玉米ZmSOD基因克隆及其在干旱胁迫下的表达.pdf

西北植物学报,2 0 2 3,4 3(7):1 0 9 7-1 1 0 6A c t a B o t.B o r e a l.-O c c i d e n t.S i n.d o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 0-4 0 2 5.2 0 2 3.0 7.1 0 9 7 h t t p:/x b z w x b.a l l j o u r n a l.n e t收稿日期:2 0 2 3-0 1-0 4;修改稿收到日期:2 0 2 3-0 4-0 7基金项目:河南省自然科学基金青年项目(2 1 2 3 0 0 4 1 0 3 0 4);河南省高等学校重点科研项目(2 1 A 2 1 0 0 2 8);大学生科研创新基金项目(2 0 2 1 0 0 7)作者简介:李玉华(1 9 8 0-),女,博士,副教授,主要从事玉米抗旱机理及基因功能研究。E-m a i l:2 0 1 0 l i y u h u a 1 6 3.c o m*通信作者:王同朝,教授,博士导师,主要从事作物抗旱节水栽培理论与技术研究。E-m a i l:w t c w r n 1 2 6.c o m玉米Z m S O D基因克隆及其在干旱胁迫下的表达李玉华1,赵振华1,吴 征1,白佳田1,王烁莹1,王同朝2*(1 郑州师范学院 生命科学学院,郑州 4 5 0 0 4 4;2 河南农业大学 农学院,河南粮食作物协同创新中心,郑州 4 5 0 0 0 2)摘 要:为探讨超氧化物歧化酶(s u p e r o x i d e d i s m u t a s e,S O D)基因在玉米抗逆反应中的作用,研究选用2个抗旱性有明显差别的玉米品种为试验材料,采用R T-P C R、实时荧光定量P C R(q R T-P C R)及二维凝胶电泳(2-D E)耦联的基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MA L D I-T O F)法,对Z m S O D基因的序列结构及其在干旱胁迫下的表达特性进行分析。结果表明:(1)从干旱敏感品种 登海6 0 5(DH 6 0 5)和抗旱品种 蠡玉3 5(L Y 3 5)玉米叶片中分别成功克隆出Z m S O D 1和ZmS O D 2基因。DH 6 0 5中Z m S O D 1开放阅读框(OR F)全长4 5 6 b p,编码1 5 1个氨基酸,编码的蛋白等电点为5.7 6,分子量为1 5.0 5 k D。L Y 3 5中Z m S O D 2OR F全长4 5 9 b p,编码1 5 2个氨基酸,编码的蛋白等电点为5.6 5,分子量为1 5.1 1 k D;Z m S O D 1和Z m S O D 2是亲水性稳定蛋白,都含有C u/Z n-S O D结构域,蛋白序列N端无信号肽及无跨膜结构域。同源性和系统进化分析表明,玉米Z m S O D和谷子C u/Z n-S O D 2的亲缘关系最近,相似性高达9 6.0 5%。(2)在干旱条件下,Z m S O D 1在DH 6 0 5中转录水平明显降低,L Y 3 5中Z m S O D 2转录水平显著升高;2-D E耦联的质谱分析显示:Z m S O D 1在DH 6 0 5中表达量明显降低,L Y 3 5中Z m S O D 2表达量无显著性变化,却检测到M n-S O D蛋白表达量显著增加。(3)相关分析显示,干旱条件下,DH 6 0 5叶片中Z m S O D 1转录水平和其蛋白丰度及S O D酶活性呈极显著性正相关,L Y 3 5叶片中Z m S O D 2转录水平与S O D酶活性呈显著性正相关。研究结果为进一步探索S O D基因在调节玉米抗性以及逆境胁迫应答过程中的作用机制提供了基础。关键词:玉米;Z m S O D;基因克隆;表达分析;干旱胁迫;S O D活性中图分类号:Q 7 8;S 5 1 3文献标志码:AC l o n i n g a n d E x p r e s s i o n o f Z m S O D G e n e u n d e r D r o u g h t S t r e s s i n M a i z eL I Y u h u a1,Z HAO Z h e n h u a1,WU Z h e n g1,B A I J i a t i a n1,WANG S h u o y i n g1,WANG T o n g c h a o2*(1 C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e s,Z h e n g z h o u N o r m a l U n i v e r s i t y,Z h e n g z h o u 4 5 0 0 4 4,C h i n a;2 C o l l a b o r a t i v e I n n o v a t i o n C e n t e r o f H e n a n G r a i n C r o p s,A g r o n o m y C o l l e g e o f H e