RNA提取及PCR相关技术PPT课件.ppt

RNA提取提取逆逆转录实验步步骤结果分析果分析PCRqPCR内容内容1-从从RNA提取到基因定性提取到基因定性/定量流程定量流程收集并保存收集并保存组织、血液、血液、细胞等胞等临床床样本本提取、提取、纯化化RNA逆逆转录生成生成cDNAPCR/qPCR进行行定性定性/定量分析定量分析2-样本保存要求本保存要求最好使用新最好使用新鲜样品品组织：取：取样离体后，离体后，立即立即分成分成1cm3左右的小左右的小块，每每块约30-100mg，放入，放入冻存管或存管或锡箔箔纸包好，包好，立即立即放置液氮罐中速放置液氮罐中速冻1小小时，-80冰箱保存。冰箱保存。注意做好注意做好标记，避免反复，避免反复冻融融第一部分第一部分 RNA提取提取3-RNA提取提取样本保存要求本保存要求细胞胞：不建：不建议保存。保存。培养培养处理后理后立即立即提取提取RNA，或或收集收集后，于后，于Trizol液中液中-80 保存。保存。血液血液：不建：不建议长期保存。期保存。或或立即立即分离白分离白细胞后，于胞后，于Trizol液中液中 -80 保存。保存。4-试剂耗材准耗材准备工作工作目的：去除目的：去除RNase，防止，防止RNA降解降解 各种离心管、各种离心管、Tip头、冷、冷冻保存管等塑料器皿：保存管等塑料器皿：浸泡在浸泡在0.1%的的DEPC水中，水中，过夜夜处理，次日烘干，理，次日烘干，高高压灭菌后再次烘干。菌后再次烘干。锡箔箔纸、玻璃匀、玻璃匀浆管、研管、研钵、手、手术剪刀、剪刀、镊子、移液管子、移液管等玻璃、金属及陶瓷制品：等玻璃、金属及陶瓷制品：用用锡箔箔纸严密包裹后，密包裹后，150高温烘烤高温烘烤4小小时。5-前期准前期准备工作工作 RNase-free水：水：0.1DEPC处理去离子水理去离子水过夜，次日高夜，次日高压灭菌除去菌除去 残留残留DEPC，分装，分装1.5ml Eppendorf管，管，4保存。保存。75乙醇：乙醇：用用RNase-free水配制，分装水配制，分装为50ml，4保存。保存。氯仿、异丙醇、无水乙醇：仿、异丙醇、无水乙醇：新包装开封后，分装新包装开封后，分装50ml，4保存。保存。注意：注意：DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。6-样本准本准备 组织 大鼠大鼠大鼠大鼠组织组织样样品量品量品量品量总总RNARNA量（量（量（量（gg）脑脑10 mg10 mg8 8 肺肺肺肺10 mg10 mg1010肾脏肾脏10 mg10 mg1010心心心心脏脏10 mg10 mg2020脾脾脾脾脏脏10 mg10 mg3535肝肝肝肝脏脏10 mg10 mg4040 50100mg 组织对应1ml Trizol 7-样本准本准备 细胞胞 悬浮浮细胞：生胞：生长对数期数期诱导后，后，5000g，5min离心去离心去 除培养基，收集除培养基，收集约5-10106个个细胞。胞。每每5-10106个个细胞胞对应1ml Trizol 贴壁壁细胞：生胞：生长对数期数期诱导后，收集后，收集约5-10106个个细 胞，倒掉培养基，加入胞，倒掉培养基，加入预热PBS洗一次，去洗一次，去 除除PBS。每每10cm2培养面培养面积对应1ml Trizol 8-RNA的提取的提取注意佩戴口罩、勤更注意佩戴口罩、勤更换手套手套 组织（1）液氮）液氮预冷研冷研钵；（2）液氮研磨，至）液氮研磨，至样品呈粉末状（需品呈粉末状（需8-10min）；）；（3）向研）向研钵内加入内加入1ml Trizol继续研磨，至呈不黏稠液研磨，至呈不黏稠液态；（4）将混合液）将混合液转移至玻璃匀移至玻璃匀浆器中，冰上匀器中，冰上匀浆3min；（5）将匀）将匀浆液液转移至移至1.5 ml Eppendorf管，室温孵育管，室温孵育5min；裂解裂解9-10-RNA的提取的提取 细胞胞 悬浮浮细胞：离心收集后，倒除培养液，加入胞：离心收集后，倒除培养液，加入1ml Trizol 反反 复吹打复吹打细胞，至溶液不黏稠。胞，至溶液不黏稠。贴壁壁细胞：倒除培养液，胞：倒除培养液，PBS洗洗涤一次后，直接在培养一次后，直接在培养 瓶或培养板中加入瓶或培养板中加入1ml Trizol 反复吹打反复吹打细胞，胞，直至溶液不黏稠。直至溶液不黏稠。