植入含感觉神经束及血管束组织工程骨修复股骨大段骨缺损：降钙素基因相关肽Ⅰ型受体中长期表达.doc

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陈思圆，等. 植入含感觉神经束和血管束组织工程骨修复股骨大段骨缺损：降钙素基因相关肽Ⅰ型受体的中长期表达

植入含感觉神经束和血管束组织工程骨修复股骨大段骨缺损：
降钙素基因相关肽Ⅰ型受体的中长期表达

陈思圆1，王 簕2，江 汕3，裴国献4 (1广东医科大学附属医院骨科中心，广东省湛江市 524000；2广州医科大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510150；3南方医科大学南方医院创伤骨科，广东省广州市 510515；4解放军第四军医大学西京骨科医院，陕西省西安市 710312)
引用本文：陈思圆，王簕，江汕，裴国献. 植入含感觉神经束和血管束组织工程骨修复股骨大段骨缺损：降钙素基因相关肽Ⅰ型受体的中长期表达[J].中国组织工程研究，2017，21(6):848-853.
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.005 ORCID: 0000-0001-6844-3113(陈思圆)

文章快速阅读：
植入含感觉神经束和血管束组织工程骨修复兔股骨大段骨缺损降钙素基因相关肽Ⅰ型受体的中长期表达

陈思圆，男，1982年生，广东省湛江市人，博士，主要从事骨组织工程研究。

通讯作者：陈思圆，广东医科大学附属医院骨科中心，广东省湛江市
524000

中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:2095-4344
(2017)06-00848-06
稿件接受：2016-12-01

Chen Si-yuan, M.D., Orthopedic Center, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524000, Guangdong Province, China

Corresponding author:
Chen Si-yuan, Orthopedic Center, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524000, Guangdong Province, China

感觉神经组植入含自体感觉神经束的组织工程骨
结果表明：植入含血管束的组织工程骨可促进降钙素基因相关肽Ⅰ型受体的表达
植入后24，48周，进行X射线、免疫组织学及荧光定量PCR检测
空白对照组组植入组织工程骨
血管束组植入含自体股血管束的组织工程骨
造模：制作单侧股骨1.5 cm缺损模型

文题释义：
植入含感觉神经束和血管束的组织工程骨修复兔股骨大段骨缺损：植入含血管束在组织工程骨中形成新生血管网，重建血液循环，为成骨活动提供营养，并可带走局部代谢产物，并可提高移植骨的抗感染和修复能力；植入的感觉神经束可在组织工程骨中通过出芽形式生长形成新生神经网，感觉神经可释放神经肽，作用于种子细胞，调节其成骨功能；血管束周围结缔组织带劲部分胶原纤维，参与成骨。

摘要
背景：前期实验证实，植入含血管束或感觉神经的组织工程骨促成骨程度与其内的感觉神经肽受体表达相关。
目的：观察植入含感觉神经束和血管束的组织工程骨修复兔股骨大段骨缺损，对降钙素基因相关肽Ⅰ型受体中长期表达的影响。
方法：取36只新西兰大白兔，制作单侧股骨1.5 cm缺损模型，随机分3组，感觉神经组于骨缺损处植入成骨诱导7 d的骨髓间充质干细胞-β-磷酸三钙组织工程骨，并在组织工程骨侧槽内植入自体感觉神经束；血管束组于骨缺损处植入成骨诱导7 d的骨髓间充质干细胞-β-磷酸三钙组织工程骨，并在组织工程骨侧槽内植入自体股血管束；空白对照组于骨缺损处植入成骨诱导7 d的骨髓间充质干细胞-β-磷酸三钙组织工程骨。植入后24，48周，进行X射线、免疫组织学及荧光定量PCR检测。
结果与结论：①X射线检查：感觉神经组、血管束组X射线评分高于空白对照组(P < 0.05)，感觉神经组、血管束组X射线评分比较差异无显著性意义；②荧光定量PCR检测：血管束组降钙素基因相关肽Ⅰ型受体表达量高于感觉神经组、空白对照组(P < 0.05)，感觉神经组与空白对照组比较差异无显著性意义；③免疫组织化学观察：感觉神经组、血管束组降钙素基因相关肽Ⅰ型受体阳性表达强于空白对照组；④结果表明：植入含血管束的组织工程骨可促进降钙素基因相关肽Ⅰ型受体的表达。
关键词：
生物材料；骨生物材料；组织工程骨；感觉神经血管化；降钙素基因相关肽Ⅰ型受体；兔
主题词：
神经节，感觉；受体，降钙素基因相关肽；组织工程
基金资助：
广东省医学科研基金立项课题(B2012277)；湛江市科技攻关计划项目(2012C3103031)
缩略语：
降钙素基因相关肽Ⅰ型受体：Calcitonin gene related peptide type I receptor，CGRP1R

