组化3第三章酶组化.ppt
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1、第三章第三章酶组织化学方法化学方法第一第一节概述概述n酶是生物体内具有催化作用的特异性蛋白是生物体内具有催化作用的特异性蛋白质,细胞内新胞内新陈代代谢的合成和分解的生物化学反的合成和分解的生物化学反应都有都有酶的参与,因此,又称其的参与,因此,又称其为生物催化生物催化剂。n组织化学中的化学中的酶反反应是指在一定的条件下,使是指在一定的条件下,使组织细胞内的胞内的酶通通过作用于作用于酶的底物,使后者的底物,使后者被分解形成某种初被分解形成某种初级反反应产物,物,这种种产物被捕物被捕捉捉剂所捕所捕获而沉淀于原位上,然后将而沉淀于原位上,然后将这种沉淀种沉淀物物变成具有可成具有可见性的最性的最终产物
2、,从而物,从而间接接证明明酶的定位。的定位。1.酶酶的底物的底物最初的反最初的反应物另外物物另外物质(金属(金属盐)不溶于水的不溶于水的显色色产物物2.酶的分的分类:1.氧化还原酶:是催化氧化还原反应的酶。2.转移酶:是催化功能基团转移的酶。3.水解酶:是催化水解反应的酶。4.裂解酶:是催化分裂或合成化合物的酶。5.异构酶:是催化同分异构体相互转化的酶。6.合成酶:是催化将两种物质合成一各物质,并必须与ATP分解相偶联的酶。3.酶组织化学反化学反应中注意事中注意事项n在制在制备标本及本及组化化实验中必中必须做到既要最大做到既要最大限度地保存限度地保存酶的活性,又要保存好的活性,又要保存好组织细
3、胞的胞的形形态结构,以保构,以保证酶在在组织细胞中准确定位。胞中准确定位。n酶反反应的温度、的温度、时间、PH必必须控制好。控制好。n试剂的的浓度配制必度配制必须准确。准确。n所用器皿必所用器皿必须清清洁,以防,以防污染及出染及出现假阳性。假阳性。n必必须做阳性或阴性做阳性或阴性对照照试验。4.第二节若干酶组织化学反应程序5.一、碱性磷酸碱性磷酸酶(一)名称:(一)名称:常用名:碱性磷酸常用名:碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)水水解解酶,在在碱碱性性环境境下下催催化化水水解解磷磷酸酸脂脂生生成成磷磷酸酸和和醇醇。在在运运输较为活活跃的的细胞胞膜膜上上广广泛泛分分布布
4、,如如毛毛细血血管管内内皮皮细胞胞、肝肝内内毛毛细胆胆管管膜膜、肾近近曲曲小小管管的刷状的刷状缘、肠上皮的上皮的纹状状缘和神和神经细胞的突触膜等。胞的突触膜等。6.(二)反反应原理:原理:ALP在在有有激激活活剂(Mg2+)存存在在和和PH9.4时,将将其其磷磷酸酸盐底底物物(如如一一甘甘油油磷磷酸酸钠、一一苯苯酚酚磷磷酸酸钠)分分解解产生生甘甘油油钠和和磷磷酸酸离离子子,后后者者被被孵孵育育液液中中的的氯化化钙所所捕捕获,在在有有酶活活性性存存在在处生生成成磷磷酸酸钙沉沉淀淀,但但为非非金金属属盐,需需要要加加入入硝硝酸酸钴,从从而而生生成成无无色色磷磷酸酸钴沉沉淀淀,再再通通过硫硫化化铵处
5、理理,形形成棕黑色硫化成棕黑色硫化钴。7.(三)光镜显示法Gomori改良钙钴法1)溶液的配制:)溶液的配制:孵育液:孵育液:3甘油磷酸甘油磷酸钠10ml2巴比妥巴比妥钠10ml2氯化化钙(2.7%CaCl22H2O)20ml5%硫酸硫酸镁(MgSO47H2O)1ml蒸蒸馏水水5ml调此液此液pH至至9.4,可冰箱保存。可冰箱保存。2硝酸硝酸钴(Co(NO3)2)0.5%硫化硫化铵(NH4)2S)(新配新配)8.2)染色步骤:石蜡切片脱蜡入水石蜡切片脱蜡入水,或冰或冰冻切片或切片或经10%福福尔马林固定林固定15min;入孵育液入孵育液,3730-40min(肾组织10min,肝肝组织60mi