室温孵育混合液室温孵育混合液10min后，后，转移至移至1.5 ml Eppendorf管管裂解裂解11-12-Trizol匀匀浆孵育后孵育后80 保存保存加入加入0.2ml氯仿仿，剧烈烈摇动15s;3min at RT,12,000g x 15min,4 分分层取水相，取水相，0.5mL异丙醇异丙醇，颠倒混匀，倒混匀，10min at RT4，12,000g x 10min（片状沉淀物（片状沉淀物为RNA）沉淀沉淀去上清，去上清，1ml 75乙醇乙醇洗洗涤，7,500g x 5min at 4，重复一次，重复一次 洗洗涤空气干燥，加空气干燥，加50ul RNase-free水，水，55 孵育溶解孵育溶解干燥干燥溶解溶解13-RNA提取提取优化步化步骤（1）对得率得率较低的低的样本，可在异丙醇沉淀一步，本，可在异丙醇沉淀一步，选用用-20 度度过夜孵育，以增加得率。夜孵育，以增加得率。（2）对多糖含量多糖含量较高的高的样本，可在异丙醇沉淀一步，加入本，可在异丙醇沉淀一步，加入 高高盐溶液（溶液（0.8M柠檬酸檬酸钠和和1.2M NaCl），），-20度度过 夜共孵育，以去除多糖物夜共孵育，以去除多糖物质的的污染。染。注意：所有注意：所有试剂均需无均需无酶水配制。水配制。14-RNA鉴定及初定量定及初定量 （1）测量量OD值得率及得率及纯度度检测 得率得率 总RNA浓度（度（ug/ml）OD260稀稀释倍数倍数40ug/ml （通常（通常OD260 数数值介于介于0.15-1.0之之间才可靠）才可靠）纯度度 OD260/280检测RNA纯度度 值在在1.8-2.1之之间，RNA纯度度较好；好；值小于小于1.8，表明蛋白，表明蛋白杂质较多；多；值大于大于2.2，表明，表明RNA已降解；已降解；15-RNA鉴定及初定量定及初定量 （2）琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳RNA完整性完整性鉴定定 13ul RNA溶液上溶液上样，1胶，胶，100V电泳泳10min。完整完整RNA呈呈现明明显两条两条带28S，18S，且且28S带约为18S带亮度的两倍；有亮度的两倍；有时也可也可见5S带16-RNA鉴定及初定量定及初定量Electrophoresis gel of the RNA sample17-小小结RNA的保的保护 1.提取前提取前 1.1 新新鲜样品及液氮速品及液氮速冻 1.2 提取工作区提取工作区RNase的清除的清除 1.3 实验用品用品RNase的清除的清除 2.提取中提取中 2.1 组织破碎破碎过程中的保程中的保护 2.2 细胞裂解胞裂解过程中的保程中的保护 2.3 实验人人员保保护措施措施 2.4 保存保存过程中程中3.在后在后续的逆的逆转录过程中仍需保程中仍需保持无持无酶环境境18-第二部分第二部分 RT-PCR 逆逆转录PCRreverse transcriptionAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5mRNA(sense)Antisense primers:oligo(dT)orrandom hexamersor GSP1st strand cDNAAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5PCR using GSP+GSP1GSP1GSPGSP1(sense)GSP(antisense)1 st strand cDNA19-RT-PCR 逆逆转录 选择方法方法：两步法两步法（适用于多目的基因）（适用于多目的基因）一步法一步法（适用于（适用于单一目的基因）一目的基因）20-RNA逆逆转录 选择逆逆转录引物引物：随机引物随机引物（适用于低丰度（适用于低丰度RNA）Oligo(dT)引物引物（适用于具有（适用于具有Poly A尾的尾的RNA）特异性引物特异性引物（适用于一步法）（适用于一步法）21-RNA逆逆转录步步骤（1）取）取1-5ug RNA样本，本，65热变性性10min；（2）配制反）配制反应体系，共体系，共20ul（以（以AMV为例）例）10buffer 2 ulMgcl2(25mM)4 uldNTPs(10mM)2 ulRNase inhibitor(1U/ul)0.5 ulreverse transcriptase 15 Ureverse primer 0.5 ugRNA sample 1-5ugRNase-free Water 加至加至 20 ul一、逆一、逆转录反反应22-RNA 逆逆转录步步骤（3）反）反应体系体系42孵育孵育60min。