3
P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083@
Implantation of tissue-engineered bone with vascular bundles or sensory nerve tracts for large femoral defects: the middle- and long-term expression of calcitonin gene related peptide type I receptor

Chen Si-yuan1, Wang Le2, Jiang Shan3, Pei Guo-xian4 (1Orthopedic Center, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524000, Guangdong Province, China; 2Department of Orthopaedics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China; 3Department of Traumatic Orthopaedics, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China; 4Department of Orthopaedics, Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 7100312, Shaanxi Province, China)

Abstract
BACKGROUND: Previous study has proved that implantation of the tissue-engineering bone with vascular bundles or sensory nerve tracts can promote bone formation, which may be related to the expression of sensory neuropeptide receptors.
OBJECTIVE: To investigate the effect of implantation of tissue-engineered bone containing vascular bundles and sensory nerve tracts on the middle- and long-term expression of calcitonin gene-related peptide type I receptor (CGRP1R) in the repair of rabbit large femoral defects.
METHODS: Thirty-six New Zealand white rabbits were enrolled and modeled into 1.5 cm femoral defects, and then randomized into three groups. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were subjected to osteoblastic induction for 7 days, and then seeded onto the β-calcium phosphate scaffold to construct the tissue-engineered scaffold. In sensory nerve group, the tissue-engineered scaffold was implanted into the defect region, and autologous sensory nerve bundles were implanted into the lateral groove of the tissue-engineered bone; in vascular bundle group, the tissue-engineered scaffold was implanted, and autologous femoral blood bundles were implanted into the lateral groove of the tissue-engineered bone; in blank control group, only the tissue-engineered scaffold was implanted. X-ray examination, immunohistochemistry and real-time PCR were performed at 24 and 48 weeks postoperatively.
RESULTS AND CONCLUSION: The X-ray scores in the sensory nerve and vascular bundle groups were significantly higher than that in the control group (P < 0.05), but no significant difference was found between sensory nerve and vascular bundle groups. Real-time PCR found that the expression level of CGRP1R mRNA in the vascular bundle group was significantly higher than that in the other two groups (P < 0.05), but showed no significant difference between sensory nerve and blank control groups. Immunohistochemistry findings showed that CGRP1R positive expression rate in the sensory nerve and vascular bundle groups was higher than that in the blank control group. These results reveal that implantation of the tissue-engineered bone containing vascular bundles can promote the CGRP1R expression.
Subject headings: Ganglia, Sensory; Receptors, Calcitonin Gene-Related Peptide; Tissue Engineering
Funding: the Medical Research Foundation of Guangdong Province, No. B2012277; the Key Technologies Research & Development Program of Zhanjiang, No. 2012C3103031

Cite this article: Chen SY, Wang L, Jiang S, Pei GX. Implantation of tissue-engineered bone with vascular bundles or sensory nerve tracts for large femoral defects: the middle- and long-term expression of calcitonin gene related peptide type I receptor . Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(6):848-853.

