DNA指纹图的建立及发展.doc

精选资料1 DNA指纹图的建立及发展 近百年来的研究认为，任何遗传分析都是以遗传标志为基础的，而任何一个遗传标志的价值又在于其变异 性(即多态性)的大小。有关遗传多态性的研究对促进人类学、遗传学、免疫学以及法医学的发展， 以及对阐明某些疾病的发病机理乃至协助诊断等方面都起了十分重要的作用。但以往的研究都是利用各种外部表现型、生理缺陷型、同工酶、多态蛋白等作为遗传标志，用间接分析来推论相应的遗传基因。 70年代末，限制性内切酶和重组体DNA技术的出现以及分子生物学的飞速发展，使人们对遗传标志的研究转向DNA分子本身。由于各种遗传信息都蕴藏在DNA分子上，生物个体间的差异在本质上是DNA分子的差异，因此DNA被认为是最可靠的遗传标志。某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变来反映，此即限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP),其产生是由于点突变、DNA重排、插入或缺失引起的1。随着对RFLP研究的深入，人们发现了基因组中最有变异性的一类序列高变异DNA序列，使DNA遗传标志的发展和应用得到了一次飞跃。 1980年，Wyman和White描述了第一个多等位性的具有高度多态性的人类DNA标志。不久，在胰岛素基因(Insulingene)的5端区域、致癌基因(C-Haras I Oncogene)的3端分别发现了相同的高度可变的标志(hypervariable marker)。在-球蛋白(-globin)基因群周围还发现了其它三个标志2。1982年，Bell等3证实：这些高度多态性区域串联着重复的短序列单位，重复单位数目的差异导致了这种高度的可变性，由于这些结构特征，人们称这些区域为小卫星(minisatellite)或高度可变区域(hypervariable)或可变数目的串联重复(variable number of tandem repeats)。 1985年，Jeffreys 等4用肌红蛋白基因第一内含子中的串联重复序列(重复单位含33bp)作探针，从人的基因文库中筛选出8个含有串联重复序列(小卫星)的重组克隆。序列分析表明，这8个小卫星重复单位的长度和序列不完全相同，但都有相同的核心序列(core sequence)即GGCCAGGA/GGG。他们先后用两个多核心小卫星(poly coreminisate -llite)33.6和33.15探针进行southern杂交，在低严谨条件下杂交得到了包含10多条带的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置就象人的指纹一样千差万别，Jeffrey称之为DNA指纹(DNA fingerprint)5，又名遗传指纹(genetic fingerprint)。 RFLP DNA指纹分析技术由于方法繁杂、周期长、实验条件高等缺陷而无法大范围推广。1990年，Williams等6首次报道了AP-PCR技术，Welsh和McCelland7亦独立地进行了这方面的工作，从而使DNA指纹技术应用更加广泛。AP-PCR技术是采用随意设计的1个或2个引物，对模板DNA进行PCR扩增，一般先是在低严格条件，即在高Mg2+浓度(大于传统PCR Mg2+浓度1.5mmol/L)、较低退火温度(3650)下进行16个循环的PCR扩增，随后在严格条件下进行PCR扩增，产物经2%琼脂糖凝胶电泳或6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可得到DNA指纹图谱。其基本原理是：在低严格复性条件下，引物与模板DNA非完全互补序列形成错配，错配引物在DNA聚合酶作用下沿模板链延伸，合成新链，当在一定距离内模板DNA另一单链也发生引物错配时，即可对两错配引物间的DNA进行扩增。但是此种错配并非随机发生，引物和模板间，特别是在引物3端必须存在一定的互补序列，即可产生不同的扩增片段或组合，通过DNA指纹图谱，可得到配对DNA样品中的差异片段，用于克隆、测序、染色体定位和基因片段的生物学功能研究。 