高二生物基因工程和细胞工程PPT课件.ppt
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1、 生物材料生物材料DNAmRNA一定大小范围一定大小范围DNAPCRcDNA(互补(互补DNA)反转录基因组文库基因组文库 cDNA文库文库 基因文库基因文库包括人工合成人工合成限制酶切割获取目的基因获取目的基因构建表达载体构建表达载体导入受体细胞导入受体细胞得到转基因生物得到转基因生物目的基因检测与鉴定目的基因检测与鉴定第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序获取目的基因获取目的基因生物材料生物材料PCRPCRcDNAmRNAmRNADNADNA基因组文库基因组文库cDNAcDNA文库文库一定大小范围一定大小范围DNADNA人工合成人工合成
2、逆转录逆转录限制酶切割限制酶切割获取目的基因获取目的基因构建表达载体构建表达载体导入受体细胞导入受体细胞得到转基因生物得到转基因生物目的基因检测与鉴定目的基因检测与鉴定第一步第一步第一步第一步第二步第二步第二步第二步第三步第三步第三步第三步第四步第四步第四步第四步基因文库基因文库(gene library)(gene library)概念概念u又称又称DNADNA文库,是指某个生物的文库,是指某个生物的基因组基因组DNADNA或或cDNAcDNA片段片段与与适当的载体适当的载体在体外重组后,转化在体外重组后,转化宿主细胞宿主细胞,通过筛选后得到大量的阳性菌落,通过筛选后得到大量的阳性菌落(或噬
3、菌体或噬菌体),所有菌落或噬菌体的集合即为,所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。该生物的基因文库。u基因文库由外源基因文库由外源DNADNA片段片段、载体载体和和宿主细胞宿主细胞组组成。成。基因组文库(Genomic library)将某种生物体的将某种生物体的全部基因组全部基因组DNADNA用限制性内用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNADNA片段,再与合适的片段,再与合适的载体载体在体外重组并转化相在体外重组并转化相应的应的宿主细胞宿主细胞获得的所有阳性菌落。获得的所有阳性菌落。该文库该文库以以DNADNA片段的形式贮存着该生物全部基因
4、组片段的形式贮存着该生物全部基因组的信息,可用于的信息,可用于分离目的基因和保存某种生分离目的基因和保存某种生物的全部基因。物的全部基因。基因组文库基因组文库cDNA文库(cDNA library)提取某生物组织或发育时期的总提取某生物组织或发育时期的总mRNAmRNA,经反转,经反转录产生的录产生的cDNA cDNA(complementary DNA(complementary DNA,互补,互补DNA)DNA)片段分别与克隆片段分别与克隆载体载体重组,储存于重组,储存于受体菌受体菌中,该群体就称该生物基因组的中,该群体就称该生物基因组的cDNAcDNA文库。文库。结构基因结构基因外显子外
5、显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNAmRNAcDNAcDNA文库文库反转录酶反转录酶cDNAcDNA克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定 构建基因文库的基本程序构建基因文库的基本程序1)1)提取研究对象基因组提取研究对象基因组DNADNA,制备合适大小的,制备合适大小的DNADNA片段,片段,或提取组织或器官的或提取组织或器官的mRNAmRNA并反转录成并反转录成cDNAcDNA;2)DNA2)DNA片段或片段或cDNAcDNA片段与经特殊处理的片段与经特殊处理的载体载体连接形成重连接形成重组组DNADNA;3)3)重组重组D
6、NADNA转化转化宿主细胞宿主细胞或体外包装后侵染受体菌;或体外包装后侵染受体菌;4)4)阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组文库的类型基因组文库的类型 根据所选用的根据所选用的载体载体可以分为:可以分为:质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库(细质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库(细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库)。菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库)。高等生物的基因组高等生物的基因组DNADNA十分复杂十分复杂,单个基因在基因单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很组或某个特定发育阶段
7、或特定组织中所占比例很小。因此,要想从庞大的基因组中分离某个特定小。因此,要想从庞大的基因组中分离某个特定的的未知基因未知基因非常困难,因此先把材料非常困难,因此先把材料DNADNA分成若分成若干易于处理的片段,然后确定目标序列在哪一片干易于处理的片段,然后确定目标序列在哪一片段,再进一步从该片段寻找目标序列,事情就变段,再进一步从该片段寻找目标序列,事情就变得容易了。得容易了。为什么要建为什么要建基因文库?基因文库?从基因文库中筛选目的基因1.1.通过克隆序列筛选:通过克隆序列筛选:核酸杂交核酸杂交和和PCRPCR2.2.通过表达产物筛选:通过表达产物筛选:免疫学检测免疫学检测(抗原抗体反(
