DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制ppt课件.ppt

第第四四节DNA限制限制酶切反切反应和和限制限制酶谱绘制制1.一一DNA的限制的限制酶反反应1.酶单位定位定义:使使1g某种某种DNA在最适反在最适反应条件下和条件下和1小小时内内完全完全酶切所需的限制切所需的限制酶活性。活性。2.酶切反切反应类型型1)完全完全酶切切SV40(5243bp)pBR322(4363bp)2)部分部分酶切切3.酶切反切反应最适条件最适条件1)DNA分子的分子的组成成i.碱基碱基组成与排列方式成与排列方式ii.识别位位点点两两侧的的碱碱基基组成成与与排排列列方方式式，同同一一DNA分分子子中中不不同同识别位点的位点的酶切速度可相差切速度可相差10倍（如倍（如中的中的EcoRI位点）位点）2)反反应条件条件i.DNA溶液的溶液的纯度和度和浓度度（反（反应浓度）度）依依实验目的而定目的而定HpaI(CCGG)126ThaI(CGCG)0232.ii.限制限制酶的的纯度和度和稳定性定性i)纯度：尽可能保持厂家推荐的反度：尽可能保持厂家推荐的反应条件条件ii)稳定性：保存和反定性：保存和反应iii.反反应缓冲液冲液：常用三种核心：常用三种核心缓冲液，即高（冲液，即高（H），中（），中（M），），低（低（L）盐缓冲液，不同温度下的冲液，不同温度下的pH值iv.反反应温度温度：大多数：大多数为37v.双双酶切和多切和多酶切反切反应同同时酶切和分切和分别酶切。前者要求两种切。前者要求两种酶使用的使用的缓冲液和反冲液和反应温度必温度必须相同，即使相同相同，即使相同时，一旦，一旦发生部分生部分酶切反切反应，便无法判断是何种便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者造成的，因此最好采用后者-分分别酶切。切。i)第一种第一种酶切切电泳泳检查酚酚/氯仿仿纯化化第二种第二种酶切。切。可不考可不考虑酶切先后切先后顺序，但操作步序，但操作步骤多。多。ii)采用低采用低浓度度盐缓冲液的限制冲液的限制酶切切电泳泳检查采用高采用高浓度度盐缓冲液的限制冲液的限制酶切。操作切。操作简单，但要分先后。，但要分先后。假如两假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考虑的的则是相互是相互间的的酶切是否有影响，两种切是否有影响，两种酶切切顺序不同序不同时，其其结果大不相同。果大不相同。如如SmaI-BamH(c),BamHI-SmaI(p)3.二、限制二、限制酶图谱的的绘制制1.完全完全酶切作切作图法法1）单酶切作切作图法法一一长度度为5Kb的的线状状DNA分子用两种限制分子用两种限制酶完全完全酶切的凝胶切的凝胶电泳泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用下述果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用下述辅助方法之一。助方法之一。i.单酶部分部分酶切：部分切：部分酶切切时，各种可能性均存在，但只，各种可能性均存在，但只有相有相邻的两个的两个DNA片段才有可能出片段才有可能出现在凝胶上。在凝胶上。4.ii.末端末端标记完全完全酶切切DNA片段片段末端末端标记完全完全酶切切凝胶凝胶电泳泳EtBr染染色色观察察放射自放射自显影影2)双双酶切作切作图法法 单酶切切结果只能确定一种果只能确定一种酶的位点，要将两种的位点，要将两种单酶切切结果画果画在一在一张图上上时则不行不行5.分分别作作图时，同一种，同一种酶的两种作的两种作图法都是法都是对的，但当作在一的，但当作在一张图上上时，上述两种可能性中只有一种是，上述两种可能性中只有一种是对的，因此必的，因此必须进行双行双酶切反切反应，其，其结果果见图根据上述的原理和步根据上述的原理和步骤，前述的，前述的5Kb片段片段酶I与与酶II的定位的定位结果可用两种方法之一：果可用两种方法之一：i)单酶切切分离分离DNA片段片段第二种第二种酶切切凝胶凝胶电泳泳ii)单酶切切第二种第二种酶切切凝胶凝胶电泳泳*如果要同如果要同时将两种限制将两种限制酶定位在一条定位在一条DNADNA上上时，单酶完全完全酶切切作作图就没必要了。就没必要了。6.2.