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Promega--双萤光素酶报告基因.ppt
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1、REPORT SMARTLY萤光素酶报告基因技术自然界的萤光自然界的萤光发光海星发光海星发光甲壳虫发光甲壳虫发光真菌发光真菌发光节虫发光节虫自然界的萤光自然界的萤光发发光光鱼鱼发发光光甲甲虫虫自然界的萤光自然界的萤光萤萤火火虫虫报告基因的作用报告基因的作用细胞信号转导途径启动子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药物诱导作用或”效果”荧光荧光 -Fluorescence萤光萤光 -LuminescenceFireWormLuminescence vs.Fluorescence萤光(Bioluminescence)荧光(Fluorescence)q是化学发光(Chemilumi-nesce
2、nce)的一种,激发能量来自化学反应q 吸收来自光源的光,再发射 另一光子q萤光发光计(Luminometer)q 荧光计(Fluorometer)液闪仪(Scintilation Counter)电荷耦合装置光学成像系统(CCD opitical imaging system)荧光显微镜各种报告基因的优点和缺点各种报告基因的优点和缺点报告基因优点缺点萤光素酶优越的灵敏度高信号值无内源活性需要底物-gal灵敏度好细菌,血清等内源活性高需要底物GUS(葡糖醛酸糖苷酶)灵敏度好植物中内源活性低 90%的 E.coli,人动物细胞中有内源活性酶的扩散可引起“过度报告”需要底物SEAP(分泌性碱性磷酸
3、酶)分泌性报告基因(不需裂解)在 HeLa,癌 和其它细胞类型中有高的内源活性需要底物CAT(氯霉素转乙酰基酶)-真核细胞没有背景表达-易于使用-设备现成(液闪仪,层析)放射性的灵敏度底50半衰期GFP(绿色荧光蛋白)显微镜:亚细胞定位不需底物背景可能高折叠“情形”可导致信号差别萤光素酶报告基因的主要优点萤光素酶报告基因的主要优点非放射性非放射性检测快(比检测快(比CAT等)等)灵敏度高灵敏度高(可比CAT检测灵敏度高100倍)半衰期短(在理想条件下,可检测到半衰期短(在理想条件下,可检测到1010-20-20 摩尔的萤光素酶分摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期子。在哺乳动物细胞中半衰
4、期3 3小时,在植物细胞中半衰期小时,在植物细胞中半衰期3.53.5小时。而小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约在哺乳动物细胞中的半衰期约5050小时)小时)线形范围广线形范围广(在(在1010-16-16 M(10pg/L)至至1010-8-8 M(1mg/L)范围内范围内,光光强度与萤光素酶浓度成正比)强度与萤光素酶浓度成正比)一般比显微镜检测的荧光更灵敏一般比显微镜检测的荧光更灵敏(对多孔板而言对多孔板而言)生物萤光比荧光更稳定生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射因为自然界进化的酶能保护光子发射器器通过基因工程可以延伸生物萤光的性能通过基因工程可以延伸生物萤光的性能
5、和能力萤光素酶报告基因的使用萤光素酶报告基因的使用原理:制备含有 luc/Rluc 的DNA转染提供刺激测量萤光调节序列调节序列Luc在活细胞中做报告基因检测在活细胞中做报告基因检测外界刺激外界刺激(导引物导引物)萤光素酶基因萤光素酶基因蛋白质折叠蛋白质折叠调节序列调节序列加工加工转录转录转录因子转录因子信号转导信号转导翻译翻译反义反义 RNA受体受体蛋白蛋白-蛋白蛋白相互作用相互作用RNA 酶酶病毒感染病毒感染和增殖和增殖RNAi 抑制抑制启动子启动子/增强子分析增强子分析“碰撞启动子碰撞启动子”:1)1)全序列全序列:2)逐步缺失逐步缺失:Promoterluc+LightPromoter
6、luc+LightPromoterluc+Firefly and Renilla萤火虫生物萤光的化学萤火虫生物萤光的化学萤光素萤光素 +ATP +O2萤光素酶萤光素酶Oxyluciferin +AMP+PPi +CO2 +Light萤光素酶萤光素酶:单体单体,61,000 Daltons辅辅-底物底物:ATP.Mg 2+萤光素萤光素:Mg2+海肾萤光素酶反应海肾萤光素酶反应Coelenterazine +O2萤光素酶萤光素酶Coelenteramide+CO2 +Light萤光素酶萤光素酶:单体单体,36,000 Daltons萤光素萤光素:(Coelenterazine)ENZYME STR
7、UCTURESFireflyRenilla为什么要使用双报告基因为什么要使用双报告基因报告基因报告基因 A(首要信号首要信号)报告基因报告基因 B(第二信号第二信号)特异生物学反馈特异生物学反馈+非特异生物学反馈非特异生物学反馈非特异生物学反馈非特异生物学反馈检测结果检测结果比较首要与第二信号确定比较首要与第二信号确定 特异生物学反馈特异生物学反馈细胞可能有内源脱乙酰基酶-Gal 或 GUS 活性.CAT,-Gal 和 GUS 检测是终点检测.不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或-Gal,的两个报告基因的检测都灵敏而快速传统的双报告基因的缺点传统的双报告基因的缺点双萤光素酶报告基因系
