为引物中与模板互补的区应为18-2518-25个个核苷酸长核苷酸长度,上下引物长度度,上下引物长度差别不能大于差别不能大于3bp3bp,如上游,如上游引物为引物为19bp19bp,下游引物为,下游引物为24bp24bp等。等。7.(3 3)重复或自身互补序列:)重复或自身互补序列:形成发夹结构,会阻止引物和模板之间的复形成发夹结构,会阻止引物和模板之间的复性。性。8.(4 4)上下引物的互补性:)上下引物的互补性:一个引物的一个引物的33末端序列不允许结合到另一个引物的任末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上,因为何位点上,因为PCRPCR中引物浓度较高,会形成引物二中引物浓度较高,会形
6、成引物二聚体。聚体。当一个当一个PCRPCR有多对引物时,注意检查任何一个有多对引物时,注意检查任何一个33末端末端都不能和都不能和 其他任何引物互补。其他任何引物互补。9.(5 5)解链温度()解链温度(Tm Tm 值):值):计算出来的两个引物的计算出来的两个引物的 Tm Tm 值相差不能大于值相差不能大于5 5,扩增产物的,扩增产物的 Tm Tm 值与引物的值与引物的 Tm Tm 值相差不值相差不能大于能大于10 10;引物的;引物的 Tm Tm 值一般为值一般为50-7050-70。这些特性保证了扩增产物在每一个这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR PCR 循环可循环可有效变性。有效
7、变性。10.(6 6)33末端末端3 3末端的性质非常关键。末端的性质非常关键。如果可能的话,每个引物的如果可能的话,每个引物的3 3末端碱基为末端碱基为G G或或C C;最;最好不要好不要A A,或,或AAAA等多聚等多聚A A;但不推荐但不推荐3 3末端有末端有.NNNCG.NNNCG或或.NNNGC.NNNGC序列的引物,序列的引物,GCGC高自由高自由能促进发夹及引物二聚体产生。能促进发夹及引物二聚体产生。11.当末端碱基为当末端碱基为 A A 时,错配时引发链合成的效率大大时,错配时引发链合成的效率大大降低;降低;当末端碱基为当末端碱基为T T时,错配情况下亦能引发链的合成,时,错配
8、情况下亦能引发链的合成,所以一般所以一般 PCR PCR 反应中,引物反应中,引物3 3末端的碱基最好选末端的碱基最好选T T、C C、G G,而不选,而不选A A。引物引物33端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为差异,当末位的碱基为A A时,即使在错配的情况下,时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为也能有引发链的合成,而当末位链为T T时,错配的引时,错配的引发效率大大降低,发效率大大降低,G G、C C错配的引发效率介于错配的引发效率介于A A、T T之之间,所以间,所以33端最好选择端最好选择T T。?(7 7
9、)5 5端序列添加限制性酶切位点:端序列添加限制性酶切位点:12.一些概念一些概念有意链(有意链(Sense strandSense strand),正义链(),正义链(positive strandpositive strand),),编码链(编码链(coding strandcoding strand);无意链();无意链(anti-sense anti-sense strandstrand),负义链(),负义链(negative strandnegative strand),模板链),模板链(template strandtemplate strand)13.正向引物正向引物 (forw
10、ard primerforward primer):处于:处于DNADNA双链上游的引物。如用双链上游的引物。如用于测序,则从于测序,则从5 533方向读出方向读出 DNA DNA正链的序列。正链的序列。反向引物反向引物 (Reverse primerReverse primer):处于目的:处于目的DNADNA双链下游的引物。双链下游的引物。如用于测序,则读出如用于测序,则读出 DNA DNA负链从下游到上游的反向序列。负链从下游到上游的反向序列。14.15.Primer Premier 5.0 软件设计引物软件设计引物是由加拿大的是由加拿大的 Premier Premier 公司开发的专业
11、用于公司开发的专业用于PCRPCR或测序引物以及杂交探针或测序引物以及杂交探针的设计、评估的的设计、评估的软件软件主要界面分为序列主要界面分为序列编辑窗口编辑窗口(genetankgenetank)、)、primer designprimer design、酶切分析酶切分析(restriction restriction sitesite)和)和 MotifMotif16.正向(正向(As isAs is)、反向()、反向(reversedreversed)、互补()、互补(complementedcomplemented)及)及反向互补(反向互补(reverse complemented r