末端末端标记-部分部分酶切作切作图法法（Smith-BrinstielSmith-Brinstiel法）法）DNA片段片段末端末端标记酶1切切分离分离带标记DNA片段片段酶2部分部分酶切切电泳泳EtBr染染色照相色照相放射自放射自显影影结果果单端端标记方法方法:人工合成人工合成单端端标记法法限制限制酶切切单端端标记法法7.单端端标记方法方法1人工合成人工合成单端端标记法法8.单端端标记方法方法2限制限制酶切切单端端标记法法9.3.末端末端标记双相作双相作图法法方法方法2仍存在两个不足之仍存在两个不足之处：酶1的的选择不能靠近不能靠近DNA中中央；央；需先分离需先分离DNA片段，片段，该法可克服上述缺点。法可克服上述缺点。现假假设有一片段有一片段长10Kb，其中其中RE1有三个切点，有三个切点，RE2有一个切点，其有一个切点，其图谱可能是可能是:10.4.Bal31顺序序酶解作解作图法法DNA片段片段Bal31处理不同理不同时间取取样终止反止反应限制限制酶切切凝胶凝胶电泳泳染色染色观察察结果果5.切口移位作切口移位作图法法(可可检测出出100bp片段片段)双双链DNA切口移位切口移位限制限制酶切切电泳泳放射自放射自显影影11.6.大尺度限制大尺度限制酶作作图1)条件条件i.电泳方法泳方法-脉冲脉冲场凝胶凝胶电泳泳ii.样品制品制备-原位原位DNA制制备和和酶解解iii.人工染色体构建人工染色体构建-pYAC载体构建体构建iv.脊椎脊椎动物基因物基因组中的中的CpG和植物基因和植物基因组中的中的CpXpG序序列存在列存在2)一般作一般作图程序程序原位原位DNA样品制品制备原位原位DNA限制限制酶切切脉冲脉冲场凝凝胶胶电泳泳染色染色观察察3)大尺度作大尺度作图用用酶i.稀有稀有识别序列内切序列内切酶-I型内含子内切型内含子内切酶(真菌真菌细胞核胞核和和线粒体基因粒体基因组,T4噬菌体噬菌体,衣藻叶衣藻叶绿体和体和线粒体粒体)；酵母；酵母HO内切内切酶；大；大肠杆菌杆菌recA虽然然这些内切些内切酶识别的序列都很的序列都很长：10-19bp，但高，但高等等动植物基因植物基因组中含有中含有这类位点却极少，因而很少使用位点却极少，因而很少使用12.ii.II型限制型限制酶人基因人基因组有有45,000个个CpG岛,一个一个长度度约为1.5kb富含富含GC的的DNA片段片段,其中只有其中只有25%的的CpG岛未被甲基化未被甲基化,这些些CpG岛常位于基常位于基因的因的5-端端,未被甲基化的未被甲基化的CpG岛平均平均长约270kb可可用用于于大大尺尺度度限限制制酶作作图的的限限制制酶具具有有如如下下特特征征：识别8或或6bp序列；富含或只含序列；富含或只含GC序列；含有序列；含有CpG序列序列i)AscI-GGCGCGCC和和NotI-GCGGCCGCii)FseI-GGCCGGCC和和SrFI-GCCCGGGCiii)SfiI-GGCCNNNNNGGCCiv)CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCGv)BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和和SacII-CCGCGGvi)NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,SmaI-CCCGGGvii)MluI-ACGCGT,NruI-TCGCGA,PvuI-CGATCG,SplI-CGTACGCH3CH3CH3CH3CH3CH313.三三.限制限制酶图谱的用途的用途1.基因工程中的基因工程中的应用用1)克隆克隆载体体图谱,便于便于DNA重重组;2)克隆片段克隆片段图谱可用于次克隆可用于次克隆,体外突体外突变,基因定位基因定位,核酸定序核酸定序.2.突突变体体检测遗传学学图谱必必须依依赖各种突各种突变体存在体存在,因此必然因此必然发生了基因型和生了基因型和表型的表型的变化化.限制限制酶图谱不必依不必依赖表型表型变化化,酶谱的的变化一定是基因型化一定是基因型发生了生了变化化,但不一定但不一定发生了表型生了表型变化化,即表型的即表型的变化不一定会化不一定会导致致酶谱变化化.1)缺失突缺失突变体的体的检测:某某DNA片段消失片段消失,代之以一代之以一较小小DNA片段片段.2)插入突插入突变体的体的检测:某某DNA片段消失片段消失,代之以一代之以一较大大DNA片段片段.14.