n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,Z h e n g z h o u 4 5 0 0 0 2,C h i n a)A b s t r a c t:I n o r d e r t o e x p l o r e t h e r o l e o f s u p e r o x i d e d i s m u t a s e(S O D)g e n e i n m a i z e s t r e s s r e s i s t a n c e,w e s e l e c t e d t w o m a i z e s e e d l i n g s w i t h d i s t i n c t d i f f e r e n c e s i n d r o u g h t r e s i s t a n c e a s e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s.T h e s e q u e n c e s t r u c t u r e a n d e x p r e s s i o n p a t t e r n s o f Z m S O D g e n e u n d e r d r o u g h t s t r e s s w e r e a n a l y z e d b y R T-P C R,q u a n t i t a t i v e r e a l-t i m e P C R(q R T-P C R)a n d t w o-d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s(2-D E)c o u p l e d w i t h m a t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n/t i m e o f f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y(MA L D I-TO F).T h e r e-s u l t s s h o w e d t h a t:(1)T h e f u l l-l e n g t h c D NA s e q u e n c e s o f S O D g e n e w e r e c l o n e d s u c c e s s f u l l y f r o m t h e l e a v e s o f d r o u g h t-s e n s i t i v e D e n g h a i 6 0 5(DH 6 0 5)a n d d r o u g h t-r e s i s t a n t L i y u 3 5(L Y 3 5),r e s p e c t i v e l y.T h e o p e n i n g r e a d i n g f r a m e(O R F)o f Z m S O D 1 g e n e i n DH 6 0 5 w a s 4 5 6 b p i n l e n g t h,e n c o d i n g 1 5 1 a m i n o a c i d s.T h e i s o e l e c t r i c p o i n t o f Z m S O D 1 p r o t e i n w a s 5.7 6,a n d i t s m o l e c u l a r w e i g h t w a s 1 5.0 5 k D.T h e O R F o f Z m S O D 2 g e n e i n L Y 3 5 w a s 4 5 9 b p i n l e n g t h,e n c o d i n g 1 5 2 a m i n o a c i d s.T h e i s o e l e c t r i c p o i n t o f Z m S O D 2 p r o t e i n w a s 5.6 5,a n d i t s m o l e c u l a r w e i g h t w a s 1 5.1 1 k D.Z m S O D 1 a n d Z m S O D 2 a r e h y d r o p h i l-i c s t a b l e p r o t e i n s,b o t h c o n t a i n i n g C u/Z n-S O D d o m a i n w i t h o u t s i g n a l p e p t i d e a n d t r a n s m e m b r a n e d o m a i n a t t h e N-t e r m i n a l.H o m o l o g y a n d p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s s h o w e d t h a t Z m S O D w a s h i g h l y h o m o l o g o u s t o F m C u/Z n-S O D 2,a n d t h e s i m i l a r i t y w a s a s h i g h a s 9 6.0 5%.