8、统比用双萤光素酶报告基因系统比用CAT和和-GAL做内对照做内对照的优点的优点速度样品不需预处理,不需孵育。两次检测在几秒种内完成灵敏两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低方便一管完成检测,样品不必分份实验质粒实验质粒对照质粒对照质粒用海肾萤光素酶作对照归一实验变化用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应归一反应=对照的(海肾萤光素酶对照的(海肾萤光素酶)实验的实验的(萤火虫萤光素酶萤火虫萤光素酶)萤火虫萤光素酶萤火虫萤光素酶海肾萤光素酶海肾萤光素酶用两个萤光素酶做报告基因用两个萤光素酶做报告基因(萤火虫(萤火虫+海肾)海肾)数据处理举例数据处理举例第一天萤光素酶活性
9、(RLU)比率 归一的活性样品处理重复(F:R)变化倍数对照 5,128 2,511 7,553 3,815 10,555 5,413 7,745 3,913 1.981.00处理 5,1376 4,467 40,712 3,5743 88,787 7,654 6,0292 5,232 11.525.82处理B1 587,635 5,1442 988,347 8,8323 409,881 3,564 661,954 5,847 113.2157.18第二天对照15,529 20,433 0.76 21,897 30,841 0.71 10,760 13,620 0.79 16,062 21,6
10、31 0.741.00处理 850,239 20,843 578,951 14,830 943,873 21,788 791,021 19,154 41,3055,81处理D 1 14,865 19,3-052 8,967 12,2843 13,767 20,246 12,533 17,278 0.730.99 活性倍数活性倍数(F/R)样品品 =F/R)对照照第二天第二天处理理计算如下:算如下:活性倍数活性倍数 (791,021/19,154)=(16,062/21,631)=55.81=55.81GLOMAX 20/20SINGLE TUBE LUMINOMETERGLOMAX 96 LU
11、MINOMETERWHITE MICROPLATES FOR LUMINESCENCEPROMEGA公司出品的双报告基因实验产品公司出品的双报告基因实验产品质粒萤火虫萤光素酶质粒海肾萤光素酶质粒叩头虫萤光素酶质粒检测系统非均质双报告基因检测系统(通量较低)均质的双报告基因检测系统(适合高通量,自动化)载体-萤火虫萤光素酶载体pGL3 家族家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-PromoterPGL3-BASIC MAPPGL3-CONTROL MAPPGL3-ENHANCER MAPPGL3-PROMOTER MAP辅助报告基因的相对萤光单位辅助报
12、告基因的相对萤光单位 (RLU)启动子交叉交谈或互相干扰启动子交叉交谈或互相干扰 实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节 内对照载体可能存在的问题内对照载体可能存在的问题 载体载体 -海肾萤光素酶报告基因载体海肾萤光素酶报告基因载体第二代第二代第一代第一代phRL-null pRL-nullphRL-TK pRL-TK phRL-TK(int-)phRL-SV40 pRL-SV40phRL-CMV pRL-CMVphRG-BphRG-TKRenilla 萤光素酶载体系列萤光素酶载体系列内含子内含子T7 启动子启动子CMV即时早期增强子即时早期增强子/启动子启动
13、子phRL-CMV HSV TK 启动子启动子phRL-TKSV40 晚晚poly(A)SV40 早期早期 增强子增强子/启动子启动子phRL-SV40MCSphRL-nullhRL 基因基因 TK 启动子启动子phRL-TK(Int-)MCSphRG-B合成合成 poly(A)信号信号转录停止位点转录停止位点三个读码框的三个读码框的终止密码子终止密码子phRG-TK合成合成 poly(A)信号信号转录停止位点转录停止位点三个读码框的三个读码框的终止密码子终止密码子TK 启动子启动子hRL 基因基因SV40 晚晚 poly(A)Renilla 萤光素酶载体系列萤光素酶载体系列用萤火虫和海肾两个
14、萤光素酶做报告基因用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因Dual-Luciferase 双萤光素酶报告基因系统(非均质检测)E1910,100次E1960,E1980,1000次Dual-GloTM 萤光素酶检测系统(均质检测)E2920,10mlE2940,100mlEE2980,10X100ml均质检测与非均质检测均质检测与非均质检测发光发光细胞细胞+培养基培养基添加试剂添加试剂细胞细胞+培养基培养基除去培养基除去培养基发光发光清洗细胞清洗细胞裂解细胞裂解细胞添加试剂添加试剂均质检测均质检测非均质检测非均质检测DUAL-LUCIFERASE报告基因检测系统组报告基因检测系统组分分检测缓冲液I
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- 关 键 词:
- Promega 萤光 报告 基因
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