如使用随机引物，先室温孵育。如使用随机引物，先室温孵育 10min后，再升温至后，再升温至42。（4）72，5min失活失活酶，置冰，置冰进行后行后续反反应或或-20 保存。保存。cDNA第一第一链已合成，可低温保存或已合成，可低温保存或继续后后续实验23-聚合聚合酶链式反式反应(Polymerase Chain Reaction)以母以母链DNA为模板模板，以，以特定引物特定引物为延伸起点，延伸起点，以反以反应底物底物脱氧核糖核苷三磷酸脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在在DNA聚合聚合酶催化催化下，通下，通过变性、退火、延伸性、退火、延伸等等步步骤，体外复制体外复制出与母出与母链模板模板DNA互互补的子的子链DNA的的过程。程。PCR的原理和反的原理和反应过程程24-RT-PCR 逆逆转录PCR PCR反反应准准备工作：工作：目的基因目的基因扩增引物增引物设计：NCBI中中查询靶基因的靶基因的mRNA序列，无特序列，无特 殊要求可殊要求可选择CDS序列作序列作为引物引物设计区域。区域。25-RT-PCR 逆逆转录PCR mRNA序列序列查找（以找（以EGFR为例）例）26-RT-PCR 逆逆转录PCR27-28-以以BLAST验证引物引物29-RT-PCR 逆逆转录PCR PCR反反应准准备工作：工作：选择内参内参：1.受不同受不同实验处理因素理因素时，表达恒定；，表达恒定；2.在体内各种在体内各种组织中表达恒定；中表达恒定；3.除除实验设计处理因素之外，能理因素之外，能够与目的基因与目的基因 一起受同等程度的非一起受同等程度的非设计其它因素影响。其它因素影响。常用内参基因名称：常用内参基因名称：-actin、GAPDH、16Sr、18Sr （Human、Rat、Mouse）30-RT-PCR 逆逆转录步步骤 二、二、PCR扩增增（示例）（示例）1.cDNA第一第一链 2 ul2.10PCR buffer(K+)5 ul3.25mM MgCl2 3 ul (1.5 mM)4.10mM dNTPs 1 ul (各各200 uM)5.50M引物引物 正向正向/反向反向 各各0.5 ul (0.10.5 uM)6.Taq 酶 0.5 ul (15U)7.双蒸水双蒸水 38.5 ul总反反应体体积：50 ulPCR mix包含：包含：buffer（Mg2+）dNTPs Taq酶31-RT-PCR 逆逆转录步步骤 PCR反反应条件条件95 2 min95 30 sec40-65 10-120 sec22-35cycle72 60-120 sec72 10min12 退火温度退火温度：引物的退火温度一般要比估：引物的退火温度一般要比估计的相的相应熔点温度熔点温度Tm低低5左右。两条引物的退左右。两条引物的退火温度相差不火温度相差不应超超过4-6。特异性的改特异性的改进：提高退火温度（比建：提高退火温度（比建议退火温度提高退火温度提高2-5）；减少退火）；减少退火时间。过长的退的退火火时间在正常情况下并不能提高在正常情况下并不能提高产量，只会增加非特异性引物量，只会增加非特异性引物杂交的可能性。交的可能性。32-注意事注意事项（1）每次）每次PCR设立立对照照组和和阴性阴性对照照组。（2）科学做法是将内参引物加入目的基因的）科学做法是将内参引物加入目的基因的PCR扩增增反反应体系中，体系中，同同时扩增增作作为对照。照。（3）将反）将反应体系中的相同体系中的相同试剂预先混合，再先混合，再分装分装成各成各 反反应管。管。（4）设定合适的定合适的循循环次数次数，PCR不能不能进入平台期。入平台期。（5）在一定范）在一定范围内内调整整Mg2+浓度、引物度、引物浓度、退火温度、退火温 度度，消除非特异性，消除非特异性扩增。增。33-结果果鉴定定 琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳分析泳分析结果：果：2琼脂糖凝胶，取脂糖凝胶，取4-8 ul产物上物上样，60V电泳泳40min，紫外灯下紫外灯下观察察结果。果。