(2)U n d e r d r o u g h t c o n d i t i o n s,t h e t r a n s c r i p-t i o n l e v e l o f Z m S O D 1 i n DH 6 0 5 w a s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d,a n d t h a t o f Z m S O D 2 i n L Y 3 5 w a s s i g n i f i-c a n t l y i n c r e a s e d.T h e 2-D E c o u p l e d m a s s s p e c t r o m e t r y s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f Z m S O D 1 i n DH 6 0 5 w a s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d,t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f Z m S O D 2 i n L Y 3 5 w a s n o t s i g n i f i c a n t l y c h a n g e d,b u t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f M n-S O D w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d.(3)C o r r e l a t i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e t r a n s c r i p t i o n l e v e l o f Z m S O D 1 i n DH 6 0 5 l e a v e s w a s m a r k e d p o s i t i v e c o r r e l a t e d w i t h i t s p r o t e i n a b u n d a n c e a n d S O D a c t i v i t y,a n d t h e t r a n s c r i p t i o n l e v e l o f Z m S O D 2 i n L Y 3 5 l e a v e s w a s p o s i t i v e l y c o r r e l a-t e d w i t h S O D a c t i v i t y.T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y p r o v i d e d a b a s i s f o r f u r t h e r e x p l o r i n g t h e m e c h a n i s m o f S O D g e n e i n r e g u l a t i n g m a i z e r e s i s t a n c e a n d s t r e s s r e s p o n s e.K e y w o r d s:m a i z e;Z m S O D;g e n e c l o n i n g;e x p r e s s i o n a n a l y s i s;d r o u g h t s t r e s s;a c t i v i t y o f S O D 氧化胁迫是需氧生物在各种环境胁迫条件下由氧的副产物引起的,对这些环境胁迫最直接的反应是活性氧(r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s,R O S)水平的升高,包括单线态氧(1O2)、过氧化氢(H2O2)、超氧自由基(O-2)、羟基自由基(OH)、过氧/超氧化 氢(HO2)和烷氧自由基(R O)等。这些R O S会在细胞和基因水平上导致潜在的损伤和有害的影响,如细胞死亡和D NA突变1。在活细胞中,抗氧化系统对对抗细胞氧化胁迫是至关重要的2。超氧化物歧化酶(S O D,E C 1.1 5.1.1)是抗氧化系统的重要组成部分,它通过催化O-2的淬变生成O2和H2O2,提供一线酶促防御3。根据酶结合的金属辅助因子,有4种不同形式的S O D,如C u/Z n-S O D和F e-S O D(叶绿体、胞浆、线粒体、过氧化物酶),M n-S O D(线粒体、过氧化物酶体)和N i-S O D(原核胞浆)。这种特定的亚细胞定位的每个亚型被认为是重要的分隔化氧化还原信号。在所有的S O D酶中,C u/Z n-S O D是植物中最丰富的一种,主要分布在细胞质、叶绿体、过氧化物酶体中,有时也分布在细胞外空间4。S O D基因是一个多基因家族,在同一植物中存在多个不同家族的S O D基因,且不同植物S O D家族基因的数量存在较大差异5-7。