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荧光定量PCR检测项目HBV-DNA定量乙肝基因分型乙肝拉米夫定耐药HCV-RNA定量病毒性脑炎实时荧光定量实时荧光定量PCR 方法方法-TaqMan法法方法：TaqMan法法TaqMan-水解型杂交探针与目标序列互补5端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针535535ForwardPrimerReversePrimerTaqMan ProbeRQTaqman实时实时PCR的反应过程的反应过程Displacement535535ForwardPrimerReversePrimerRQHydrolysis535535QRPolymerization Completed535535RQ每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义在在PCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧，利用荧光信号累积光信号累积实时监测实时监测整个整个PCR进程，最后进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法方法实时荧光定量实时荧光定量PCR 原理原理实时原理实时原理 常常 规规 PCR技术：技术：对对PCR扩增反应的扩增反应的终终点产物点产物进行定量和定进行定量和定性分析性分析无法对起始模板准确无法对起始模板准确定量，无法对扩增反定量，无法对扩增反应实时检测应实时检测实时定量实时定量PCR技术：技术：利用利用荧光信号的变荧光信号的变化实时检测化实时检测PCR扩增扩增反应中反应中每一个循环扩每一个循环扩增产物量的变化增产物量的变化，通，通过过Ct值值和标准曲线的和标准曲线的分析对分析对起始模板起始模板进行进行定量分析定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCR原理定量原理原理定量原理如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析介绍三个概念：介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、Ct值值扩增曲线扩增曲线扩增曲线图扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件荧光荧光阈阈值值荧光信号荧光信号阈阈值值 （threshold threshold）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值Ct值CtCt值的定义值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性定量原理定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率定量原理定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0(1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M (3)Log Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域域值的循环数即值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量就可计算出样品中所含的模板量标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample绝对定量25标本采集和运送 血液标本血液标本：用用2ml2ml真空采集管或真空采集管或1.5ml1.5ml高压灭菌离心管采集血液标本，血标本高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在采集后在2 2小时内送达实验室（小时内送达实验室（HCVHCV采用采用EDTAEDTA抗凝的血浆）。离心（检验单抗凝的血浆）。离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5ml1.5ml的离心管中。的离心管中。脑脊液脑脊液：由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌和密封用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌和密封 标本采集后，应尽可能快的送至实验室，如运送时间需标本采集后，应尽可能快的送至实验室，如运送时间需2 2小时以上，必须用冰小时以上，必须用冰盒送至实验室。盒送至实验室。标本中如加入了适当的稳定剂，如用于标本中如加入了适当的稳定剂，如用于RNARNA测定加入测定加入4mol/L4mol/L异硫氰酸胍盐异硫氰酸胍盐（GITCGITC）的血清（浆）标本和用于）的血清（浆）标本和用于DNADNA测定的测定的EDTAEDTA抗凝血等，则可在室温下抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄。