BIORAD荧光定量PCR原理和方法介绍PPT课件.ppt

刚做实验的同学，很多时候希望别人帮自己设计好引物，其实这种方式是不可取的，首先是高估了引物设计的难度，其次也自己的实验别人了解的并不多，还有就是引物设计其实是实验者必备的技能。这里讲述下RT-PCR设计的基本原则。1.上下游上下游引物引物要保守：要保守：为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行pcr扩增。所以引物的选取也要非常的保守，最好不要有不同的碱基，若不得不有时，也必须保证引物的3端至少有4个碱基是完全保守才可。在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5端引物位置找的是3端至少有5个bp保守，在即在发表序列的3端引物位置找的是5端至少有5个bp保守。5NNNNNNN 3发表序列：5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-33NNNNNNNNN 52.上下游引物的上下游引物的长长度和度和Tm值值：上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60之间。确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3端最好不为G或/和C。引物3端的5个碱基不应出现2个G或/和C。上游引物应标记F(forword)，且在基因组的位置及长度;下游引物应标记R(reverse)，且在基因组的位置及长度。用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超过2，长度相差最好不超过4bp。3.引物的引物的评评价：价：用DNAstar 软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入引物的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的引物序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primer self dimer”,分析引物的二聚体。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个dimer，并对此引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primer hairpins”,分析引物的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个hairpins，并对此引物的hairpins进行评价。再选择所需要的上下游引物，在“report”菜单下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好(dG值通常为负值)，绝对值超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行)。不必考虑引物与探针之间的配对与发夹结构，因为探针的Tm值非常之高。4.上下游引物与上下游引物与探探针针的距离的距离(上下游引物的位置上下游引物的位置)：理论上讲，上游引物的3端离探针的5端为1-20bp，最佳是1bp，最近为上游引物的3端离探针的3端为4bp;下游引物要与探针有一定的距离，但要保证下游引物的3端离探针的3端最为15-150bp。整个目的片段的长度最好在50-150bp之间，最长不超过 200bp。5.随机引物：随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。当特定mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA 中96%来源于rRNA。6.Oligo dT：适用于具有PolyA尾巴的RNA。(原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。)由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。是一种对mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA 可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。7.基因特异性引物：基因特异性引物：与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。用含目标RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。缺点是只能用于单一基因的PCR实验。PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。上述内容罗列了RT-PCR设计的基本原则，都是些理论的知识，大家在用软件设计引物的时候可根据这些理论知识和软件设计评估结果选择最佳的上下游引物序列提 纲 荧光定量PCR的原理和应用 荧光定量PCR实验的设计和优化 仪器软件的操作和仪器的维护 引物和探针的设计 常见问题及解决方案 荧光定量 PCR的原理PCR 反应过程5533d.NTPsTaq 酶Primers5353535353535353反反应组应组分分变变 性性535353535353延延 伸伸53535353353TaqTaq55重重 复复退退 火火5353535355335353循循环环2 24 4个拷个拷贝贝循循环环3 38 8个拷个拷贝贝53535353535353535353533553535353Cycle#TheoreticalReal LifeLog Target DNAPCR反应模式 Relative FluorescenceRelative Fluorescence终点检测In AdditionIn Addition同一样品重复96次的实验结果Lockey etal.(1998)Biotechniques 24:744-6终点法和实时法的结果比较 实时PCR（real time PCR）能够在扩增的同时对扩增产物的量测量或定量。C CT TCt值的设定扩增产物的相对荧光强度达到设定的阈值时所经过的循环数。1)设定基线2)设定阈值3)CT 值就是扩增曲线和阈值的交点所指示的循环数。阈值设定的越高，CT值越大。CycleCt值和起始模板量的对应关系Template abundance in 6 samples.23.823.723.6Low Ct,high amount35.635.335.2High Ct low amountCorrelation Coefficient,Slope and PCR Efficiency(cont.)