6、n);流水冲洗流水冲洗5min;9.2%(Co(NO3)2)5min;蒸蒸馏水洗水洗;1%(NH4)2S1min;蒸蒸馏水洗水洗;甘油明胶封片甘油明胶封片;3)对照照:孵育液中去除孵育液中去除-甘油磷酸甘油磷酸钠。4)染色)染色结果:果:ALP活性的最活性的最终反反应产物物为棕黑色硫化棕黑色硫化钴沉淀。沉淀。10.11.5)说明:明:钙钴法在一般法在一般实验室仍是常用的方法,但因室仍是常用的方法,但因其化学反其化学反应多次多次转换,容易造成定位不准确;,容易造成定位不准确;石蜡切片石蜡切片虽然也能然也能显示示ALP活性,但活性,但经石蜡包石蜡包埋埋处理(包括酒精、二甲苯、高温等),理(包括酒精
7、、二甲苯、高温等),酶活活性性丧失大部分。失大部分。12.二、酸性磷酸二、酸性磷酸酶(一)名称:常用名:常用名:酸性磷酸酸性磷酸酶(acidphosphaatase,ACP)主要位于主要位于细胞内的溶胞内的溶酶体内,是溶体内,是溶酶体体的的标志志酶。此外,尚有非溶。此外,尚有非溶酶体性体性ACP。ACP在在细胞胞退退变过程中活性最程中活性最强,在核酸和蛋白,在核酸和蛋白质代代谢活活动增增强时,也,也见ACP活性增活性增强。ACP也参与脂肪代也参与脂肪代谢。在神在神经传导冲冲动时,ACP参与参与Ca2+依依赖的神的神经递质释放放过程。程。总之,在疾病、免疫反之,在疾病、免疫反应和和细胞胞损伤与修
8、复与修复过程中程中ACP均具有一定的生物学意均具有一定的生物学意义。13.(二)反(二)反应原理原理显示酸性磷酸示酸性磷酸酶,先将切片放入含,先将切片放入含有有酶底物(底物(-甘油磷酸钠)的溶液)的溶液(PH5.0)中孵育,底物)中孵育,底物经酶水解,水解,释放磷酸,用捕捉放磷酸,用捕捉剂硝酸硝酸铅与磷酸反与磷酸反应,形成微形成微细的磷酸的磷酸铅,沉淀于,沉淀于酶存在的部存在的部位,再用硫化位,再用硫化铵处理,磷酸理,磷酸铅被置被置换形形成粗成粗颗粒状的黑色硫化粒状的黑色硫化铅沉淀物,便可沉淀物,便可用光用光镜看到。看到。14.(三)光(三)光镜显示示ACP有有铅法和偶氮偶法和偶氮偶联法:法:
9、1、铅法:法:1)孵育液的配制:)孵育液的配制:0.05mol/L醋酸醋酸盐缓冲液冲液,pH5.010ml蔗糖蔗糖0.8g硝酸硝酸铅Pb(NO3)210mg3%(约0.1mol/L)-甘油磷酸甘油磷酸钠1ml按上述按上述顺序加入序加入,待硝酸待硝酸铅完全溶解后再逐滴完全溶解后再逐滴加入底物加入底物,边加加边搅至溶液完全透明。至溶液完全透明。15.2)染色步骤:石蜡切片脱蜡到水;冰石蜡切片脱蜡到水;冰冻切片或冰切片或冰冻切切片冷福片冷福尔马林林钙固定固定10min后水洗;后水洗;入孵育液入孵育液24h(肝(肝组织1h左右),左右),37;双蒸双蒸馏水洗;水洗;入入1硫化硫化铵(新配)溶液内(新配