我国杨建厂等8利用PCR的原理成功地建立了一种全新的DNA指纹检测技术，称之为随机引物PCR人DNA指纹检测技术(arbitrarily primed PCR human DNA fingerprinting,APHDP)，此外还开发出处理DNA指纹数据应用软件，应用于个人识别、遗传素质与疾病的相关特征研究等。2 DNA指纹技术所用的探针 自DNA指纹技术建立以来，这一技术迅速在动植物的进化关系、亲缘关系分析以及法医学方面得到广泛应用。也正是由于DNA指纹技术在核酸分析中显示出了强大的生命力，因而许多学者围绕此技术所用的探针作了大量的工作，除Jeffrey等5的探针外，用人工化学合成或从生物组织中提取后再扩增的办法生产出了一批高水平的探针。迄今，在DNA指纹技术中所用的探针大概有probe33.15、33.65、bacteriophage MB9、pig repetitire clone p83、PGB 725、poly(GT) containing 18.1、(GTG)5/(CAC)510，11、(CAC/TA)4及(GT)12等。同时，在探针的标志上也有了很大的发展，根据它们的结构可大致分为小卫星探针和简单重复序列探针，简单重复序列包括微卫星探针(microsatellite probe)和寡聚核苷酸探针。小卫星探针的核心序列为33bp，常定位在人常染色体前的末端(proterminal)区域，微卫星探针则在1020bp之间，而寡聚核苷酸探针在10bp以下，普遍散布在人类整条染色体上，或者在基因间区域或者位于内含子内。 1988年，我国伍新尧等12根据DNA指纹是人基因组中重复序列的RFLP的原理和人与鼠的髓鞘碱性蛋白(MBP)基因cDNA同源序列性高于90%的事实，选用鼠MBP cDNA3端的一段序列(非表达区高度重序列，与人基因组中该类重复序列几乎完全同源)，长度为0.81kb的片段作探针，检测用Hae酶解的人DNA限制性片段(RF)，在人群中可分出22条谱带，受检 的30例无血缘关系的个体之间没有两个人的谱带是完全相同的，显示这一方法的高度个体特异性，这是国内首次用自已的力量找到DNA指纹的探针。3 DNA指纹的应用3.1 法医学方面 同以往的血型测定法相比，DNA指纹技术在法医学领域上具有无可比拟的优越性。已成为鉴定犯罪、亲子鉴定和确定个体间亲缘关系的工具5，13。随后，国内学者李伯龄14、姜先华15、伍新尧等12也先后对此项技术进行了研究，并应用于实际案件的鉴定中，解决了过去无法解决的疑难案例，如微量血痕、部分腐败的碎尸块的个人认定等。 3.2 在动植物科学中的应用 3.2.1 生物种群学研究 利用DNA指纹图可以估算连锁不平衡，比较等位基因的频率，还能估计不同个体之间的重组率，在种群学研究上有助于建立某一个体在种群中的地位和关系，特别是对真菌的种群研究，有很多真菌可以通过有性和无性的方式繁殖，但是何时以何种方式繁殖，程度如何，并不清楚，而利用DNA指纹图就能区分以有性和无性方式产生的后代，并能确定某一区域真菌的自然分布1，16。 3.2.2 测定物种之间的遗传距离、物种分类鉴定 Jeffreys等5认为在一个群体的不同成员间拷贝数的串联重复序列(VNTR)由于多态性程度高，在遗传分析中尤其适合作为多态性标志，简单重复的不稳定性可导致VNTR长度的迅速变化，根据家族中或育种群体中VNTR的分离重组频率，可以测定出遗传距离，可用统计学公式确定个体间的亲缘关系：D=2Nab/(Na+Nb),，D值越大，亲缘关系越近，遗传距离就越小；D值越小，亲缘关系越远，遗传距离就越大。为此，运用DNA指纹技术可检测不同物种、同种及同种不同个体的亲缘关系，用于物种分类鉴定，也可用于杂交后代亲本决定，杂交后代群体分开，检测近等基因系(或同类系)种的多态性，并对检测基因进行定位。Welsh等7对布氏疏螺旋体菌株的DNA指纹进行分析，发现这种lyme病的病原菌实际上是由三个不同的种群组成。罗超权等12运用AP-PCR鉴定弓形虫虫株，在国内开创了运用DNA指纹技术作生物分类的先例。 3.3 在流行病学方面的运用 由于DNA指纹具有以下几个特点：能反映基因组的变异性；具有高度的变异性；具有简单的稳定的遗传性；DNA指纹谱具有体细胞稳定性。所以，它同一般的流行病学方法相比较而言，具有无比的优越性，使其成为流行病调查的一种有效工具。