采用凝胶采用凝胶图像分析系像分析系统，对电泳条泳条带进行密度行密度扫描，描，测定灰度定灰度值。注意：灰度注意：灰度扫描描时，选择合适的胶空白区域作合适的胶空白区域作为扣除的扣除的 背景灰度背景灰度值。34-基因表达的差异分析相基因表达的差异分析相对定量定量各反各反应体系以内参基因体系以内参基因为参照，参照，计算待算待测基因基因产物物与其灰度比与其灰度比值，作，作为待待测基因的表达基因的表达值。即。即待待测基因基因产物物电泳泳带灰度灰度值内参基因内参基因产物物电泳泳带灰度灰度值 双双标准曲准曲线法：法：待待测样本基因本基因相相对表达量表达量 参照参照样本基因本基因相相对表达量表达量待待测基因基因相相对表达量表达量35-结果示例果示例 36-结果示例果示例37-荧光定量光定量PCR (Real-time PCR,qPCR)PCR+荧光探光探针/荧光染料光染料应用广泛：可用于用广泛：可用于DNA和和RNA的的PCR产物定量、基因表达物定量、基因表达 研究、病原体研究、病原体检测及及PCR条件的条件的优化化等。等。可定量原理可定量原理：经激光激激光激发后后荧光量随光量随PCR循循环而累而累积，从而，从而 达到定量目的。达到定量目的。无无须凝胶凝胶电泳：只泳：只须反反应管内直接管内直接检测。减少减少污染染环节：全封：全封闭反反应管。管。结果重果重现性好：定量性好：定量动态范范围高达五个数量高达五个数量级。38-Log DNALog DNA循循环数数线性增性增长期期Linear平台期平台期Plateauy=x(1+e)n指数增指数增长期期Geometric39-Real-time PCR相同模板相同模板进行行96次次扩增的增的扩增曲增曲线图起始拷起始拷贝数越高，数越高，Ct值越小；起始拷越小；起始拷贝数越低，数越低，Ct值越大越大40-与与DNA结合合时发光光游离游离时不不发光光 一种一种DNA小小沟沟结合染料合染料1SYBR Green I荧光染料光染料41-在在PCR过程中染料与程中染料与DNA结合合发光光聚合完成聚合完成聚合开始聚合开始SYBR Green I42-1.每形成一个每形成一个DNA双双链，就有一定数量的，就有一定数量的染料染料结合上去合上去2.染料一染料一结合，就合，就产生生荧光信号光信号3.信号信号强度与度与DNA分子分子总数目成正比数目成正比数量关系数量关系43-一条探一条探针，两条引物，两条引物l 引物位于探引物位于探针的两的两边一条探一条探针，两个基，两个基团l 前前边是是报告基告基团，后，后边是淬是淬灭基基团 35RQ3355355TaqMan探探针/水解探水解探针44-1.每每产生一条生一条DNA链，就切断一条探，就切断一条探针2.每切断一条探每切断一条探针，就，就产生一个生一个单位信号位信号3.信号信号强度与度与结合探合探针的的DNA分子数分子数成正比成正比数量关系数量关系5TaqMan 探探针上游引物335下游引物RQ3535QR45-Real-time PCR反反应体系体系1.cDNA第一第一链 2 ul2.10M引物引物 正向正向/反向反向 各各1 ul (0.10.5 uM)3.2SYBR Green qPCR Mix 10ul 4.双蒸水双蒸水 7 ul 总体体积 20 ulSYBR Green qPCR Mix包含：包含：SYBR Green、buffer（Mg2+）、）、dNTPs、Taq酶46-Real-time PCR的定量方式的定量方式绝对定量定量：通：通过定量定量标准曲准曲线来确定起始模板的拷来确定起始模板的拷贝数；数；相相对定量定量：用来确定：用来确定经过不同不同处理的理的样品目品目标转录本之本之间的表的表 达差异或是目达差异或是目标转录本在不同本在不同时相的表达差异。相的表达差异。结果分析果分析 Ct法：法：目的基因与管家基因（内参）目的基因与管家基因（内参）扩增效率相同或接近增效率相同或接近 一致一致时，采用此法。，采用此法。47-Ct法法举例：例：测定定X基因在某因子作用前后的表达基因在某因子作用前后的表达变化化内参基因：内参基因：GAPDH;实验分分实验组和和对照照组X基因基因Ct值（平均（平均值）GAPDH Ct值（平均（平均值）CtCt2Ct对照照组27.3516.9810.3701实验组127.5216.8610.660.290.82实验组227.1717.0510.12-0.251.2248-