853
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
0 引言 Introduction
大段节段性骨缺损的重建仍是一个重要的临床问题，现今自体骨移植仍是解决此类问题的金标准。但自体骨来源有限，会造成供区骨缺损并有感染的高风险，难以满足临床需要[1-5]。而骨组织工程技术的发明应用为人类治愈骨不连带来了希望，但如何构建一个近似生理条件的组织工程骨，是组织工程领域的研究重点。有研究表明，在组织工程骨中植入血管束，可有效促进新生骨形成，课题组前期实验证实，植入感觉神经束也能促进新生骨形成[6-10]。所以说充分的血液供应和完善的神经支配，是保证组织工程化骨体内存活的决定性因素[11]。同时，前期实验亦证实植入血管束或感觉神经的组织工程骨的成骨程度，在短期时间内与其内的感觉神经肽受体表达相关[12-13]。由于体内实验耗时耗力，动物长期饲养过程中的较高死亡率使得实验成本和代价非常大，因此多数体内实验只是在相对较短的时间(12周)范围内完成，没有能够观察组织工程骨的成骨状况和体内神经肽受体在体内的长期转归。所以在早期实验的基础上总结饲养经验，增加投入，完成了对血管化神经化组织工程骨在兔体内构建长达1年的中长期观察，并连同感觉神经肽受体降钙素基因相关肽Ⅰ型受体(Calcitonin gene related peptide type I receptor，CGRP1R)在体内中长期表达的观察，旨在初步探索出其促组织工程骨成骨的规律。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 前瞻性随机对照实验。
1.2 时间及地点 实验于2009年1月至2012年12月在南方医科大学南方医院、广东医科大学附属医院完成。
1.3 材料
实验动物：健康6月龄新西兰大白兔42只，雌雄不拘，体质量2.0-3.0 kg，购自南方医科大学南方医院实验动物中心，许可证号：SYXK粤2015-0056。
主要试剂及仪器：DMEM低糖培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清(Hyclone)；抗坏血酸(Sigma)；地塞米松(ICN)；β-甘油磷酸钠(Amresco)；预制有侧槽的β-磷酸三钙(ф3 mm×12 mm，法国贝奥路公司)；Trizol、SuperScripⅢFirst-strand、PlatinumTaq、sybr(50x)、引物、超纯水、10*pcr buffer、25 mmol/L镁离子(Invitrogen)；dNTPS(TAKARA)；倒置显微镜(日本Nikon公司)；BIO-rad IQ5型荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司)；低温超速离心机；CO2细胞培养箱(美国Harris公司)；YG-875B 超净工作台(苏州医疗设备厂)；医用骨钻(日本TOSHIBA公司)；指骨钢板(张家港鑫鹿公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 兔骨髓间充质干细胞的培养及其向成骨方向诱导 抽取6只新西兰大白兔髂骨红骨髓，全骨髓贴壁筛选法分离骨髓间充质干细胞[13]，常规培养，传代；待骨髓间充质干细胞达第3代，把培养基换成诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清、50 mg/L抗坏血酸、10－8mol/L地塞米松、10-3 mol/L β-甘油磷酸钠)。运用碱性磷酸酶染色法和茜素红染色法鉴定为骨髓间充质干细胞。
1.4.2 向成骨诱导的骨髓间充质干细胞与支架复合 取向成骨方向诱导7 d的骨髓间充质干细胞，消化、离心，收集制成细胞悬液，用负压法把细胞接种到预制有侧槽的 β-磷酸三钙支架上，细胞密度1.0×106/每个支架，37 ℃、体积分数5%CO2孵箱培养，让细胞贴附于支架上，4-6 h后沿培养板边缘缓慢加入诱导培养基覆盖材料，继续培养 3 d后作为组织工程骨移植物备用。
1.4.3 兔股骨股缺损模型制备及实验分组 取36只新西兰大白兔，参照本课题组的模型制作方法[12-13]，造成1.5 cm段性骨与骨膜缺损，随机分为3组，每组12只，均植入组织工程骨，感觉神经组于股骨内侧中央作一长5 cm纵形切口，逐层切开，在股三角内显露和分离大隐神经(兔的大隐神经为股神经的延续，与股血管伴行)，游离约5 cm后将大隐神经锐性切断，将近端神经束作适当分离，呈爪形植入组织工程骨侧槽(侧槽长1.5 cm、宽3.5 mm、深2.5 mm)内，用3-0丝线将神经末端固定至侧槽；血管束组游离股血管束深支长5 cm后，直接将其顺行植入组织工程骨侧槽内，用3-0缝线将血管固定至侧槽内；空白对照组仅植入组织工程骨移植物，不植入感觉神经束和血管束(图1)。生理盐水冲洗伤口，逐层缝合切口，包扎。术后每日肌肉注射青霉素40×104 U，连续3 d。
1.5 主要观察指标
X射线检查：植入后24，48周，拍摄股骨正位X射线片，观察骨缺损愈合情况，并根据Yang等[14]提出的评价方法对骨愈合情况进行影像学评分，评分越高说明骨质愈合越好。
实时荧光定量PCR检测：植入后24，48周，拍摄X射线后，每组每个时间点处死6只兔，在骨缺损区取40 mg骨组织，采用实时荧光定量PCR检测CGRP1R mRNA的表达，引物由上海英俊生物有限公司合成。通过液氮研磨和TRIZOL法提取骨组织总RNA，取各组总RNA 3 μL，按逆转录kit操作步骤合成cDNA。在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，反应条件：95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s， 72 ℃延伸45 s，40个循环。采用2-∆∆Ct法，以β-actin作为内参物，计算CGRP1R mRNA的相对表达强度。
免疫组织化学染色：将植入24，48周的各组标本用体积分数10%甲醛固定，150 g/L EDTA脱钙液脱钙，石蜡包埋，连续5 μm厚横行及纵形切片，按SABC试剂盒说明书行免疫组织化学染色检测CGRP1R的表达位置和表达强度。用已知的CGRP1R表达的阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
引物序列：
引物