Jan DA等17，Denise Chevrel-Dellagi等18运用IS6110序列作探针对结核病分支杆菌株进行DNA指纹分析，调查国际间结核病的种型、分析流行情况，改进了控制结核病的方法。而ZhenHua Yang等19从67个病人中分离出结核病分支杆菌株进行DNA指纹分析，发现分离到PTBN12型时易查明流行环节，从而为快速进行疾病控制提供了一个有力证据。在我国，童笑梅等20采用随机扩增多态DNA指纹图技术对医院内感染的14例新生儿进行病原流行病学分析，发现患儿体内携带的与医务人员鼻中携带的华纳葡萄球菌菌株的DNA指纹图完全一致，从而证明此次感染的病原菌为华纳葡萄球菌，传染源是携带病菌的医务人员。郭永建等21在6个月内对121名产科新生儿中的30名检出的31株铜绿假单胞菌进行RAPD指纹图谱分析和血清学分型，结果表明，铜绿假单胞菌在产科新生儿中暴发流行，06/R1型为暴发流行性菌株，对医院感染病原菌分型、精确确定传染源、阻断传播途径、控制和预防医院感染具有重要的指导意义。 3.4 疾病诊断及治疗 鉴于DNA指纹所具有的上述特点，故DNA指纹广泛应用于一些疾病的诊断及治疗。Morral22等发现CF基因9号外显子侧翼含有一小卫星区，且此等位基因2.6带常与F508连锁，相伴率为50.6%、41.6%，F508是最主要的致病突变，可疑患者电泳图只要发现2.6等位基因，就可对此病进行初步诊断。现已在Wilson病、外周神经纤维瘤、成人多束肾、多巴性肌紧张、Frecbreich共济失调、Kallmunm综合征性连锁、视网膜病等基因内或旁侧发现有高度的小卫星区域，从而可进行基因诊断。Okamoto R23用DNA指纹法预测慢性粒cell性白血病骨髓移植术后复发，取得了成功。 3.5 肿瘤的研究 肿瘤是多因素、多阶段的变化过程，病因复杂、变化多样，但归根到底还是在DNA的变化上。一般说来，癌组织、转移灶与正常组织或外周血细胞DNA指纹有差别，常见的是某条带或几条带的缺失，某一条或某几条带密度降低，或者癌组织中出现新的带。Thein等24用33.6和33.15为探针研究患者DNA指纹谱变化，发现胃肠肿瘤患者癌组织DNA指纹谱全有改变，并认为体细胞突 变还有种属特异性。刘霜等25应用RAPD(随机扩增多态性DNA)分析技术对6例肝癌患者的癌组织与非癌组织进行分析，发现所有肝癌组织基因组DNA的RAPD指纹图谱均存在差异，其中3例配对肝癌基因组中均存在一相同的0.9Kb的随机扩增片段。杨建厂等8用APHDFF技术对28例确诊为鼻咽癌病人血DNA指纹图的检测，发现有3条DNA片段出现的频率明显低于健康人群。王黛等26用LE11.8、MYO和Mb探针，经Southern杂交法检测12例儿童急性粒cell白血病患者的外周血或骨髓细胞的基因重排，结果发现初始或复发与完全缓解时的DNA指纹图相比，谱带有增加或减少，从而认为急性粒细胞白血病患儿的白血病细胞存在基因重排。什么是DNA指纹人体包含有100万亿个细胞，它们组成各种器官和组织。染色体是遗传物质，存在于细胞核内。每个人体细胞内含有23对染色体，它们大小各异。遗传信息贮存于染色体内的DNA分子中，也就是说，基因的化学本质是有遗传效应的DNA片段。每个DNA分子含有很多个基因， 基因的复制就是通过DNA的复制来完成的。DNA通常以双螺旋型的双链存在，它的基本组成单元是四个碱基，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。DNA双链通过氢键按AT、GC的互补配对方式绞结在一起。上述四种碱基在DNA长链中的不同排列组合，构成了一系列密码，在受精卵到个体形成的整个过程中起到调控作用，从而使得人类个体之间的特征千变万化，互相区别。人类基因组DNA中贮存着可供正常生存和遗传的信息，这些信息以基因、密码的形成排列组合在DNA分子之中，其中能够制造蛋白质的基因约有8万个。DNA由以碱基、核糖和磷酸构成的核苷酸长链组成，核苷酸排列方式叫序列，即一级结构。DNA序列中存在三种类型：单拷贝序列、中等程度重复序列和高度重复序列。重复序列就是一种序列在DNA分子中重复出现几百次、几千次、几万次甚至百万次，它们约占DNA总序列的34。每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复序列经超离心后，以卫星带出现在主要DNA带的邻近处，所以也被称为“卫星DNA”。