缺失和插入突缺失和插入突变体的体的检测（I）III点突点突变的的检测（II）15.3）点突）点突变的的检测:某某DNA片段消失片段消失,代之以两代之以两较小的小的DNA片段片段.前者的前者的长度等于后两者度等于后两者长度之和度之和(位点增加位点增加)；某两；某两DNA片段消片段消失失,代之以一代之以一较大大DNA片段，前者的片段，前者的长度之和等于后者度之和等于后者长度度(位位点消失点消失).3.重重组频率的率的测定定同同一一染染色色体体座座位位上上的的等等位位基基因因可可能能具具有有不不同同的的表表型型,从从而而构构成成遗传多多型型性性.等等位位基基因因的的限限制制酶谱也也可可能能具具有有多多型型性性,这就就是是限限制制酶片片段段长度度多多型型性性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)不同个体不同个体总DNA限制限制酶完全完全酶切切Southern印迹印迹杂交交结果分析果分析16.当不同个体交配当不同个体交配时,除自由除自由组合外合外,也可也可发生重生重组,如不同如不同果果蝇交配交配时,其后代的表型和限制其后代的表型和限制酶谱可可为:表型表型红:白白=1:1,限制限制酶谱30%个体已个体已发生了重生了重组.4.遗传疾病的疾病的诊断断分析正常人与分析正常人与遗传病患者的某些病患者的某些DNA片段的限制片段的限制酶谱,便可便可发现其差异其差异,并并总结出各种出各种遗传疾病的限制疾病的限制酶长度多度多态性性图。临床床诊断断时，将，将遗传病可疑患者的限制病可疑患者的限制酶谱与之比与之比较,便可判断其是便可判断其是否患有此病否患有此病.17.第五第五节DNA的的连接接 18.一一.DNA的的连接方法接方法两种不同的两种不同的DNA分子可以分子可以经过下述的方法之一下述的方法之一进行行连接接,而方而方法的法的选用用则是根据其两者末端的是根据其两者末端的DNA结构构.1.直接直接连结法法-该法适用于法适用于:1)同种限制同种限制酶作用不同作用不同DNA片段片段产生的相同粘性末端生的相同粘性末端重重组DNA可用同种可用同种酶再切开再切开,但但识别简并序列的限制并序列的限制酶除外除外(如如AraI)2)不同种限制不同种限制酶作用不同作用不同DNA片段片段产生的相容性末端生的相容性末端i.重重组DNA分子不能再分子不能再为这两种两种酶所作用所作用,如如:BamHI/BglIIii.重重组DNA分子可分子可为其中一种其中一种酶所作用所作用,但但为另一种另一种酶作用作用的可能性的可能性较小小,如如MboI/BamHI3)PCR产物与特定物与特定载体的体的连接接4)限制限制酶和其他方式和其他方式产生的平整末端生的平整末端.19.2.人工接人工接头连接法接法1)人工接人工接头（linker）的）的结构构i.中中轴对称互称互补,可自行退火形成双可自行退火形成双链.如如:5-CCGGAATTCCGG-33-GGCCTTAAGGCC-5ii.至少有一特定的限制至少有一特定的限制酶识别位点位点iii.某种限制某种限制酶的一套人工接的一套人工接头可使插入片段与表达可使插入片段与表达载体保持体保持同相同相.如如:八聚体八聚体d(GGAATTCC)十聚体十聚体d(CGGAATTCCG)十二聚体十二聚体d(CCGGAATTCCGG)2)用途用途i.平整末端的平整末端的连接接(各种各种结构的构的DNA末端均可末端均可经过修修饰变成成平整末端平整末端)2X5-CCGGAATTCCGG-3退火退火20.ii.产生新的克隆位点生新的克隆位点iii.合成匹配接合成匹配接头3)连接方法接方法人工接人工接头磷酸化磷酸化退火形成双退火形成双链与目的与目的DNA相相连限制限制酶切切两两DNA分子相分子相连4)适用范适用范围 人工接人工接头连接法适合于那些只有一种接法适合于那些只有一种DNADNA片段需加人工接片段需加人工接头就可以与另一就可以与另一DNADNA分子相分子相连的的DNADNA分子分子.利用人工接利用人工接头也可使任意也可使任意两个平端的两个平端的DNADNA分子相分子相连.这种直接相种直接相连的的办法法简便便,快速快速,但最后但最后连接起来的接起来的DNADNA可能具有不同的可能具有不同的结构构.为避免避免这些些结构的构的产生生,可可先使一种先使一种DNADNA先加上人工接先加上人工接头后后,再与另一种再与另一种DNADNA分子相分子相连.21.3.