相关系数相关系数相关系数相关系数标标标标准准准准 曲曲曲曲线线线线的斜率和的斜率和的斜率和的斜率和扩扩扩扩增效率相关增效率相关增效率相关增效率相关Efficiency(Efficiency()=10)=10(-1/slope)(-1/slope)-1 1荧光PCR的原理插入染料法杂交探针法5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反反应组应组分分变变 性性535353535353插入染料方法的原理插入染料插入染料TaqIDl延延 伸伸53535353检测检测激激发发的的荧荧光光535355TaqTaq353TaqTaq55退退 火火IDIDIDIDIDIDIDIDIDIDllllln相对杂交探针方法，插入染料法相对较便宜n不需要特别设计探针nSYBR Green I,最常用的插入染料nSYBR Green 染料插入双链DNA，检测灵敏度提高1000倍。n和杂交探针方法相比，插入染料法特异性低。n不能做多重PCR。插入染料能够和引物二聚体和非特异性扩增产物结合杂交探针方法 TaqMan 探针分子信标探针（Molecular Beacons）FRET探针 TaqMan探针5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应体系变 性535353535353Taql53RQProbe53RQ535353RQ退 火531.链取代Taq3QR5533QTaqR52.水 解3.聚 合53QTaqR354.检测荧光533QTaqR5l产生很强的荧光信号容易设计和合成可以做多重检测能够进行SNP(Single Nucleotide Polymorphism)检测比插入染料贵Tm值比引物高10长度不超过30bp5端不能是GTaqman 探针设计5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反反应组应组分分分子信标(Molecular Beacons)变变 性性535353535353Taq53RQRQMolecularBeacon5353531.链替换Taq52.聚合完成l53RQ退 火53RQ5335TaqR QMolecularBeaconSNP 检测，较Taqman探针有更大的温度选择性 多重PCR难设计和合成产生的荧光信号较低价格昂贵5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反反应组应组分分FRET 探针变变 性性535353535353Taq53RQDRFRET 探针5353l3DR5退 火53链替换,荧光熄灭5335Taq3DR1-5 basesDRTaq5R5特异性好SNP 检测难设计费用昂贵Texas Red,ROXTexas Red,ROXCY3.5,Redmond RedCY3.5,Redmond Red常用的荧光基团FAMFAMTET,VICTET,VICCY5CY5CY5.5,LC705CY5.5,LC705LC640LC640HEXHEXJOEJOECY3CY3TAMRATAMRA应 用相对定量绝对定量突变检测等位基因检测相对定量 参考基因：Actin,GAPDH,18sRNA靶基因AGAPDHCt对照组25.219.55.7实验组22.120.81.31计算Ct：Ct=Ct 靶基因Ct GAPDH，分别计算实验组和对照组的Ct。2计算Ct：Ct=Ct实验组Ct对照组，本例中Ct=4.4。3计算相对表达量的差值。2 Ct 绝对定量构建标准曲线：A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。B、利用纯化的扩增产物制备 C、克隆有扩增产物的质粒 突变检测熔点曲线分析功能SYBR GreenFRET 探针分子信标探针等位基因功能MGB 探针Taqman 探针？熔点曲线分析o 反向引物的中间用Cy5 标记o 和wild type 杂交的探针用FAM标记o 不对称PCR，提高反向引物浓度SNP 检测-FRET混合型野生型突变型等位基因功能MGB探针实验设计和优化影响PCR的因素扩增效率非特异性扩增、引物二聚体、扩增产物的长度和二级结构重复性敏感性动力学范围GoodGoodBadBad =131%=131%r=0.982r=0.982 =101%=101%r=0.997r=0.997好坏数据比好坏数据比较较No template control400 copies10,000 copies2,000 copies引物二聚体 Tm=78C引物二聚体对结果的影响特异性产物Tm=89C82 C 采集荧光信号 =66.3%=66.3%Reverse primer A1 1110110Forward PrimerForward PrimerReverse Primer Reverse Primer A A避免二级结构 =95.8%=95.8%Reverse primer BForward Forward PrimerPrimer1 1110110Reverse Primer Reverse Primer B B2nd generation-85 bp ampliconAvoid Secondary Structure(cont.)Optimizing Primer location定量方法的选择绝对定量？动力学范围？相对定量？参考基因？扩增效率？扩增片段扩增片段的大小探针的区域序列的特异性490nm：FAM/SYBR530nm：HEX/TET/VIC/CY3575nm：TexasRed/ROX635nm：CY5/LC640荧光标记PCR反应分开扩增？同时扩增（二重PCR）？实验条件的优化Taq酶，Mg2+d NTPs引物浓度探针浓度退火温度CT值越小，表明反应效率越高多重PCR的优化标准品的动力学范围反应条件的优化：降低高丰度基因的引物浓度，提高低丰度基因的引物浓度相对定量的扩增效率Concentration(10n)Threshold CycleThreshold CycleConcentration(10n)Ct 比较Concentration(10n)Ct RNA逆转录效率 提取效率PCR污染问题UNG 酶分区单独的移液器带滤芯的tip紫外照射引物和探针的设计查找文献确定目的基因查找基因序列序列分析引物与探针的设计验证引物与探针的特异性引物设计原则长度：20-27ntG+C含量：45-55%碱基的随机分布：3端不应超过3个连续的G或C引物自身：不应存在互补序列引物之间：不应有互补性，尤应避免3端的互补重叠引物的3端:3也不能有形成任何二级结构的可能引物的特异性