8、抗原抗体反应)应)探针探针探针是一小段带标记的单链DNA或者RNA片段(大约是20到500bp),用于检测与其互补的核酸序列。最初是使用带放射性的最初是使用带放射性的DNADNA探针,通过放射自显影探针,通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法,将探针来显示位置。后来又发明了免疫探针法,将探针核苷酸的侧链加以改造,探针杂交后,其侧链可核苷酸的侧链加以改造,探针杂交后,其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别,从而显示出位置。被带有荧光标记的抗体所识别,从而显示出位置。核酸杂交(核酸杂交(菌落原位杂交法菌落原位杂交法)直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经
9、溶菌和变性处理后使经溶菌和变性处理后使DNADNA暴露出来并与滤暴露出来并与滤膜原位结合膜原位结合,再与特异性再与特异性DNADNA探针探针杂交杂交,筛选筛选出含有目的序列的菌落。出含有目的序列的菌落。对应的菌斑或噬菌斑位置不变,对应的菌斑或噬菌斑位置不变,可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。特点:特点:免疫筛选法(一)免疫筛选法(一)放射性抗体检测法放射性抗体检测法滤膜(固定抗体)滤膜(固定抗体)+免疫沉淀检测法免疫沉淀检测法菌落菌落沉淀素沉淀素免疫筛选法(二)免疫筛选法(二)PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因已知基因:已知基因:设计合成一对引物,直接从基因组DNA中扩增该目的
10、基因。未知基因:未知基因:参照其他物种中该基因的两末端设计引物,从基因组DNA(或文库)中扩增该目的基因;依照其他物种中该基因的保守区段序列设计引物,扩增出一段DNA,标记为探针,从基因组文库、cDNA文库中钓出该基因。PCRPCR法获取目的基因的前提是:法获取目的基因的前提是:要有足够制备要有足够制备合适引物的信息合适引物的信息PCRPCR法获取目的基因优点法获取目的基因优点1.简便快速:在有足够引物信息的情况下,可直接从基因组DNA中克隆目的基因,大大减少了基因分离的工作量;2.灵敏度高:可从极微量的模板扩增出目的片段;3.对起始材料质量要求低:由于其灵敏度高和特异性强,极微量的材料或者混
11、合的组织、部分已降解的DNA材料都可以作为起始材料;化学合成制备目的基因 如果蛋白分子较小,可根据氨基酸序列推导出其基如果蛋白分子较小,可根据氨基酸序列推导出其基因序列,采用人工合成的方法制备目的基因。化学合成法因序列,采用人工合成的方法制备目的基因。化学合成法通常主要用于制备探针和引物。通常主要用于制备探针和引物。磷酸二酯法亚磷酸三酯法获取目的基因的方法一般来说:一般来说:目的基因的获得通常采用PCR法;化学合成法由于合成的片段较短,一般用于引物和探针的合成;基因文库一般用于保存基因资源。目的基因检测与鉴定通常采用通常采用分子杂交分子杂交的方法。的方法。分子杂交:采用已知标记的核酸分子或蛋白
12、质分分子杂交:采用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子。子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子。根据其检测对象的不同可分为根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交杂交(DNADNA)、)、Northern 杂交杂交(RNARNA)和)和 Western 杂杂交交(蛋白质)。分子杂交的方法分子杂交的方法 通常是采用各种方法将核酸(蛋白质)通常是采用各种方法将核酸(蛋白质)分子固定在固相支持物上,然后用放射性分子固定在固相支持物上,然后用放射性元素等标记的探针(抗体)与被固定的分元素等标记的探针(抗体)与被固定的分子杂交,经显影(显色)后显示出目的核子杂
13、交,经显影(显色)后显示出目的核酸(蛋白质)分子。酸(蛋白质)分子。Southern杂交(检测目的基因是否插入到受体细胞基因组中)(1)(1)提取提取 DNADNA,酶切,凝胶电泳分离各酶切片段,然后,酶切,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使使DNADNA原位变性。原位变性。(2)(2)将将DNADNA片段转移到固体支持物片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼硝酸纤维素滤膜或尼龙膜龙膜)上。上。(3)(3)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4)(4)让探针与同源让探针与同源DNADNA片段杂交,然后漂洗除去非特异片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。性
14、结合的探针。(5)(5)通过显影检查目的通过显影检查目的DNADNA所在的位置。所在的位置。放射自显影放射自显影DNA印迹转移印迹转移探针杂交探针杂交 提取分离受体细胞的提取分离受体细胞的mRNA,mRNA,将将mRNAmRNA分子分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上,进行核酸杂交的化学修饰的活性滤纸上,进行核酸杂交的一种实验方法。一种实验方法。Northern杂交(检测目的基因是否转录出了mRNA)NorthernNorthern杂交的过程杂交的过程 提取总提取总RNARNA 分离分离mRNAmRNA:利用亲和层析的原理纯化:利用亲
15、和层析的原理纯化mRNAmRNA。制制备备目目标标RNARNA的的探探针针:根根据据mRNAmRNA序序列列合合成成同同源源DNADNA探针,或以探针,或以cDNAcDNA为探针。为探针。NorthernNorthern杂杂交交:通通过过显显影影检检查查目目的的DNADNA所所在在的的位位置。置。SouthernSouthern杂交和杂交和NorthernNorthern杂交过程示意图杂交过程示意图 Western杂交(检测目的基因是否翻译成蛋白质)中文一般称为蛋白质印迹技术。其基本原理是通过特异性抗体特异性抗体对凝胶电泳分离的细胞或生物组织蛋白样品进行检测。Western Blot与Sout
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