匹配接匹配接头连接法接法人工接人工接头虽然可然可连接两个具不同末端的接两个具不同末端的DNA分子分子,但但这些末端在些末端在加入人工接加入人工接头前必前必须变为平整末端平整末端.然而然而,有有时实验不容不容许使用人使用人工接工接头或使用人工接或使用人工接头不方便不方便,此此时,便可使用匹配接便可使用匹配接头,它可用于它可用于直接直接连接各种具不同末端的接各种具不同末端的DNA分子分子:i.平端平端+突起末端突起末端(5-突起突起,3-突起突起)ii.粘性末端粘性末端(5-突起突起+5-突起突起:EcoRI+HindIII5-突起突起+3-突起突起:EcoRI+PstI3-突起突起+3-突起突起:PstI+SacI)1)匹配接匹配接头的的结构特点构特点i.由两个低聚核苷酸由两个低聚核苷酸组成成ii.部分区域可以互部分区域可以互补iii.退火后的双退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端低聚核苷酸可以形成两个不同的末端2)匹配接匹配接头的种的种类22.i.预制匹配接制匹配接头(连接平端和粘性末端接平端和粘性末端)人工接人工接头+匹配接匹配接头预制匹配接制匹配接头ii.转换匹配接匹配接头(连接接5-突起和突起和3-突起末端突起末端)二匹配接二匹配接头退火退火转换匹配接匹配接头二人工接二人工接头连接接酶双双酶切切转换匹配接匹配接头iii.单链匹配接匹配接头(连接接5-突起和突起和3-突起末端突起末端)4.同聚物加尾同聚物加尾连接法接法在两个不同的在两个不同的DNA分子末端各加上一个可互分子末端各加上一个可互补的同聚物的同聚物,即即AT或或GC.5.连接方法的接方法的选择方法方法选择的依据的依据:1)两两DNA分子的末端分子的末端结构构2)DNA分子的限制分子的限制酶谱3)是否需要回收是否需要回收DNA片段片段23.连接方式的接方式的选择载体末端体末端外源外源DNA末端末端常常规连接接脱磷酸化脱磷酸化同聚物同聚物平端平端连接接补齐,人工接人工接头结构构结构构载体体加尾加尾外切外切酶5-突起突起相容相容5-突起突起第二第二选择第一第一选择不能不能不能不能不能不能5-突起突起非相容非相容5-突起突起不能不能结合使用接合使用接头不能不能不能不能第一第一选择3-突起突起相容相容3-突起突起唯一唯一选择不能不能不能不能不能不能不能不能3-突起突起非相容非相容3-突起突起不能不能不能不能第一第一选择不能不能第二第二选择或平端或平端3-突起突起5-端突起端突起不能不能不能不能第一第一选择不能不能第二第二选择(补齐后后)平端平端平端平端不能不能可能可能可能可能第一第一选择可能可能平端平端3-或或5-突起突起不能不能不能不能第一第一选择不能不能第二第二选择24.二二.DNA的的连接反接反应1.连接反接反应理理论当两种当两种DNA分子相分子相连时,它它们可能可能产生不同的生不同的结果果,这些些结果果与以下因素有关与以下因素有关:1)连接反接反应系系统中的中的总DNA浓度度i2)一个一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效分子靠近同一分子另一端的有效浓度度j,该值与与DNA的的长度成反比度成反比,即即DNA分子越大分子越大,该分子的两末端越不分子的两末端越不易相互作用易相互作用(即自身即自身环化化)3)两种不同两种不同DNA分子的克分子分子的克分子浓度之比度之比值.2.连接反接反应条件条件1)评估估连接反接反应结果的方法果的方法i.琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳ii.大大肠杆菌杆菌转化化2)反反应条件条件25.i.温度温度ii.ATP浓度度iii.时间iv.连接接酶浓度度v.克分子比率克分子比率26.第六第六节PCR技技术27.