运送或邮寄。注注：RNARNA采用采用EDTAEDTA抗凝的全血标本，抗凝后抗凝的全血标本，抗凝后6 6小时内分离血浆，如使用血清标小时内分离血浆，如使用血清标本则尽快（本则尽快（2 2小时内）分离血清。严禁使用肝素抗凝。小时内）分离血清。严禁使用肝素抗凝。定量检测的临床意义 治疗前进行病毒定量检测，指导选择抗病毒药物，治疗前进行病毒定量检测，指导选择抗病毒药物，治疗前进行病毒定量检测，指导选择抗病毒药物，治疗前进行病毒定量检测，指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。避免盲目用药。避免盲目用药。避免盲目用药。治疗后定量治疗后定量治疗后定量治疗后定量PCRPCR直接准确地测定体内病毒数量，直接准确地测定体内病毒数量，直接准确地测定体内病毒数量，直接准确地测定体内病毒数量，有助于疗效的判断。有助于疗效的判断。有助于疗效的判断。有助于疗效的判断。怀孕前进行定量怀孕前进行定量怀孕前进行定量怀孕前进行定量PCRPCR测定，有助于选择有利的怀测定，有助于选择有利的怀测定，有助于选择有利的怀测定，有助于选择有利的怀孕时机。孕时机。孕时机。孕时机。HBV基因分型HBV HBV 基因型是根据基因型是根据基因型是根据基因型是根据HBVHBV病毒核酸异源性病毒核酸异源性病毒核酸异源性病毒核酸异源性8%8%进行进行进行进行分型分型分型分型分为分为分为分为A A、B B、C C、D D、E E、F F、G G、HH等等等等8 8种种种种亚洲主要为亚洲主要为亚洲主要为亚洲主要为B B型以及型以及型以及型以及C C型型型型感染感染感染感染HBVHBV后的临床经过与不同基因型有关后的临床经过与不同基因型有关后的临床经过与不同基因型有关后的临床经过与不同基因型有关HBV基因型的临床意义基因型的临床意义HBV标志物清除与B基因型相比，C基因型有更高的HBeAg阳性率，分别为16%与53%基因型的自发性HBeAg清除要比C基因型早10年，并且在HBeAg清除后，肝脏生物化学指标持续正常。病毒致病性HBsAg阳性者中，C基因型比B 基因型的肝功能异常更为常见。C基因型引起的临床表现及组织学损伤更严重。乙型肝炎的病程及转归亚洲无症状HBV携带中，与B基因型比较,C基因型在肝硬化及50岁以上的肝细胞癌患者中比例较高,而B基因型与50岁以下,特别是35岁以下的肝细胞癌患者有关。药物敏感性给予干扰素治疗时，给予干扰素治疗时，给予干扰素治疗时，给予干扰素治疗时，B B 基因型的完全应答率达到基因型的完全应答率达到基因型的完全应答率达到基因型的完全应答率达到C C 基因型的基因型的基因型的基因型的3 3倍倍倍倍HBeAg HBeAg 阳性乙型肝炎患者使用拉米呋定治疗时阳性乙型肝炎患者使用拉米呋定治疗时阳性乙型肝炎患者使用拉米呋定治疗时阳性乙型肝炎患者使用拉米呋定治疗时,发现发现发现发现B B 基因型患者的基因型患者的基因型患者的基因型患者的HBeAg/HBeAb HBeAg/HBeAb 转阴转阴转阴转阴率达到率达到率达到率达到C C 基因型的两倍基因型的两倍基因型的两倍基因型的两倍 HBV不同基因型比较 B B型型 C C型型流行性流行性 低低 高高HBeAgHBeAg阳性率阳性率 低低 高高 HBeAgHBeAg自然清除时间自然清除时间 短短 长长 HBV DNA HBV DNA 载量载量 低低 高高致病性致病性 轻轻 重重HCCHCC发生率发生率 低（低年龄组高）低（低年龄组高）高（高年龄组高）高（高年龄组高）干扰素治疗完全应答率干扰素治疗完全应答率 高高 低低抗病毒治疗效果抗病毒治疗效果 好好 差差肝癌手术治疗预后肝癌手术治疗预后 好好 差差 癌栓栓塞治疗效果癌栓栓塞治疗效果 好好 差差注意事项在病毒定量在病毒定量10103 3时时,检测基因分型更有意义检测基因分型更有意义可能出现分型结果出现阴性可能出现分型结果出现阴性,排除本身病毒排除本身病毒量低的原因外量低的原因外,患者患者HBVHBV基因型可能为非基因型可能为非B,CB,C型型HBV拉米夫定拉米夫定拉米夫定(Lamivudine,Heptodin)“有效有效有效有效”核苷类高效抗乙肝病毒药物，可迅速降核苷类高效抗乙肝病毒药物，可迅速降核苷类高效抗乙肝病毒药物，可迅速降核苷类高效抗乙肝病毒药物，可迅速降低低低低 HBV-DNAHBV-DNA的滴度，改善肝脏组织的病变，还可能的滴度，改善肝脏组织的病变，还可能的滴度，改善肝脏组织的病变，还可能的滴度，改善肝脏组织的病变，还可能阻止纤维化的进程，终止肝硬化的发展。阻止纤维化的进程，终止肝硬化的发展。阻止纤维化的进程，终止肝硬化的发展。阻止纤维化的进程，终止肝硬化的发展。“耐药耐药耐药耐药”长期服用，会引起长期服用，会引起长期服用，会引起长期服用，会引起 HBV HBV 基因突变，基因突变，基因突变，基因突变，造造造造成成成成HBVHBV对药物敏感性大大降低，从而血清中对药物敏感性大大降低，从而血清中对药物敏感性大大降低，从而血清中对药物敏感性大大降低，从而血清中HBVHBV复制复制复制复制恢复活跃恢复活跃恢复活跃恢复活跃，滴度升高，滴度升高，滴度升高，滴度升高。