柞蚕丝素肽的抗氧化及美白功效评价.pdf

柞蚕丝素肽是柞蚕（Antherae pernyi）丝的水解产物，是蚕丝进行高值化利用加工的产品，富含多种氨基酸，此前的研究已表明其具有降血糖1、抗疲 劳2等功能。我国是蚕丝生产大国，从上世纪末期，蚕丝蛋白应用于护肤美容领域的研究就已引起国内外研究人员的关注，主要在亚洲一些国家开展了蚕丝蛋白应用于化妆品或作为生物材料等新用途的研究，并且在高端化妆品领域得到了广泛的应用3。近些年来，随着人们对天然活性成分化妆品的认识不断提升，丝素肽在相关领域的研究也取得了快速进展，已有研究表明丝素肽具有柔肤滋润4、抑菌5、保湿防晒6等护肤功效。氧化损伤是皮肤应对外界压力的内在表现，辟如紫外线对皮肤的辐射，会造成皮肤细胞的氧化损伤7，进而引发晒黑、皱纹、衰老等问 题8，因此具有抗氧化功效成分的护肤品，可以抵御外界压力带来的损伤，缓解皮肤的衰老，起到保护修复的作用，解决美白抗衰等功效的根源问题。本研究针对两种不同分子量的柞蚕丝素肽样品的抗氧化及美白功效进行试验，旨在对柞蚕丝素肽的皮肤保护修复作用进行评价，以期作为天然的美白抗氧化剂，开发相应的护肤产品。1 实验部分1.1 主要试剂与仪器试验用柞蚕丝素肽1号、2号样品由本实验室通过磷酸水解方法、除盐浓缩，喷雾干燥制备获得6，并利用凝胶色谱法对柞蚕丝肽样品的分子量进行测 定2。小鼠胚胎成纤维细胞（Balb/c3T3）、小鼠黑色素瘤细胞（B16），中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；二苯代苦味肼基自由基（DPPH）、酪氨酸酶（菌菇）、-熊果苷，上海麦克林生化科技有限公司；DMEM培养液、胰蛋白酶，赛默飞世尔科技公司；胎牛血清，美国FISHER科学国际公司；噻唑兰（MTT），美国西格玛奥德里奇公司；SOD试剂盒、GSH试剂盒、MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所。Epoch 2连续波长酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；CO2培养箱，赛默飞世尔科技公司；超净工作台，江苏苏净集团有限公司；倒置荧光显微镜，德国徕卡显微系统有限公司；台式离心机，上海安亭科学仪 器厂。1.2 柞蚕丝素肽成分测定采用国标方法GB 5009.1242016食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定对柞蚕丝素肽1号、2号样品的氨基酸成分进行检测9。1.3 柞蚕丝素肽抗氧化活性测定1.3.1 柞蚕丝素肽对DPPH自由基清除率的测定参考文献10的方法，取2 mL一定质量浓度的柞蚕丝素肽溶液添加至2 mL浓度为0.2 mmol/L的DPPH的95%乙醇溶液中，混合震荡后在室温下放置30 min，517 nm下测定OD值，通过下式计算DPPH自由基清 除率：1）式中：A1为2 mL样品液+2 mL DPPH工作液；A2为2 mL样品液+2 mL无水乙醇；A0为2 mL蒸馏水+2 mL A0A0-（A1-A2）DPPH自由基清除率100%=柞蚕丝素肽的抗氧化及美白功效评价李学军 1,2，米 锐 1,2，王林美 1,2，李亚洁 1,2，陈 雪 3，都兴范 1,2,*（1.辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁 大连 116023；2.辽宁省农业科学院大连生物技术研究所，辽宁 大连 116023；3.大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁 大连 116037）摘要：开展柞蚕丝素肽的抗氧化及美白功效研究。结果显示，1号（分子量2 000-5 000 Da）和2号（分子量2 000 Da）样品对DPPH自由基清除率的IC50分别是1.41和3.84 mg/mL，对羟基自由基清除率的IC50分别是0.085和0.091 mg/mL，总还原力水平随着样品添加剂量的增加而升高。柞蚕丝素肽的添加对紫外氧化损伤的小鼠成纤维细胞具有保护作用，能够提高超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽（GSH）含量，降低丙二醛（MDA）含量。