卫星DNA中的重复序列单元则称为“小卫星DNA”。“小卫星DNA”具有高度的可变性，不同个体彼此不同。但“小卫星DNA”中有一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”。如果把核心序列串联起来作为分子探针，与不同个体的DNA进行分子杂交，就会呈现出各自特有的杂交图谱，它们与人的指纹一样，具有专一性和特征性，因人而异，因此被称作“DNA指纹”(DNA fingerprint)。二、DNA指纹的特点概括起来说，DNA指纹具有以下三大特点：1、多位点性 高分辨率的DNA指纹图通常由1530 条带组成，看上去就像挂号信上的条码签一样。DNA指纹区中的绝大多数区带是独立遗传的。因此，一个DNA指纹探针能同时检测基因组中数十个位点的变异性。2、简单的遗传方式 DNA指纹图中的区带是可以遗传的，这不同于人的指纹。DNA指纹区带遵循简单的孟德尔遗传方式。后代图中的每一条带都可以在双亲之一的图中找到，只有0.004的可能性，使子女中的一条带不能在其父母中的图中找到(基因自发突变的结果)。同一个体无病变的不同组织产生的DNA指纹图完全相同，并能在培养的细胞株中维持下去。需要说明的是，同卵双胞胎的DNA指纹图完全相同。3、高度变异性 不同的个体或群体有不同的DNA指纹图。一般选用任何一种识别四个碱基的内切酶，这种变异性就能表现出来。英国遗传学家杰弗里斯对白种人研究表明，两个随机个体具有完全相同的DNA指纹图的概率，为三千亿分之一(即310-11)。两个同胞个体具有相同图谱的概率也仅仅为二百万分之一(即210-6)。三、DNA指纹术的工作原理一般要通过以下几点来完成：1、将送检的各种生物学检样，如毛发、血痕、精斑、人体组织或白骨等，把其中所含的DNA 提取出来。2、选用与探针配对的限制性核酸内切酶，在长链DNA 位置上加以切割，使分子量很大的DNA 长链切短成许多长度不同的小片段。3、在胶板尺寸较长的凝胶电泳仪中，对酶解完全后的DNA 片段进行电泳，各酶切片段就会按其长度大小在电场中进行分离。4、先用碱性溶液使凝胶板中分离开的双链DNA 片段变性为单链片段，然后将凝胶板夹在尼龙膜中，使这些单链DNA 片段印溃(blot-ting)，转移并永久性地固定在尼龙膜上。5、让放射性DNA探针与尼龙膜上的单链DNA片段进行分子杂交。6、用放射性胶片与尼龙薄膜叠放，尼龙膜上的放射性探针便会发出X 射线使胶片曝光，从而使杂交有探针的长度不同的DNA片段位置显影在胶片上。这样的特征 DNA片段条状图谱，便是所谓的DNA指纹。四、DNA指纹术的应用由于DNA 指纹提供了丰富的个体特异性遗传标记，因而在法医学鉴定中具有重要意义。其主要应用有以下几个方面：1、在刑事案件中的应用 在法医学上，如果确定某人是嫌疑犯，则可提取其血样或毛发的DNA，做出DNA指纹，然后由犯罪现场残留的血、精液、唾液、痰液、毛发、骨骼或其他肉体成分提取的DNA指纹相对照。若两者一样，则称其指纹相配，证明该嫌疑犯就是作案的罪犯，反之则否。通常进行上述指纹相配的签定叫“配型”工作。在DNA 指纹术见诸报道的第二年，即1986年的秋天，英国累斯特远郊的警察拘捕了一名涉嫌先后奸杀两名少女的嫌疑犯。警方向杰弗里斯教授提供了从两名受害人身上采集到的精斑和阴道拭子。经过DNA 指纹术分析后，杰弗里斯提出的鉴定报告是两名受害人处的精斑均来自同一人，但决非是已被拘捕的青年的。此后，警方用去了50万英磅的办案经费，借助DNA 指纹术将真正的罪犯抓捕归案。2、在亲子鉴定中的应用 自从杰弗里斯等人于1985年首次对一起移民纠纷中的母子关系作出肯定鉴定以来，用DNA 指纹术进行亲子鉴定已有近10年的历史了。代表性的报道有：在一起无名尸的鉴定过程中，专家们将提取到的腐尸残血中的DNA，和假定受害人双亲的DNA进行DNA指纹鉴定后，成功地对这具无名尸的人身作出了鉴定。在常规血清学检验不能对亲子关系作出肯定结论的情况下，采用DNA 指纹术便可轻易地作出结论。3、空难事故受难者残骸鉴定 通常在空难受害者残骸的鉴定过程中，单纯依靠法医学和常规法血清学检验，是很难对所有遇难人员的残骸加以区分的。因此，在常规手段行不通时，再采用DNA 指纹术实为一种最佳选择。