一一DNA体外体外扩增技增技术1.PCR反反应体系体系1)基本原理基本原理(PCRPolymeraseChainReaction聚合聚合酶链式反式反应)一个一个DNA经n次次扩增后增后,一个一个DNA分子可分子可变为2n个分子个分子DNA扩增需要增需要对待待扩增的增的DNA序列有所了解，至少要序列有所了解，至少要对其两其两侧的核苷酸序列的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物已知，以便合成寡核苷酸引物2)基本操作基本操作待待扩增的增的DNA片段片段+dNTP+TrisHCl缓冲液冲液+两引物两引物90变性性3050退火退火30加入加入TaqDNA聚合聚合酶751进入第二次循入第二次循环25-30次循次循环28.PCR原原理理示示意意图29.2.PCR产物的物的鉴定定1)PCR产物的大小和限制物的大小和限制酶谱分析分析2)寡聚核苷酸限制性内切寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析（片段分析（OR分析，分析，OligomerRestrictionanalysis）OR分析分析对于于PCR产物的限制物的限制酶位点上位点上发生了点突生了点突变的的检测极其有用极其有用30.PCR产物的物的OR鉴定定31.3)分子分子杂交交适合于适合于检测PCR产物的非限制物的非限制酶位点上碱基突位点上碱基突变。它是利。它是利用两条引物用两条引物链间的特异性的特异性DNA片段作探片段作探针(常常为人工合成的一段人工合成的一段低聚核苷酸，低聚核苷酸，约20n.t.).当当这种探种探针的核苷酸序列与待的核苷酸序列与待测的的DNA核苷酸序列完全互核苷酸序列完全互补时才能才能杂交。如果利用多种等位基因特异交。如果利用多种等位基因特异性寡核苷酸探性寡核苷酸探针（allele-specificOligonucleotide,ASO）与）与PCR产物物进行行杂交，可交，可检测出出PCR产物的碱基突物的碱基突变。可直接利用斑点可直接利用斑点杂交方法用于基因型分析交方法用于基因型分析32.4)核苷酸序列分析核苷酸序列分析DNA扩增增产物物变性性与末端与末端标记的的扩增引物或定序增引物或定序引物退火引物退火双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸链终止反止反应，测定定DNA序列序列33.二二TaqDNA聚合聚合酶的特点的特点TaqDNA聚合聚合酶是从一种极度嗜是从一种极度嗜热水生栖水生栖热菌菌YT-1中分中分离离纯化而得。化而得。该酶的分子量的分子量为63-68kD1.无磷酸无磷酸单酯酶、磷酸二、磷酸二酯酶以及以及单链外切外切酶活性，无内活性，无内切切酶活性活性，但具有依，但具有依赖于聚合于聚合酶活性的活性的53外切外切酶活性活性2.最适反最适反应温度温度为80 3.最适最适pH8.0和最佳反和最佳反缓冲液冲液TrisHCl 4.最佳二价阳离子最佳二价阳离子Mg2+（10mM）5.具良好的具良好的热稳定性：在定性：在90下下连续反反应30分分钟仍有仍有70%的的酶活活34.TaqDNA聚合聚合酶的特性的特性35.当采用当采用TaqDNA聚合聚合酶进行行DNA体外体外扩增增时，必，必须考考虑到以下五个参数：到以下五个参数：1）热稳定性：在定性：在PCR循循环中中DNA的的变性性时间常常为30-60，若循，若循环30次，其累次，其累计加加热变性性时间为15-30。TaqDNA聚合聚合酶在在90下保温下保温30仍具有仍具有70%酶活性，可大大减少操作步活性，可大大减少操作步骤，易于，易于实现自自动化化*2）模板与引物的特异性：当退火温度和）模板与引物的特异性：当退火温度和DNA链延伸延伸时温度偏低温度偏低时，引物与模，引物与模板配板配对的特异性大大降低，从而的特异性大大降低，从而导致一些不需要的致一些不需要的DNA片段被片段被扩增。增。显然，然，其其产物的物的专一性大大降低，使一性大大降低，使结果无法分析。由于果无法分析。由于TaqDNA聚合聚合酶最适反最适反应温度温度为80，退火温度可提高到，退火温度可提高到55以上，由此大大减少了引物与模板以上，由此大大减少了引物与模板的非的非专一性一性结合，使合，使产物均一性大大增加物均一性大大增加*3）合成）合成产率：反率：反应底物和底物和产物在物在DNA扩增中不断增中不断发生生变化，最化，最终将会将会导致致聚合反聚合反应进入平台期，平台期出入平台期，平台期出现的的时间与聚合与聚合酶的特性有关。研究表明，的特性有关。研究表明，利用利用Klenow片段片段进行行20次次扩增后增后进入平台期，累入平台期，累积产物拷物拷贝数数为2105，当采用当采用TaqDNA聚合聚合酶时，扩增增25次后才次后才进入平台期，拷入平台期，拷贝数可大数可大4106*4）延伸）延伸长度：有度：有时为了了获取取较长DNA片段的片段的扩增，增，这就要求就要求DNA聚合聚合酶具有具有较强的延伸能力。