10、)溶液内12min流水洗。流水洗。16.13)对照:照:在孵育液内加入在孵育液内加入0.01mol/L氟化氟化钠(NaF)抑制抑制剂后后,ACP反反应呈阴性。呈阴性。M4)染色)染色结果:果:ACP呈棕黑色硫化呈棕黑色硫化铅颗粒。粒。5)说明:明:ACP是可溶性是可溶性酶,以冷固定后,以冷固定后结果果较满意意.石蜡切片制作石蜡切片制作过程易使程易使酶失活。失活。17.三、三、核苷酸核苷酸酶(一)名称(一)名称常用名:核苷酸酶(Nucleotidase)18.核核苷苷酸酸酶是是一一种种特特异异性性的的磷磷酸酸单酯酶,它它能能水水解解核核糖糖核核苷苷和和去去氧氧核核糖糖核核苷苷在在5位位置置的的磷
11、磷酸酸酯,如如一一磷磷酸酸腺腺苷苷(),一一磷磷酸酸肌肌苷苷(),尿尿苷苷磷磷酸酸(UMP),胞胞苷苷磷磷酸酸()等等,水水解解产生生核核苷苷和和磷磷酸酸,但但不不能能分分解解甘甘油油磷磷酸酸,葡葡萄萄糖糖磷磷酸酸。核核苷苷酸酸酶是是一一种种最最适适p值相当广泛的相当广泛的酶。19.(二)反(二)反应原理原理n底物经酶水解,用金属离子捕捉生成的磷酸离子而形成沉淀。即:腺苷磷酸水腺苷磷酸。20.(三)光(三)光镜显示方法示方法铅法(法(Wachs和和Meisel1956)(1)取材:新取材:新鲜组织冰冰冻切片切片(2)孵育液的配制:孵育液的配制:腺苷腺苷磷酸磷酸钠4mg0.2MTris-苹果酸苹
12、果酸缓冲液冲液(Tris-maleatebuffer)p7.44ml0.1MMgSO4(2.5%)1ml2%硝酸硝酸铅0.6ml蒸蒸馏水水0.4ml21.(1)方法与步)方法与步骤:新新鲜组织冰冰冻切片切片,或冷或冷10%福福尔马林林固定冰固定冰冻切片切片;蒸蒸馏水水洗水水洗;入孵育液入孵育液,恒温恒温37,孵育孵育2060分分钟;自来水洗自来水洗;入入1%硫化硫化铵1分分钟;蒸蒸馏水冲洗水冲洗;甘油明胶封固。甘油明胶封固。22.(4)结果与果与评价价:棕黑色硫化棕黑色硫化铅沉淀沉淀为酶活性所在部位。活性所在部位。(5)对照照:可除去底物可除去底物,或以或以甘油磷酸甘油磷酸钠代替底代替底物物,
13、或加入碱性磷酸或加入碱性磷酸酶抑制抑制剂溴化四溴化四唑草草酸酸盐可防止可防止杂入的碱性磷酸入的碱性磷酸酶起作用。起作用。23.四、四、葡萄糖葡萄糖6磷酸磷酸酶(一一)名称名称常用名:葡萄糖6磷酸酶(Glucose-6-phosphatasePhosphohydro-lase)24.葡葡萄萄糖糖6磷磷酸酸酶是是一一种种催催化化多多种种磷磷酸酸化化合合物物水水解解的的磷磷酸酸酶。例例如如它它可可以以最最快快的的速速度度催催化化葡葡萄萄糖糖6磷磷酸酸水水解解,也也可可以以水水解解阿阿洛洛糖糖-6-磷磷酸酸、1,5-山山梨梨醇醇聚聚糖糖-6-磷磷酸酸、甘甘露露糖糖-6-磷磷酸酸、半半乳乳糖糖-6-磷磷
14、酸酸、核核酸酸5磷磷酸酸及及2-甘甘油油磷磷酸酸,同同时此此酶还可可水水解解焦焦磷磷酸酸、核核苷苷三三磷磷酸酸,果果糖糖-6-磷磷酸酸、氨氨甲甲酰基基-磷磷酸酸、磷磷酸酸烯醇醇丙丙酮酸、磷酸、磷酰胺胺盐和某些其它焦磷酸化合物。和某些其它焦磷酸化合物。25.(二)光(二)光镜显示方法示方法铅法(法(Wachstei和和Meisel1956)(1)原原理理:葡葡萄萄糖糖6磷磷酸酸被被释放放出出磷磷酸酸后后,为硝硝酸酸铅所所捕捕获,最最终反反应产物物为颗粒粒状状的硫化的硫化铅沉淀。沉淀。(2)孵育液的配制:)孵育液的配制:0.125%葡萄糖葡萄糖6磷酸磷酸钠4ml0.2MTris-苹果酸(苹果酸(T
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