对不同植物S O D基因的研究表明,这些基因可以作为抵御包括冷、热、盐和干旱等非生物胁迫的第一道防线8-9。个体S O D基因家族成员在不同物种和不同环境胁迫下的表达模式不同。如:对拟南芥植株进行多种处理发现,臭氧熏蒸降低了叶绿体中F e-S O D 1和C u/Z n-S O D 2的转录水平,而叶绿体F e-S O D 2的mR-NA相对保持不变。F e-S O D 2 mR NA对UV-B的响应显著增加,F e-S O D 1和C u/Z n-S O D 2的mR-NA却保持稳定,C u/Z n-S O D 1 mR NA在UV-B和臭氧处理下都明显升高1 0。同样,在干旱胁迫下,白三叶草中F e S O D、M n-S O D和C u/Z n-S O D基因产生了更多的转录本1 1;陆地棉中3种S O D基因的表达均显著上调,而在低温胁迫下,只有C u/Z n-S O D基因的表达升高1 2。在小麦中,这个家族的成员在不同组织中表达不同,在高温、干旱和盐胁迫下,小麦C u/Z n-S O D和M n-S O D 高度表达1 3。相反,在干旱胁迫下,香蕉中的C u/Z n-S O D、F e-S O D和M n-S O D基因表达量却降低1 4;在玉米中鉴定 出 的6个C u/Z n-S O D基 因,其 中C u/Z n-S O D 2在干旱胁迫下表达水平显著上升,而C u/Z n-S O D 4在干旱胁迫下表达水平显著下降1 5。近年来 研 究 报 道,许 多 胁 迫 诱 导 的C u/Z n-S O D异构体已在多种单子叶和双子叶植物中被鉴定1 5-1 6,且其在植物中的防御功能已被转基因方法所证实。如在水稻中过表达O s C u/Z n-S O D基因增强了植株对盐胁迫的耐受性1 7,在烟草中过表达花生C u/Z n-S O D可以缓解高盐和干旱对植株的伤害1 8,在拟南芥中过表达C u/Z n-S O D可使拟南芥耐受多种非生物胁迫1 9-2 1。过表达C u/Z n-S O D的大量研究表明,将其表达水平与植物的氧化应激耐受程度联系起来,发现了它们在植物适应非生物和生物胁迫中的重要性。玉米在世界范围内被广泛用作粮食作物和饲料作物,也是遗传研究的主要模式植物。玉米是研究C4光合作用和非生物胁迫耐受性功能基因组学的理想材料。已知干旱、高温、寒冷和高盐等环境胁迫会降低农作物产量,鉴于玉米在中国农业生产和国8901西 北 植 物 学 报 4 3卷民经济发展中的重要性,在不利环境下提高玉米产量一直是学者研究的热点。尽管玉米基因组的研究进展迅速,辅助基因表达模式来深入理解基因功能的要求日益增长,仍需要对S O D基因在玉米中的特性及功能进行研究。1 材料和方法1.1 试验材料和设计依据项目组前期研究工作基础2 2,选用抗旱性有明显差异的玉米杂交品种 蠡玉3 5(L Y 3 5,抗旱性强)和 登海6 0 5(DH 6 0 5,干旱敏感)为试验材料。种子在塑料钵中播种(每钵1粒种子),填充2种不同相对含水量的土壤。田间最大持水量(f i e l d c a p a c i t y,F C)为 每1 0 0 g土 壤 干 重 最 大 含 水 量2 2.6 7 g。播种后,土壤水分保持在7 5%的为对照植株,土壤水分保持在4 0%的为干旱胁迫植株,2个品种的土壤含水量控制相同。供试材料于光照培养箱内培养1周(日照时间为1 5 h,温度2 8,光照度6 0 0 0 l x;黑暗9 h,温度2 5),第8天开始取样。采集植株幼苗上第二片叶(自下往上)立即液氮速冻后保存在-8 0 冰箱用于后续试验。每个处理3个生物学重复。1.2 方 法1.2.1 Z m S O D基因克隆 利用P l a n t R N e a s y试剂盒(凯杰,德国)从2个品种玉米叶片中提取总R NA,R NA浓度和纯度用微量分光光度计N a n o-d r o p 2 0 0 0(热电,美国)测定。根据p r i m e S c r i p tTM R T试剂盒(T a K a R a,N o.R R 0 4 7 A)说明书合成第一链 c D NA,以c D NA为模板进行P C R扩增,扩增程序为:9 5 预变性4 m i n;9 5 变性3 0 s,5 8 复性3 0 s,7 2 延伸5 0 s,3 5个循环;7 2 终延伸1 0 m i n。P C R产物电泳检测后,使用胶回收试剂盒(T a K a R a,N o.9 7 6 2)纯化回收,连接p MDTM 1 8-T载体(T a K a R a,N o.6 0 1 1),转化大肠杆菌DH 5 感受态细胞,挑取阳性克隆菌液,送华大基因公司测序。用于克隆Z m S O D基因全长和q R T-P C R引物序列如表1所示。