在美白功效评价方面，1号和 2号样品对酪氨酸酶抑制率的IC50分别为3.65和5.84 mg/mL，并能够降低小鼠黑素瘤细胞内黑色素合成和酪氨酸酶活性。总之，柞蚕丝素肽具有抗氧化和美白活性，且分子量较大的1号样品优于2号样品。关键词：柞蚕丝素肽；抗氧化；抗紫外氧化损伤；美白中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：2097-2806（2023）08-0891-08893第 8 期开发与应用李学军，等：柞蚕丝素肽的抗氧化及美白功效评价 DPPH工作液。1.3.2 柞蚕丝素肽对羟基自由基清除率的测定参照文献11的方法，取一定质量浓度的柞蚕丝素肽溶液样品1 mL，依次加入1 mL硫酸亚铁（6 mmol/L），2 mL的H2O2（6 mmol/L），混合静置10 min，再加入1 mL水杨酸（6 mmol/L），混合静置30 min后，在510 nm下测定OD值，羟基自由基清除率按下式计算：2）式中：A0为空白对照液的吸光值；Ax为加入柞蚕丝素肽溶液样品后的吸光值。1.3.3 柞蚕丝素肽总还原力的测定参照文献12的方法略有改动，在2.5 mL浓度为0.2 mmol/L的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.6）中加入一定质量浓度的柞蚕丝素肽溶液样品1 mL，再加入2.5 mL质量分数为1%铁氰化钾溶液，混匀后50 恒温20 min，反应后再加入2.5 mL质量分数为10%三氯乙酸，然后3 000 r/min离心10 min。取2.5 mL上清液加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%氯化铁，混匀静置10 min，在700 nm下测定OD值。吸光度越大说明还原力越强。1.4 柞蚕丝素肽对酪氨酸酶抑制率的测定参照文献13中方法，通过测定反应生成的多巴醌的吸光度计算酪氨酸酶抑制率来评价美白性能。用PBS（pH 6.8）配制检测试剂和系列质量浓度梯度的样品溶液，将检测试剂和样品溶液依次加入到酶标板中，在加入200 U/mL的酪氨酸酶溶液后，将酶标板放入37 温育10 min，再加入底物反应10 min，测定其在475 nm处的OD值。酪氨酸酶抑制率按下式计算：3）式中：A为100 L PBS溶液+50 L酪氨酸酶+50 L底物；B为150 L PBS溶液+50 L酪氨酸酶；C为50 L PBS溶液+50 L样品+50 L酪氨酸酶+50 L底物；D为100 L PBS溶液+50 L样品+50 L酪氨酸酶。1.5 柞蚕丝素肽对小鼠Balb/c3T3细胞的抗紫外氧化损伤作用评价1.5.1 细胞培养将小鼠Balb/c3T3细胞从-196 液氮中取出，置37 水浴中快速融化，低速离心（1 000 r/min，5 min），去掉冻存管中培养液后，添加10%胎牛血清的DMEM培养液（pH 7.27.4）于37、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长状态良好时进行传代。A0A0-Ax羟基自由基清除率100%=AOD值-BOD值（AOD值-BOD值）-（COD值-DOD值）酪氨酸酶抑制率100%=1.5.2 柞蚕丝素肽对紫外氧化损伤的小鼠Balb/c3T3细胞增殖的影响MTT法14检测柞蚕丝素肽对小鼠Balb/c3T3细胞增殖的影响，将对数生长期的细胞接种于96孔培养板上，每孔190 L，于37、5%CO2培养箱内培养4 h，待细胞沉淀后加入10 L柞蚕丝素肽进行处理，试验设计1，5，10，15，20和30 mg/mL共6个不同质量浓度的柞蚕丝素肽处理组。以加入10 L灭菌双蒸水作为对照组，并设无细胞调零组。每组4个孔，置37、5%CO2培养箱内分别培养24 h后，加入5 mg/mL MTT 20 L，继续孵育4 h后，弃上清，每孔加入150 L DMSO溶解，室温震荡10 min，于酶标仪490 nm处测定OD值，按照下式计算细胞存活率。依据细胞存活率选择合适剂量组进行紫外UVB光源诱导损伤处理，并对细胞活力进行计算。