序列
产物长度
CGRP1R
正向
5'-TG ACG GTC CAA GAA TGG TCA C-3'
143 bp

反向
5'-AA GTC CAA CAG GCC AGT ACA GG-3'

β-actin
正向
5'-CC GTC TTC CCC TCC ATC GT-3'
137 bp

反向
5'-TT CGT GCT CGA TGG GGT ACT-3'

1.6 统计学分析 利用统计软件SPSS 13.0对数据进行统计学处理，用3×3析因设计方差分析对处理因素和时间的主效应和交互效应做统计，若有显著性差异则用单向方差分析(One-way ANOVA)对同一时间点各组间的mRNA表达量值和同一组间不同时间点的mRNA表达量值进行比较，并用LSD法行多重比较分析。其中P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 36只新西兰大白兔均进入结果分析。
2.2 X射线片检查结果 植入24周后，各组生物材料已降解和吸收，各组骨痂量较少，已开始塑形阶段，感觉神经组和血管束组组织工程骨植入区骨髓腔已部分再通，塑形程度要优于空白对照组，空白对照组钢板对侧的骨皮质还没有完全连续；植入后48周，3组骨塑形程度进一步加强，感觉神经组和血管束组组织工程骨植入区骨髓腔已完全再通，骨皮质顺滑，与正常骨类似，而空白对照组的骨皮质相对紊乱(图2)。
3组组内不同时间之间X射线评分值有差异(P=0.002)。相同时间点内，3组间X射线评分有差异(P=0)，不同时间点和分组之间不存在交互效应(P=0.878)。随着时间的延长，各组X射线评分值逐步升高；对每一时间点用LSD法进行多重比较可见，在24，48周时，感觉神经组和血管束组X射线评分值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，均高于空白对照组(P < 0.05)，见图3。
2.3 实时荧光定量PCR检测结果 3组组内不同时间点CGRP1R表达量无差异(P=0.093)。对每一时间点用LSD法进行多重比较，可见血管束组CGRP1R表达量要高于感觉神经组和空白对照组(P < 0.05)，感觉神经组与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。
2.4 免疫组织化学染色结果 大体观测各组不同时间点CGRP1R表达的位置和强度无明显差异。
植入24周时，各组CGRP1R多表达于骨皮质内的小腔隙周围、血管腔周围与骨细胞周围，其中空白对照组表达强度和数量比感觉神经组、血管束组要低；随着时间推移(植入48周)，3组阳性表达的位置和强度与24周相比，在肉眼观察下无明显差异，而阳性表达强度和数量空白对照组为最弱，比感觉神经组和血管束组要低，见图5。