12、everse complemented)。)。17.正向(正向(As isAs is)18.反向(反向(reversedreversed)19.互补(互补(complementedcomplemented)20.Enzyme21.软件默认以软件默认以表格方式表格方式显示酶切结果。单击显示酶切结果。单击SeqSeq 或或 MapMap,分别以,分别以序列或图示的方式显示结果。序列或图示的方式显示结果。缺点:缺点:不能以文本的形式保存结不能以文本的形式保存结果。果。22.Motif 23.24.Primer25.点击点击 SearchSearch,进行引物搜索,进行引物搜索26.Search cr
13、iteriaSearch criteria 窗口:多种参数可以调整。窗口:多种参数可以调整。Primer LengthPrimer Length常设置在常设置在181830bp,30bp,短了特异性不好,长了没有必要。短了特异性不好,长了没有必要。当然有特殊要求的除外,如加个酶当然有特殊要求的除外,如加个酶切位点什么的切位点什么的。PCR Product sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之间,小于之间,小于100bp100bp的的PCRPCR产产物琼脂糖凝胶电泳出来,条带很模物琼脂糖凝胶电泳出来,条带很模糊,不好看。至于上限倒也不必要糊,不好
14、看。至于上限倒也不必要求苛刻。求苛刻。27.ManualManualSearch parameters Search parameters 人工搜索参数设置窗口。人工搜索参数设置窗口。Search stringencySearch stringency应选应选HighHigh。GCGC含量一般是含量一般是40406060。其它参数默认就可以其它参数默认就可以。28.Search progress Search progress 窗口中显示窗口中显示Search CompletedOKSearch CompletedOK键键29.结果窗口结果窗口有三种显示形式,上游引物、下游引物和成对显示。有三
15、种显示形式,上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列,满分为引物按优劣次序排列,满分为100100。选其中的一对引物,在主。选其中的一对引物,在主窗口显示结果。窗口显示结果。对于对于上述上述引物,如果其它各项指引物,如果其它各项指标还可以,标还可以,可可在引物末端去掉一在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基,看个不满意的或加上一个碱基,看看引物的评估参数有没有变好点。看引物的评估参数有没有变好点。搜索出来的引物,按搜索出来的引物,按RatingRating排序,排序,逐个送逐个送OligoOligo软件里评估。软件里评估。当然,搜索出的引物,其扩增产当然,搜索出的引物,其扩增产物很短
16、,你可以不选择它物很短,你可以不选择它。引物引物3 3端端22个个A A或或T,T,或引物内部或引物内部连续的连续的G G或或C C太多,或引物太多,或引物3 3端端22个个G G或或C C,这样的引物应作,这样的引物应作为次选,没得选了就选它。为次选,没得选了就选它。30.该图分为四部分:最上面是图示模板及产物位置,该图分为四部分:最上面是图示模板及产物位置,“S”“S”和和“A”“A”可查看有义链可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图;第二层是模或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图;第二层是模板及引物序列的配对情况;第三层显示引物的各种参数。板
17、及引物序列的配对情况;第三层显示引物的各种参数。注意:尾末给出该注意:尾末给出该引物的最佳退火温度引物的最佳退火温度!第四层:四种重要指标的分析!第四层:四种重要指标的分析31.引物长度:引物长度:控制着引物的特异性和在控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火反应中的退火温度。长的温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性,可以引物能给扩增带来更好的特异性,可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度,不过长引物易形通过降低退火温度提高反应的灵敏度,不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为长度为18-27 nt。Tm 融链温
18、度融链温度:根据相:根据相邻二碱基对作用原理来邻二碱基对作用原理来计算融链温度。计算融链温度。PCR 反反应的合适应的合适 Tm 范围为范围为56-63(50-70)GC%含量含量:对于:对于PCR 反应来说反应来说 GC含量在含量在50%左右比左右比较合适。较合适。(40-60%,45-55%)Degeneracy多义性多义性,尽量减少,尽量减少引物多义性,这样会带来更好引物多义性,这样会带来更好的特异性,尽量避免的特异性,尽量避免3末端的末端的多义性,因为这个位置即使一多义性,因为这个位置即使一个碱基的错配都能阻止引物延个碱基的错配都能阻止引物延伸。伸。32.BLAST 验证引物验证引物进