4）1.5.3 柞蚕丝素肽对紫外氧化损伤小鼠Balb/c3T3细胞中SOD、GSH及MDA的测定通过“1.5.2”中方法培养处理细胞，加入柞蚕丝素肽样品作用细胞24 h后，弃除上清液，用PBS清洗细胞三次，按照试剂盒中方法对细胞进行处理，收集上清液，以Vc作为阳性对照，参照试剂盒说明书，分别测定细胞中SOD活性、GSH及MDA含量。1.6 柞蚕丝素肽对小鼠B16细胞内黑色素合成及酪氨酸酶活性的作用评价1.6.1 细胞培养小鼠B16细胞常用于美白功效研究，采用含有10%FBS的DMEM高糖培养液培养，将细胞置于37、5%CO2饱和湿度环境的培养箱中，隔天换液一次。细胞均采用0.25%胰酶（含0.05%EDTA）消化，按13的体积比传代，每一次实验取自同一传代细胞。MTT法检测柞蚕丝素肽对B16细胞增殖的影响。1.6.2 柞蚕丝素肽对黑色素合成影响参照文献15将对数生长期的B16细胞接种于6孔培养板中，置于培养箱37，5%CO2环境中培养12 h。加入柞蚕丝素肽样品，培养48 h后吸弃培养基，用PBS清洗2遍，加入1 mL 1 mol/L的NaOH溶液裂解细胞，收集细胞裂解液于离心管中，80 水浴30 min，通过高温释放黑色素，吸取100 L上清液至96孔板于475 nm读取吸光度值。以-熊果苷作为阳性对照组，细胞对照组不加样品处理，空白对照组不铺细胞、不加样品处理。黑色素相对含量按下式计算：对照组OD值-凋零组OD值样品组OD值-凋零组OD值细胞存活率100%=894第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）5）1.6.3 柞蚕丝素肽对酪氨酸酶活性的影响收集对数生长期的B16细胞，接种于6孔培养板中，置于培养箱37，5%CO2环境中培养过夜。加入柞蚕丝素肽样品，培养24 h后吸弃培养基，用PBS清洗2遍，每孔加入备好的裂解液100 L，刮取细胞并收集于离心管中，4 下离心20 min，取50 L细胞上清液至96孔板，每孔加入1%左旋多巴50 L，37 孵育1 h后，测定475 nm处吸光度16。以-熊果苷作为阳性对照组，细胞对照组不加样品处理，空白对照组不铺细胞、不加样品处理。细胞反应体系下酪氨酸酶活性按下式计算：6）细胞对照组OD值-空白对照组OD值样品组OD值-空白对照组OD值黑色素相对含量100%=细胞对照组OD值-空白对照组OD值样品组OD值-空白对照组OD值酪氨酸酶活性100%=1.7 数据统计分析每组实验重复3次以上，数据以“xs”表示，组间差异采用SPSS 21.0软件进行方差分析（ANOVA），P0.05表示差异显著。2 结果与讨论2.1 柞蚕丝素肽的氨基酸成分分析从表1的检测数据可以发现，柞蚕丝素肽1号和2号样品的氨基酸成分一致，并且两个样品中每种氨基酸所占比例相差不大。其中丙氨酸、甘氨酸含量最高，二者含量接近60%，酪氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸、精氨酸也分别有较高占比，这6种氨基酸含量接近90%，是柞蚕丝素肽的主要氨基酸组成。表1 柞蚕丝素肽的氨基酸成分（xs，n=3）Tab.1 Amino acid composition of tussah fibroin peptides（x s，n=3）检测项目柞蚕丝素肽1号含量/（g/100 g）柞蚕丝素肽2号含量/（g/100 g）检测项目柞蚕丝素肽1号含量/（g/100 g）柞蚕丝素肽2号含量/（g/100 g）组氨酸1.330.041.260.11赖氨酸0.130.010.150.02酪氨酸10.270.138.970.72丝氨酸9.200.899.310.92异亮氨酸0.470.010.400.08谷氨酸1.510.321.450.21缬氨酸1.020.020.850.18甘氨酸19.530.2318.390.64丙氨酸39.532.0237.621.82蛋氨酸0.020.01 0.020.01 脯氨酸0.560.060.540.08亮氨酸0.540.010.460.03精氨酸4.970.124.630.08苯丙氨酸0.570.020.500.05天门冬氨酸5.160.455.820.52苏氨酸0.450.020.460.052.2 柞蚕丝素肽的抗氧化作用对柞蚕丝素肽1号和2号样品的抗氧化活性进行检测，包括DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和总还原力的测定。