3 讨论 Discussion
组织工程骨充填骨缺损后的修复过程由血管化、骨再生、骨端融合几个基本环节组成，其中植入物血管化是修复骨缺损的基础，是关键的起始环节，并贯穿于骨修复的整个过程[15]。而神经在骨组织发育、形成及代谢的影响也是广泛而具有决定性的。完善的神经支配在骨组织形成过程中的确起着重要作用。近年来越来越多的证据表明，骨再生与重建不仅受全身激素与局部细胞因子的调控，而且受神经系统的调控。
随着免疫组织化学技术和脱钙技术等辅助技术的发展，已表明骨组织中的神经纤维主要为肽能神经，主要有分泌CGRP、SP的感觉神经和分泌VIP、NPY 的自主神经。周围神经系统对骨组织营养和代谢状况的影响主要是通过神经肽的介导来实现的，这些肽能神经主要与血管伴行，有少数游离神经末梢伸出并止于骨膜衬里细胞层、骨髓细胞团等，其作用的靶细胞为成骨细胞和破骨细胞[16-17]。因为骨代谢主要依赖于成骨细胞和破骨细胞，它们对骨质的合成与退化，矿化与去矿化起着重要作用，有研究证实人来源成骨细胞和破骨细胞都有神经肽受体的表达[16，18-19]，所以神经肽可通过与相应的神经肽受体结合来调节成骨细胞和破骨细胞功能，参与调节骨的生长、修复及改建。前期研究也证实，兔来源骨髓间充质干细胞和成骨诱导培养21 d的髓间充质干细胞上也有神经肽受体CGRP1R、NK1R、NPY1R和VIPR1的表达。所以神经肽和骨生长发育的关系很密切。研究中检测的CGRP1都是属于G蛋白偶联受体，CGRP属于降钙素超家族中的一员，CGRP通过作用于由降钙素受体、降钙素受体样受体与3种受体活性修饰蛋白组成的复合受体，来调节靶细胞的功能[20]。CRLR和RAMP1组成CGRP的受体，CRLR和RAMP2或者CRLR和RAMP3组合成肾上腺髓质素的受体[21]。体外研究中，CGRP通过作用于CGRP受体可调节钙浓度、cAMP水平、蛋白激酶C活性、胰岛素样生长因子的生成和NF-κB配体激活因子的表达[22]，最终刺激成骨细胞的增殖和破骨细胞的骨吸收活性。通过作用于血管平滑肌上的CGRP受体，CGRP还可促进血管扩张和再生。所以说CGRP可通过CGRP受体促骨生成和血管再生。
目前本课题组已有研究证明，血管束植入或感觉神经束植入可促成骨，并在进短期内促进CGRP及其受体的表达，但前期研究只进行了12周的短期观察。至于这两种方法的远期成骨效果如何，何种方法可获得更好、更快的成骨，何时能够形成成熟的骨组织，有正常的外观和贯通的髓腔结构，何种方法可更好地促进神经肽及其受体在组织工程骨的表达，在以往的组织工程骨的研究中鲜有报道。实验通过检测植入含血管束和感觉神经组织工程骨的中远期成骨效果和神经肽受体CGRP1R的中远期表达，为进一步深入研究和探讨一种走向临床的构建组织工程骨最优的方法，并为其机制进行初步的探讨。
研究结果证实，延续着短期成骨效应，感觉神经组和血管束组的成果效应在中长期观察中依然优于空白对照组。其中48周时，通过X射线外观可观察出感觉神经组和血管束组的组织工程骨植入处骨髓腔已再通，骨皮质平滑，与正常骨组织类似。这可能是由以下几方面起作用：植入含血管束在组织工程骨中形成新生血管网，重建血液循环，为成骨活动提供营养，并可带走局部代谢产物，并可提高移植骨的抗感染和修复能力；植入的感觉神经束可在组织工程骨中通过出芽形式生长形成新生神经网，感觉神经可释放神经肽，作用于种子细胞，调节其成骨功能；血管束周围结缔组织带劲部分胶原纤维，参与成骨。
研究结果证实，延续着短期观察中的高表达，血管束组CGRP1R mRNA表达在中长期观察中依然优于感觉神经组和空白对照组。联合前期实验，可以发现，实验组各CGRP1R mRNA的表达在8周达到最高峰后，各组 CGRP1R mRNA的表达随着时间的推移，并没有统计学差异，表达趋于平稳[13]。以上的实验结果可能是由于以下原因导致：第一，血管束组织工程骨为神经的再生提供了营养。在实验中可见CGRP1R阳性物质多分布在接近血管周围的地方，而且随着时间推移，新生血管越多其mRNA表达量越大，表明神经的生长依附于新生血管。在研究中，血管束组血管化程度是最高的，所以就可解释本研究各时间点血管束组CGRP1R mRNA表达均为3组中最高的原因。其次，由于血管表面也由自主神经和感觉神经支配来调节血流量，所以，植入血管束的组织工程骨在血管生成过程中，其表面神经也可一并出芽生长，分泌的CGRP也可增加，遂可刺激CGRP1R的表达。第三，从X射线片上看，相比4，8，12周[12-13]，本部分24，48周的骨生成速度有所缓和，骨缺损的修复以骨塑形为主，同时组织学染色的结果表明，在术后24-48周的时间，各组的染色结果和正常骨组织类似，呈现出骨皮质包绕骨髓的形态，而且空白对照组的骨皮质较薄，也表明实验组骨修复过程在中远期观察内趋于完成。所以，随着骨痂表达的CGRP及其受体CGRP1R的表达水平，与新生骨痂最多的第8周相比有所下降，第8周过后的中长期时间点观察区间内，由于各组的骨塑形已逐渐趋于完成，骨痂也基本吸收，遂各组神经肽受体的表达也稳中有降。
最后，有研究表明神经发生通常在靠近血管的部位，加上本研究免疫组织化学染色示CGRP1R可表达于血管腔隙周围，所以血管束植入初期可引发快速的血管化可促进CGRP及其受体CGRP1R的表达，随着时间推移，血管化进程日益平稳，遂CGRP1R的表达也趋于平稳。
前期研究表明，各组在短期各时间点(4，8，12周)中，感觉神经组CGRP1R的表达量要比 空白对照组高[13]。而在中长期的研究中，感觉神经组CGRP1R的表达量和空白