19、入进入http:/www.ncbi.nlm.nil.gov/BLAST/,点击点击Basic BLAST中的中的 nucleotide blast 选项选项33.在在Enter Query SequenceEnter Query Sequence栏中输入引物序列:栏中输入引物序列:例例:引物为引物为5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3;5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3;5-TGCCCATCACAACATCATCT-35-TGCCCATCACAACATCATCT-3同时输入上下游引物。输入上下游引物都从同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5 5 3 3。输入上游引物
20、后,加上输入上游引物后,加上2020个字母个字母n n,再输入下游引物。,再输入下游引物。34.在在Choose Search SetChoose Search Set栏中:栏中:DatabaseDatabase根据预操作基根据预操作基因的种属定了,可选因的种属定了,可选Human genomic+transcriptHuman genomic+transcript或或OthersOthers35.在在Program SelectionProgram Selection中:选择中:选择Somewhat similar Somewhat similar sequences(blastn)sequ
21、ences(blastn)项,如下图:项,如下图:在此界面最下面关键要点击在此界面最下面关键要点击Algorithm parametersAlgorithm parameters参参数设置,进入参数设置界面。数设置,进入参数设置界面。36.在在General ParametersGeneral Parameters中:中:Expect thressholdExpect thresshold期望阈值须改为期望阈值须改为10001000,大于,大于10001000也可以;在也可以;在Word sizeWord size的下拉框将数字改为的下拉框将数字改为7 7。37.图中:序列与引物匹配的得分值小
22、于图中:序列与引物匹配的得分值小于4040分、分、40405050分、分、50-8050-80分、分、80-20080-200分等,分值越高,特异性越好;分等,分值越高,特异性越好;线段代表上或下游引物线段代表上或下游引物,其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。两线段间没有其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。两线段间没有连线的,表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列连线的,表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列与上游引物匹配(与上游引物匹配(Strand=Plus/PlusStrand=Plus/Plus)、并与下游引物互补)、并与下游引物互补(Strand=Plus
23、/MinusStrand=Plus/Minus),),理论上可以扩增出基因片断。点击线理论上可以扩增出基因片断。点击线段,就能跳转到该基因的结果信息概要。段,就能跳转到该基因的结果信息概要。38.Accession,数据库数据库系列的身份证:点系列的身份证:点击之后可以获得该击之后可以获得该序列的信息序列的信息Desscription序序列列的简单描述的简单描述高的就是有两线段间高的就是有两线段间有连线的有连线的代表随机匹配的可代表随机匹配的可能性能性。E值值接近零时接近零时最有意义,也就是最有意义,也就是说序列完全匹配了。说序列完全匹配了。39.比对到的序列长度比对到的序列长度E值越小为好!
24、值越小为好!匹配上的碱基数占总匹配上的碱基数占总序列长度的比例序列长度的比例缺失或插入,用缺失或插入,用“-”来表来表示示Query1、2表示输入表示输入的两对引物,的两对引物,Sbjct表表示在库里比对的序列示在库里比对的序列Primer BLAST的详细结果的详细结果40.ncbi 在线在线 primer 设计设计41.默认的参数实际上是从默认的参数实际上是从100到到1000,这个你得自己改,如果你希望产,这个你得自己改,如果你希望产物的大小符合你的预期,尽可能把物的大小符合你的预期,尽可能把范围改小,比如范围改小,比如480-500 至于至于RT-PCR所用的引物,最好是所用的引物,最
25、好是使得产物跨过内含子,这样避免潜使得产物跨过内含子,这样避免潜在在DNA对对RT-PCR的干扰。的干扰。42.43.44.45.用用OligoOligo软件软件设计设计/评估评估PCRPCR引物引物启动启动OligoOligo,选择,选择FileFileopenopen,打开要进行引物分析,打开要进行引物分析的序列。的序列。46.图中显示的三个指标:图中显示的三个指标:TmTm值、值、GG和和 Frequencies Frequencies。退火温度窗口是设计引物退火温度窗口是设计引物的的主窗口主窗口,其他两个具有,其他两个具有辅助辅助作用。作用。47.因为分析要涉及多个指标,启动窗口的因为
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