其中DPPH自由基清除活性检测是衡量物质抗氧化能力最常用的方法，由图1中曲线可知，DPPH自由基清除率随着样品质量浓度的升高而逐渐升高。柞蚕丝素肽1号和2号样品对DPPH自由基清除率的IC50分别是1.41和3.84 mg/mL，IC50值小表示DPPH自由基清除活性更好，DPPH自由基清除活性为1号优于2号样品。阳性对照VC的DPPH自由基清除率的IC50为0.024 mg/mL。图2为柞蚕丝素肽样品对羟基自由基的清除活性，柞蚕丝素肽1号和2号样品对羟基自由基清除率的IC50分别是0.085和0.091 mg/mL，柞蚕丝素肽样品具有较好的羟基自由基清除活性，且1号优于2号。阳性对照VC的羟基自由基清除率的IC50为0.31 mg/mL。图3是两种样品总还原力的OD值曲线，OD值高则代表总还原力强，因此柞蚕丝素肽1号的总还原力水平高于2号样品。氧化应激是反映机体抵抗氧化损伤的一个重要指标，抗氧化系统能够消除机体高水平的氧化物，一旦机体清除氧自由基的酶活性降低，产生氧化应激损伤，会引发各种疾病15。此前的研究也表明，蚕丝蛋白水解后的多肽具有良好的抗氧化性，图1 柞蚕丝素肽DPPH自由基清除活性Fig.1 DPPH free radical scavenging effect of tussah fibroin peptides246810DPPH?/%?/(mg/mL)020604080100?1?2?895第 8 期开发与应用李学军，等：柞蚕丝素肽的抗氧化及美白功效评价 水解3.5 h时DPPH和羟基自由基清除率分别为58.3%和87.3%17。本研究从DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和总还原力的测定结果分析，柞蚕丝素肽具有较好的抗氧化活性，这与其氨基酸组成有相关性。氨基酸和肽类除了可以为机体提供营养外，带有某些基团的氨基酸形成的多肽具有抗氧化功能，与多肽的分子量、氨基酸组成及氨基酸排列顺序密切相关18。柞蚕丝素肽含量较高的6种氨基酸中，其中甘氨酸是内源性抗氧化剂还原型谷胱甘肽的组成氨基酸，当机体发生严重应激时常外源补充，有时也称为半必需氨基酸19；酪氨酸和天门冬氨酸也是多数天然来源的抗氧化肽的组成氨基酸20；精氨酸作为一种带电子的碱性氨基酸，精氨酸可能通过胍基基团向自由基提供电子并与其作用，终止自由基链式反应，从而显示出还原能力与体外抗氧化能力21。而分析表明，甘氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸、精氨酸在柞蚕丝素肽成分中有较高的占比，由它们形成的多肽，是发挥柞蚕丝素肽抗氧化活性和还原力活性的主要来源，因此柞蚕丝素肽表现出较好的抗氧化活性，且分子量较大的丝素肽1号样品要好于分子量小的2号样品，可以作为抗氧化的添加剂进行应用开发。2.3 柞蚕丝素肽的酪氨酸酶活性抑制作用美白性能一直是护肤应用领域研究的热点，皮肤颜色的变化与表皮层中的黑素细胞产生的黑色素有关。而酪氨酸酶是黑色素生成过程中起限速调节作用的关键酶，可以将酪氨酸氧化成多巴醌，然后生成多巴色素，最终氧化生成黑色素22。紫外线的作用会提高这一氧化反应过程，产生的氧自由基能够促进细胞对酪氨酸酶的表达，从而加速了皮肤色素的沉 着23。因此，通过抑制酪氨酸酶活性来抑制黑色素的生成可以作为皮肤美白的一个方法。图4则反映了柞蚕丝素肽样品对酪氨酸酶活性的抑制作用，1号和2号样品对酪氨酸酶活性抑制率的IC50分别为3.65和5.84 mg/mL，所以柞蚕丝素肽1号的酪氨酸酶活性抑制作用优于2号样品。阳性对照-熊果苷对酪氨酸酶抑制率的IC50为1.12 mg/mL。2.4 柞蚕丝素肽对小鼠Balb/c3T3细胞的抗紫外氧化损伤作用2.4.1 柞蚕丝素肽对小鼠Balb/c3T3细胞增殖的影响细胞增殖活性水平是反映细胞生命力强弱的一个重要指标，应用MTT法通过检测吸光度值的变化反映细胞生长及增殖活性。成纤维细胞是在组织损伤、重建修复中起重要作用的一类细胞，能自主地生成和分泌胶原蛋白和其他蛋白质24。两种柞蚕丝素肽样品对小鼠Balb/c3T3细胞分别处理24 h后，MTT法得到不同质量浓度的柞蚕丝素肽样品对小鼠Balb/c3T3细胞存活率的影响（图5）。经分析表明，小鼠Balb/c3T3细图4 柞蚕丝素肽的酪氨酸酶活性抑制作用Fig.4 Tyrosinase inhibition effect of tussah fibroin peptides?1?2?