耐药机理HBVHBV聚合酶中聚合酶中聚合酶中聚合酶中 Y(Y(酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸）MM（蛋氨酸蛋氨酸蛋氨酸蛋氨酸）D D（天门冬氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸）D D（天门冬氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸)变异毒株的生物特性：对拉米夫定抗病毒效应的敏感变异毒株的生物特性：对拉米夫定抗病毒效应的敏感变异毒株的生物特性：对拉米夫定抗病毒效应的敏感变异毒株的生物特性：对拉米夫定抗病毒效应的敏感性降低至性降低至性降低至性降低至1 1300300，DNADNA减少仅减少仅减少仅减少仅1 17 7。临床症状：血清临床症状：血清临床症状：血清临床症状：血清 ALT ALT 水平暂时上升，水平暂时上升，水平暂时上升，水平暂时上升，HBV-DNA HBV-DNA 的的的的浓度上升浓度上升浓度上升浓度上升,并有轻度乏力、恶心等肝脏炎症损伤加剧并有轻度乏力、恶心等肝脏炎症损伤加剧并有轻度乏力、恶心等肝脏炎症损伤加剧并有轻度乏力、恶心等肝脏炎症损伤加剧等症状。等症状。等症状。等症状。I I (异亮异亮异亮异亮氨酸氨酸氨酸氨酸）V V (缬缬氨酸氨酸氨酸氨酸）拉米夫定耐药性发生率：发生率：发生率：发生率：治疗慢性乙型肝炎治疗慢性乙型肝炎治疗慢性乙型肝炎治疗慢性乙型肝炎6 6 6 6个月后出现耐药性，在亚洲慢性乙个月后出现耐药性，在亚洲慢性乙个月后出现耐药性，在亚洲慢性乙个月后出现耐药性，在亚洲慢性乙型肝炎病人用拉米夫定型肝炎病人用拉米夫定型肝炎病人用拉米夫定型肝炎病人用拉米夫定 1 1 1 1年，对拉米夫定敏感性降低年，对拉米夫定敏感性降低年，对拉米夫定敏感性降低年，对拉米夫定敏感性降低的病毒变异发生率达的病毒变异发生率达的病毒变异发生率达的病毒变异发生率达14141414，甚至可达，甚至可达，甚至可达，甚至可达39393939。定义：在持续治疗中血清定义：在持续治疗中血清定义：在持续治疗中血清定义：在持续治疗中血清HBV DNA HBV DNA HBV DNA HBV DNA 再现再现再现再现耐药差异：耐药差异：耐药差异：耐药差异：检测灵敏度检测灵敏度检测灵敏度检测灵敏度 基础病毒水平基础病毒水平基础病毒水平基础病毒水平 是否多次是否多次是否多次是否多次/多种抗病毒治疗多种抗病毒治疗多种抗病毒治疗多种抗病毒治疗拉米夫定耐药的临床意义耐药后的临床情况耐药后的临床情况耐药后的临床情况耐药后的临床情况：发生耐药变异后发生耐药变异后发生耐药变异后发生耐药变异后1 1 1 14 4 4 4个月内虽都有病毒再现，个月内虽都有病毒再现，个月内虽都有病毒再现，个月内虽都有病毒再现，病人的情况也有可能大不相同。病人的情况也有可能大不相同。病人的情况也有可能大不相同。病人的情况也有可能大不相同。无症状变异病毒携带无症状变异病毒携带无症状变异病毒携带无症状变异病毒携带部分病人部分病人部分病人部分病人可能只是病毒再现，血清转氨酶持续正常。所以继续服药仍能抑制可能只是病毒再现，血清转氨酶持续正常。所以继续服药仍能抑制可能只是病毒再现，血清转氨酶持续正常。所以继续服药仍能抑制可能只是病毒再现，血清转氨酶持续正常。所以继续服药仍能抑制HBVHBVHBVHBV野生毒株，携带变异毒株因其生活力低，因此并不会发病。野生毒株，携带变异毒株因其生活力低，因此并不会发病。野生毒株，携带变异毒株因其生活力低，因此并不会发病。野生毒株，携带变异毒株因其生活力低，因此并不会发病。野生毒株转换野生毒株转换野生毒株转换野生毒株转换有一部分病人停用拉米夫定有一部分病人停用拉米夫定有一部分病人停用拉米夫定有一部分病人停用拉米夫定3-43-43-43-4个月后，变异毒株复制活性低，可能被复制个月后，变异毒株复制活性低，可能被复制个月后，变异毒株复制活性低，可能被复制个月后，变异毒株复制活性低，可能被复制活性较高的野生毒株取代。从而出现野生毒株优势感染，成为慢性无症状病毒活性较高的野生毒株取代。从而出现野生毒株优势感染，成为慢性无症状病毒活性较高的野生毒株取代。从而出现野生毒株优势感染，成为慢性无症状病毒活性较高的野生毒株取代。从而出现野生毒株优势感染，成为慢性无症状病毒携或者肝炎复发。携或者肝炎复发。携或者肝炎复发。携或者肝炎复发。病变急性加重病变急性加重病变急性加重病变急性加重发生耐药变异继续拉米夫定治疗的病人发生耐药变异继续拉米夫定治疗的病人发生耐药变异继续拉米夫定治疗的病人发生耐药变异继续拉米夫定治疗的病人ALTALTALTALT增高，多在半年后病变急性加重。增高，多在半年后病变急性加重。增高，多在半年后病变急性加重。增高，多在半年后病变急性加重。免疫抑制病人发生严重肝损害免疫抑制病人发生严重肝损害免疫抑制病人发生严重肝损害免疫抑制病人发生严重肝损害预防及处理预防及处理预防及处理预防及处理：治疗治疗治疗治疗6 6个月后，每个月后，每个月后，每个月后，每3 3个月检查个月检查个月检查个月检查YMDDYMDD和和和和HBV-HBV-DNADNA（尤其是基础病毒水平过高或免疫耐受的病人）（尤其是基础病毒水平过高或免疫耐受的病人）（尤其是基础病毒水平过高或免疫耐受的病人）（尤其是基础病毒水平过高或免疫耐受的病人）