当的延伸能力。当扩增片段大于增片段大于250bp时，Klenow片段和片段和T4聚合聚合酶扩增增产率大大降低。利用率大大降低。利用T7DNA聚合聚合酶，可使，可使扩增片段达增片段达2Kb。当利用。当利用TaqDNA聚合聚合酶时，最，最长延伸延伸长度度为4.4Kb.36.经改造的改造的TaqDNA聚合聚合酶可可扩增出增出40kb的的DNA片段片段.5）扩增增产物的可靠性：物的可靠性：评估估DNA聚合聚合酶的一个重要指的一个重要指标是它复制是它复制DNA的可的可靠性，即靠性，即掺入入错误碱基的碱基的频率。率。这对于于PCR技技术的可靠性是至关重要的。的可靠性是至关重要的。Klenow片段的片段的错误掺入率入率为10-4，TaqDNA聚合聚合酶的的错误掺入率入率为510-3，而，而T4聚合聚合酶的的错误掺入率入率为10-7。*注：注：1）退火温度常与引物的）退火温度常与引物的长度和碱基度和碱基组成有直接相关关系，引物越成有直接相关关系，引物越长或或GC含量含量较高，退火的温度可以高些，反之高，退火的温度可以高些，反之则低些。退火温度越高，引物低些。退火温度越高，引物与模板（即与模板（即扩增的增的DNA）结合的特异性越高，合的特异性越高，这可大大减少非特异性可大大减少非特异性DNA片段的片段的扩增。增。引物的引物的长度常度常为20-28聚体，其中有聚体，其中有50%以上的以上的GC含量，无自身互含量，无自身互补序序列，特列，特别是是3末端不末端不应有内部二有内部二级结构，引物加量构，引物加量为每每100ll20pmol.*2)出出现平台期的原因可能有：平台期的原因可能有：后期循后期循环酶浓度或聚合度或聚合时间不足；不足；引引物耗尽；物耗尽；dNTP耗尽；耗尽；产物物浓度度过高，以致高，以致ds-DNA解解链后又迅速退火后又迅速退火，不能与引物，不能与引物结合。合。*3）链延伸延伸长度与延伸度与延伸时间有关，有关，对于于TaqDNA聚合聚合酶，每分，每分钟可形成可形成2000n.t.或更多。如果要或更多。如果要扩增增3-4Kb的的DNA，在，在72下需将下需将酶延伸延伸时间增增至至3-4分分钟。37.三三PCR方法方法1.强化化PCR（BoostedPCR）将将PCR分分为两个两个阶段：段：1）引物与模板之比）引物与模板之比为107，扩增增20个周期个周期2）引物与模板之比）引物与模板之比为10121013，再，再扩增增10个周期个周期该法适合于待法适合于待扩增增DNA浓度度较低低时。2.混合寡核苷酸引物混合寡核苷酸引物PCR（mixedoligonucleotideprimedamplificationofcDNA,MOPAC）根据各氨基酸最常用的密根据各氨基酸最常用的密码子合成一系列引物，子合成一系列引物，对某一某一特定特定cDNA进行行扩增。增。3.锚定定PCR(AnchoredPCR，A-PCR)38.4.连结PCR(ligationmediatedPCR)该法可用于核苷酸序列法可用于核苷酸序列测定定,DNA足迹分析技足迹分析技术和和测定甲定甲基化作用基化作用39.5.不不对称称PCR(AsymmetricalPCR)采用不同引物采用不同引物浓度比率，如度比率，如50：1，100：1，可得大量拷，可得大量拷贝的的ssDNA用于用于测序序6.GC串串PCR(GCclampPCR)应用用变性性剂梯度凝胶梯度凝胶电泳泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)可可检测出出DNA片段中一片段中一对碱基的碱基的变化，在化，在DNA分子一端分子一端加上一加上一GC串（串（约40n.t.）利用它的高解）利用它的高解链温度特性，在梯度温度特性，在梯度变性性胶上可胶上可检测出原出原DNA链中最高解中最高解链区内的点突区内的点突变40.7.竞争引物争引物PCR(competitive oligonucieotide primer (competitive oligonucieotide primer PCR,COP-PCR)PCR,COP-PCR)有一个碱基有一个碱基变化的两种引物在化的两种引物在较宽松的复性条件下松的复性条件下竞争争DNA模板，其中只有完全互模板，其中只有完全互补的引物才能大量配的引物才能大量配对。该法可用于法可用于测定某一定某一DNA片段上是否片段上是否带有某一已知碱基置有某一已知碱基置换。