4、人种、性别鉴定 英国内政部中央研究局研究表明，DNA 指纹术可在相当大程度上用于人种鉴定，并测出白种人和非洲黑人的DNA多态片段及它在特定范围内的出现频率，具有种属代表性。有人对长达20年的陈旧血迹中的降解DNA进行了性别鉴定，并在人、兽的区分鉴定中取得成功。5、其它方面的应用 鉴别双胞胎是异卵双生还是同卵双生，只需比较一下两者的 DNA指纹图即可。DNA指纹术也可用于器官移植的配型试验，以便筛选出最佳供体。肿瘤细胞DNA指纹，因其染色体丢失或异常的扩增而与正常体细胞不同。因此，肿瘤DNA 指纹的改变可用作肿瘤发生和发展的标志。在盗杀和偷捕野生动物的案件中，用不同的DNA 指纹术，对遗弃在野外的残余动物组织、市场上出售的动物组织，以及盗猎者冰箱中的动物组织进行分析，可对被盗杀的动物进行鉴定。DNA指纹术的应用领域很广泛，尤其在司法鉴定中有着独特而权威的应用。五、DNA 指纹术论战风暴自从1985年英国遗传学家杰费里斯发现DNA 指纹以来，DNA指纹术已被广泛应用于解决那些根据表型遗传标记无法解决的医学、人类学、社会学和法律学问题。最令人刮目相看的是它风靡法医学界，并正开始改变法医学的面貌。由于DNA 指纹术直接用于法医学，涉及对罪犯的判别和刑罚这样性命悠关的大事，所以法院法官对此不敢贸然采用赞同或否定的态度。他们对DNA 指纹术的可靠程度不够了解，有较多顾虑。其实，这是科学界对该技术争议不决的一种反映。在欧美科学界(主要在生物医学界)，争论双方都有有影响的科学家参加。支持者认为，DNA 指纹完全可以推广应用于法医学而不会发生任何偏差，力主大胆应用。怀疑者提出一些目前尚难准确回答的疑问。归纳起来有以下几个问题分歧较大：1、关于DNA 指纹配型的机率。2、从事DNA 指纹鉴定的实验质量控制。过去各家对相配机率(即多少人中可以出现一对相配DNA指纹)的估计，缺乏统一标准和足够准确的数据，所以估计数字相差甚殊，由五百万分之一到1014分之一不等。有一段时间不少人估计，大约50亿人口中有两个人的DNA 指纹完全相同，故认为在当今世界总人口50亿的情况下，应用DNA指纹鉴定罪犯是可靠的。一些权威的群体遗传学家认为，DNA指纹术研究者计算出来的频率离实际值太远，没有考虑人口亚结构的存在。人口亚结构即人的亚种，不同种或同亚种的人群之间发生相同DNA 指纹的频率可能不一样。同时由于人口亚结构的存在，也可能增加了人群中相同DNA指纹的频率。至于它们的频率究竟有多大，目前仍不得而知。此外，DNA指纹还涉及社会和伦理问题。由于对DNA指纹术存在严重分歧，美国国家科学院于1989年为此成立了一个专门委员会，负责审查有关DNA指纹术在法医学中的应用，及由此而产生的社会伦理问题。该委员会内部也发生争论，并形成两个极端。以著名群体遗传学家兰德为首的一派被称作保守派，对DNA 指纹术在法医学中的应用持谨慎态度。另一派以分子遗传学家卡斯科为首，被称作实用派。委员会成立初期，保守派占优势，掌握了起草关于 DNA 指纹术应用的(英国)科学院报告。可以想象，报告草案一定是相当保守的。实用派大为不满，把这份属于保密资料的内容透露给联邦调查局犯罪实验室的官员和美国科学杂志。在联邦调查局的干预下，此报告多次进行修改。当报告比原计划推迟7个月，于1992年4月份产生后，科学杂志几乎在同时就向公众透露了这份报告的主要内容和某些细节。科学杂志说，由于围绕DNA指纹术争议太大，科学院报告最终必定是一份折衷的报告。初步意见有以下几点：1、支持DNA 指纹术用于法医学。2、接受人口亚结构的观点。3、肯定了基因数据的隐私性。4、赞成对DNA 指纹配型实验室进行强制鉴定。5、关于分歧最大的、在人群中发生DNA指纹相配的频率，最终达成争论双方都接受的数据几十万至几百万分之一。由于科学院报告的产生，在欧美围绕DNA 指纹的论战风暴趋于缓和。但对这份报告的大多数批评者认为，DNA 指纹相配频率过于保守。换句话说，它对辩护律师有利。在法庭上，有些辩护律师借口科技界对DNA指纹术存在争议。而为被告开脱罪证。为了确保DNA指纹术的科学有效性，科学界采取了许多新措施。人们相信，DNA指纹术将在法医学中大放异彩。THANKS !致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书，学习课件等等打造全网一站式需求欢迎您的下载，资料仅供参考可修改编辑