a

a

图4 各组组织工程骨植入后不同时间点的降钙素基因相关肽Ⅰ型受体表达
Figure 4 Expression of calcitonin gene-related peptide type I receptor in each group at different time points after the tissue-engineered bone implantation
图注：与其余两组比较，aP < 0.05。

感觉神经组
血管束组
空白对照组
24 周 48周
降钙素基因相关肽Ⅰ型受体的相对表达
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0
感觉神经组
血管束组
空白对照组
图3 各组组织工程骨植入后不同时间点的股骨X射线评分
Figure 3 Femoral X-ray scores in each group at different time points after the tissue-engineered bone implantation
图注：在24，48周时，感觉神经组和血管束组X射线评分值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，均高于空白对照组(P < 0.05)。

24 周 48周
X射线评分
28
24
20
16
12
8
4
0
图1 实验分组及干预
Figure 1 The experimental allocation and interventions
图注：图中A为制备兔股骨1.5 cm骨缺损模型；B为缺损处植入组织工程骨；C为植入含感觉神经束的组织工程骨修复骨缺损；D为植入含血管束的组织工程骨修复骨缺损。

图2 各组组织工程骨植入后不同时间点的股骨X射线检查
Figure 2 Femoral X-ray images in each group at different time points after the tissue-engineered bone implantation