41.8.等位基因等位基因专一一PCR(AllelespecificPCR,ASPCR)该法可用于法可用于检测点突点突变。如用于。如用于检测镰刀形刀形贫血症。血症。9.反反转PCR(inverserarinvertedPCR)该法可用于法可用于扩增已知增已知序列两序列两侧的未知序列的未知序列42.10.反向反向PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)主要用于主要用于mRNA的的PCR扩增增43.11.加端加端PCR(Add-onPCR)在合成引物在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列，如某种限制加上研究者所需要的核苷酸序列，如某种限制酶的的识别序列，某一基因的序列，某一基因的调控或其它必需序列控或其它必需序列12.错配配PCR（mismatchedPCR)利用利用该法可在一已知法可在一已知DNA序列中引起点突序列中引起点突变，缺失突，缺失突变和插和插入突入突变。44.13.重重组PCR(RecombinantPCR)利用利用该法可将不同基因的法可将不同基因的DNA片段片段连接在一起。接在一起。45.14.基因克隆基因克隆PCR利用利用该法可法可获一完整的一完整的cDNA克隆。克隆。四四.定量定量PCR技技术1.基本原理基本原理N=N0(1+eff)nN-最最终拷拷贝数；数；N0-起始拷起始拷贝数；数；eff-扩增效率；增效率；n-扩增次数增次数2.测定方法定方法竞争争PCR法法(加入已知量的加入已知量的标准物准物)；RT-PCR-转录法法46.五五PCR技技术的的应用用1.遗传疾病的疾病的诊断断人人类镰刀型刀型贫血症是因第六个密血症是因第六个密码子的第二个字母子的第二个字母发生了生了AT的改的改变，从而，从而导致致该位点的谷氨酸位点的谷氨酸为缬氨酸所取代。氨酸所取代。AT突突变还导致限制致限制酶OxaNI位点的消失。位点的消失。利用利用PCR技技术和限制和限制酶谱分析分析诊断此分子疾病大致断此分子疾病大致过程如下：程如下：DNA扩增增PAGE染色染色观察察比比较不同个体的不同个体的结果果限制限制酶切切PAGE染色染色观察察此法可在此法可在3-4h获得得结果，比常果，比常规的的Southern杂交法交法简便、快速。便、快速。47.2.传染病的染病的诊断断如果已知某种病原菌如果已知某种病原菌(体体)中的特异性中的特异性DNA片段的核苷酸序列，片段的核苷酸序列，这个片段就可以用于个片段就可以用于DNA扩增，并利用增，并利用DNA杂交或凝胶交或凝胶电泳的泳的方法方法诊断病原体的存在与否。断病原体的存在与否。例如例如AIDS的的诊断，常断，常规方法是利用血清背景和病毒培养，往方法是利用血清背景和病毒培养，往往需要往需要3-4个星期，采用个星期，采用PCR技技术则只需一天左右，且准确率高只需一天左右，且准确率高3.基因的快速克隆基因的快速克隆根据已知基因序列根据已知基因序列设计PCR引物引物,可直接在不同的可直接在不同的样品中品中进行行PCR扩增增,而不必分离而不必分离纯化生物化生物样品品4.基因突基因突变1）缺失突）缺失突变2）插入突）插入突变3）点突）点突变-单点和多点突点和多点突变48.六六.等温等温3SR(self-substainedsequencereplication)反反应系系统七七.等温等温链取代取代扩增反增反应系系统(SDA,stranddisplacementamplification)49.等等温温3SR反反应系系统(self-substainedsequencereplication)50.等等温温链取取代代扩增增反反应系系统(SDA,stranddisplacementamplification)51.52.后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用53.主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！54.致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求55.感感谢您的您的观看和下看和下载The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field56.