/(mg/mL)246810?/%020604080图2 柞蚕丝素肽羟基自由基清除活性Fig.2 The hydroxyl radical scavenging effect of tussah fibroin peptides?1?2?12345?/%020604080100?/(mg/mL)图3 柞蚕丝素肽总还原力活性Fig.3 Total reducing power of tussah fibroin peptides?1?2?/(mg/mL)1020304050OD700 nm00.41.20.81.6896第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）胞在1号和2号的质量浓度小于10 mg/mL条件下生长良好，在应用中可作为在细胞中添加剂量的参考，并选择质量浓度为5 mg/mL柞蚕丝素肽样品开展后续实验。经紫外辐射处理之后造成细胞的氧化损伤，测定小鼠Balb/c3T3细胞的存活率，如图6所示，模型组细胞存活率仅为56.3%，丝素肽1号和2号样品组的细胞存活率分别为87.6%和75.6%，反映了添加柞蚕丝素肽对紫外氧化损伤的保护作用。2.4.2 柞蚕丝素肽对紫外氧化损伤的小鼠Balb/c3T3细胞SOD、GSH及MDA的影响SOD活力可以反映机体清除氧自由基的能力，而MDA含量则反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度；GSH具有清除自由基、解毒的生理功能，其含量的多少可以用于衡量机体的抗氧化能力25。结果如图7，8，9所示，与空白对照组比较，模型组SOD和GSH水平显著下降（P0.05），MDA含量显著升高（P0.05），表明细胞正常的抗氧化能力受到损伤，细胞的功能图5 柞蚕丝素肽对Balb/c3T3细胞存活率的影响Fig.5 Ef fect of tussah fibroin peptides on the survival rate of Balb/c3T3 cells?/(mg/mL)?1510152030?/%020604080100120?1?2?图6 柞蚕丝素肽对紫外氧化损伤Balb/c3T3细胞存活率的影响Fig.6 Ef fect of tussah fibroin peptides on the survival rate of Balb/c3T3 cells damaged by UV oxidation?1?/%020604080100120遭到一定破坏。与模型组相比，1号和2号样品组SOD活力分别为18.20和16.56 U/（mg prot），1号样品组与阳性对照组能够提升SOD活力且作用显著（P0.05）；“#”表示与空白对照组比差异显著（P0.05），“*”表示与模型组比差异显著（P0.05），下同图7 柞蚕丝素肽对Balb/c3T3细胞SOD的影响Fig.7 Effect of tussah fibroin peptides on SOD of Balb/c3T3 cells?1?2?SOD?/(U/(mg prot)0515102025图8 柞蚕丝素肽对Balb/c3T3细胞GSH的影响Fig.8 Effect of tussah fibroin peptides on GSH of Balb/c3T3 cells?GSH?/(mol/(g prot)020604010080120140?1?2?图9 柞蚕丝素肽对Balb/c3T3细胞MDA的影响Fig.9 Effect of tussah fibroin peptides on MDA of Balb/c3T3 cells?1?2?0132546897第 8 期开发与应用李学军，等：柞蚕丝素肽的抗氧化及美白功效评价 丝素肽添加组的GSH含量提高，分别为110.23和 102.71 mol/（g prot），2种丝素肽样品组与阳性对照组均发挥显著提升作用（P0.05），阳性对照组作用显著（P0.05）。结果表明柞蚕丝素肽可以通过上调细胞内SOD及GSH的水平，并下调MDA的水平发挥抗氧化作用，减轻紫外辐射对细胞的氧化损伤，且1号效果优于2号。