图注：植入24周后，各组生物材料已降解和吸收，骨痂量较少，已开始塑形阶段，感觉神经组和血管束组骨髓腔已部分再通，塑形程度要优于空白对照组，空白对照组骨皮质还没有完全连续；植入后48周，3组骨塑形程度进一步加强，感觉神经组和血管束组骨髓腔已完全再通，骨皮质顺滑，与正常骨类似，而空白对照组的骨皮质相对紊乱。

感觉神经组 血管束组 空白对照组

24周

48周
图5 各组组织工程骨植入后不同时间点的降钙素基因相关肽Ⅰ型受体表达(免疫组织化学染色，×400，标尺为100 μm)
Figure 5 Expression of calcitonin gene-related peptide type I receptor in each group at different time points after the tissue-engineered bone implantation (immunohistochemical staining, ×400, scale bar=100 μm).
图注：感觉神经组和血管束组降钙素基因相关肽Ⅰ型受体阳性表达强于空白对照组。红色箭头为降钙素基因相关肽Ⅰ型受体阳性表达。

24周

48周

感觉神经组 血管束组 空白对照组

对照组无统计学差异，可能是由于以下原因导致：机体骨质的发生离不开血管供应，而且血管生成先于骨生成，所以说机体的快速血管化是短期成骨过程中的一个特点，前文所述CGRP1R的表达与血管化水平呈正相关，所以在短期研究中，神经肽受体在血管化程度最低的空白对照组中表达量最低。空白对照组血管化进程呈平稳发展，感觉神经组经过了前期的快速血管化之后，在后期的表达亦趋于平稳。所以随着时间延长，经过了24，48周，感觉神经组和空白对照组的血管化均呈平稳进展，这可能是中长期研究中上述2组CGRP1R表达无统计学差异的原因之一。

总之，研究从不同侧面、不同角度对植入含血管束和植入感觉神经束的组织工程骨修复兔大段股骨缺损的成骨
效应及其体内CGRP1R的表达水平变化进行了1年的动态观察，认为，植入含血管束和感觉神经的组织工程骨不仅可很好地促进骨缺损修复，而且与植入感觉神经的组织工程骨相比，植入含血管束的组织工程对神经肽受体CGRP1R的表达水平有促进作用，在长达48周的观测中，CGRP1R在第8周水平到高峰[13]，随后一直平稳表达，这也表示这机体的应激状态已经消除，正处于平稳的恢复期。而与植入感觉神经相比，植入血管束可明显促进组织工程骨内CGRP1R的表达，可说明植入血管束不仅可在体内促进血管化，并可促进组织工程骨的神经化。在植入后48周时，实验组中修复的骨缺损外观正常，骨髓腔再通，与正常股骨类似，在体内已完全构建成功。这也为运用植入血管束来体内构建血管神经化的组织工程骨提供了一个理论依据。
如何在构建组织工程骨组织的同时重新建立其血液供应和神经支配，是骨组织工程从基础研究向临床应用过渡的关键问题。一方面，表面覆盖着神经网的血管在人体来源丰富，易于获取，所以，如果将血管束植入方法构建的血管化组织工程骨应用到临床上，对患者本身的损伤较小；另一方面，由于构建神经化组织工程骨的方法有限，如果一旦将用神经束植入方法构建的神经化组织工程骨应用到临床上，患者不得不以失去体表一个区域的感觉作为代价。研究组通过实验表明，单纯植入血管构建的血管化组织工程骨在术后24周和48周均能促进神经肽受体CGRP1R的表达，此现象说明，血管束植入一方面可加速血管化的进程，另一方面可促进组织工程骨神经化进程，所以血管束植入法是一种符合仿生学要求的较理想的复合组织工程骨构建方法。

作者贡献：陈思圆、王簕、江汕、裴国献进行实验设计，实验实施为陈思圆、王簕，实验评估为陈思圆，资料收集为陈思圆，陈思圆成文，裴国献审校。
利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。
伦理问题：实验方案经南方医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号为45331。实验动物在全麻下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。
文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。
文章外审：文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。
作者声明：陈思圆对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。
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