2.5 柞蚕丝素肽对细胞内黑色素合成及酪氨酸酶活性的作用2.5.1 柞蚕丝素肽对小鼠B16细胞增殖影响两种柞蚕丝素肽样品对B16细胞分别处理24 h后，利用MTT法对细胞增殖情况进行检测计算，得到不同质量浓度的柞蚕丝素肽样品对B16细胞存活率的影响（图10）。经分析表明，小鼠B16细胞在1号和2号的质量浓度小于5 mg/mL条件下生长良好，并选择质量浓度为1 mg/mL柞蚕丝素肽样品开展后续实验。2.5.2 柞蚕丝素肽对B16细胞黑色素合成及酪氨酸酶活性影响从图11可以看到，1号和2号丝素肽样品组的黑色素相对含量分别为68.36%和79.12%，与空白对照组相比，柞蚕丝素肽的添加能够显著降低黑色素的相对含量（P0.05），并且1号效果优于2号，说明柞蚕丝素肽能够通过影响细胞内黑色素的合成，进而发挥美白的作用。同时，在黑色素合成过程中，酪氨酸酶起着关键性作用，细胞内酪氨酸酶活性降低，则黑色素的合成会受到影响，也能够间接实现美白的功效。如图12所示，1号和2号丝素肽样品组的酪氨酸酶活性分别为71.35%和79.20%，1号效果优于2号。与空白对照组相图10 柞蚕丝素肽对B16细胞存活率的影响Fig.10 Effect of tussah fibroin peptides on the survival rate of B16 cells15101520020604080100120?1?2?/(mg/mL)?/%比，柞蚕丝素肽添加组都能够显著降低B16细胞内酪氨酸酶的活性（P0.05），因此影响了黑色素的合成，以实现美白的作用。此前也有研究表明，丝腺水解物在质量浓度为0.25 mg/mL区间对小鼠B16细胞无细胞毒性，并且随着质量浓度的增加，酪氨酸酶活性显著降低，也验证了蚕丝水解物具有皮肤美白的功效26。3 结论通过对DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和总还原力的测定，反映了柞蚕丝素肽具有体外抗氧化活性，并且丝素肽的添加可以有效缓解紫外损伤的小鼠成纤维细胞内氧化水平，提高SOD活力和GSH含量，降低MDA含量。柞蚕丝素肽对酪氨酸酶活性具有抑制作用，还能够降低小鼠黑素瘤细胞内黑色素合成和酪氨酸酶活性，间接发挥了美白的功效。总之，柞蚕丝素肽具有抗氧化及美白活性，且分子量较大的丝素肽1号样品的抗氧化及美白活性均优于分子量小的丝素肽2号样品，未来可以作为抗氧化和美白性能的图12 柞蚕丝素肽对B16细胞酪氨酸酶活性的影响Fig.12 Ef fect of tussah fibroin peptides on the tyrosinase activity of B16 cells?/%020604080100120?1?2?图11 柞蚕丝素肽对B16细胞黑色素相对含量的影响Fig.11 Ef fect of tussah fibroin peptides on the melanin content of B16 cells?/%020604080100120?1?2?898第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）添加剂应用于化妆品的开发中。参考文献：1 Mi Rui.Preparation of the peptides of tussah silk by hydrolysis and investigation of their impacts on blood glucose levels D.Dalian:Dalian University of Technology,2015.2 Li Xuejun,Mi Rui,Du Xingfan,et al.Preparation of tussah silk peptides and their anti-fatigue effect in mice J.Science of Sericulture,2017,43（6）:998-1003.3 Holland C,Numata K,Rnjak J,et al.The biomedical use of silk:past,present,future J.Advanced Healthcare Materials,2019,8.4 Li Linbei,Lin 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