表1 试验所用引物T a b l e 1 P r i m e r s i n t h i s s t u d y引物名称P r i m e r n a m e上游引物F o r w a r d p r i m e r(5 3)下游引物R e v e r s e p r i m e r(5 3)Z m S O D(O R F)G C A T G G T GAA/G G C T/G T(A T G C)G C(A T G)G TG C T T A(A G T)C C(T C)T G(A C)A(A G)(A T G C)C C(A G)A T(A G)A T A C CZ m S O D(q R T-P C R)G G C AG T T G C T G T C C T C GA G C C G T T G G T G G T G T C G1 8 S(A F 1 6 8 8 8 4.1)C C T G C G G C T T AA T T GA C T CG T T A G C A G G C T GA G G T C T C G1.2.2 基因序列及预测蛋白分析 利用B l a s t软件从G e n B a n k中 挑 选 甘 蓝 型 油 菜(登 录 号 为AAY 4 0 3 1 7.1)、大白菜(登录号为A a c 2 5 5 6 8.1)、萝卜(登 录 号 为AA D 0 5 5 7 6.1)、拟 南 芥(登 录 号 为A B N 5 0 3 6 6.1)、琴叶拟南芥(登录号为X P 0 0 2 8 8 9 7 1 6.1)和芥菜(登录号为AAN 6 0 7 9 6.1)6个十字花科植物的C u/Z n-S O D基 因 编 码 的 氨 基 酸 序 列,利 用D NAMAN软件将其与甘蓝型油菜C u/Z n-S O D的氨基酸序列进行多序列比对,并通过ME GA 6.0软件构建系统进化树。利用P r o t P a r a m在线软件进行理化性质分析(h t t p:/w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m/);TMHMM软件进行蛋白质跨膜区段分析(TMHMM:h t t p:/www.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/TMHMM/);S i g n a l P软件进行N-末端 信号肽序列 预 测 分 析(h t t p:/www.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/S i g n a l P/);N C B I在线C D S进 行 结 构 域 预 测 分 析(h t t p:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/S t r u c t u r e/c d d/);利用E x P A S y工具S O PMA软件进行蛋白质二级结构预测。1.2.3 q R T-P C R分析 q R T-P C R用T B G r e e nTM P r e m i x E x T a qTM(T a K a R a,N o.R R 8 2 0 A)在3 2孔实时荧光定量P C R仪L i g h t c y c l e r N a n o(罗氏,瑞士)上进行。q R T-P C R程序条件是:9 5 预变性3 0 s;9 5 5 s,6 0 3 0 s,4 0个循环,1 8 S作为内参基因。2 0 L反 应 体 系 包 括:正/反 向 引 物(1 0 m o l/L)各0.8 L,模板2 L,d d H2O 6.4 L和T B G r e e nTM P r e m i x E x T a qTM为1 0 L。每个样品进 行2个 技 术 重 复 和3个 生 物 学 重 复,采 用2-CT方法计算Z m S O D的相对表达量。1.2.4 2-D E和质谱鉴定分析Z m S O D 蛋白 参照L i等2 3的方法提取玉米叶片中总的蛋白质进行双向电泳,分离鉴定Z m S O D蛋白,每个样品3个生物学重复。将叶片组织(1 g)在液氮中磨成细粉,加入99017期 李玉华,等:玉米Z m S O D基因克隆及其在干旱胁迫下的表达适量含有1 0%(m/V)三氯乙酸的冷丙酮进行提取。晾干的蛋白沉淀溶于水化缓冲液中9.5 m o l/L尿素,4%(m/V)CHA P S,6 0 mm o l/L D T T,2%(V/V)两性电解质 进行2-D E电泳,每5 0 0 L缓冲液中加入1 0 L蛋白抑制剂C o c k t a i l S e t I(M e r c k)。用超声波(8 0 W,超声1 0 s,间歇1 5 s,1 0次)粉碎蛋白样品,1 4 0 0 0g离心2 0 m i n。以牛血清白蛋白为标准,采用B i o-R a d蛋白试剂 盒测定总蛋 白含量。第一向等电聚焦用1 3 c m I P G胶条(p H 31 0,非 线 性)在E t t a n I P G p h o r I E F S y s t e m(G E Am e r s h a m,美国)上进行,聚焦程序设置为:3 0 V 1 2 h,5 0 0 V 1 h,1 0 0 0 V 1 h,8 0 0 0 V 8 h。第一向聚焦完成后,胶条放在平衡液5 0 mm o l/L T r i s-HC l,p H 8.8,2%S D S,6 m o l/L尿素,3 0%甘油,1%(m/V)D T T 中平衡1 5 m i n,然后再将胶条在缓冲液中平衡1 5 m i n 其成分与I液相同,但用4%(m/V)碘 乙 酰 胺 替 代D T T。第 二 项 S D S-P AG E用1 2.5%聚丙烯酰胺凝胶在H o f e r S E 6 0 0(G E Am e r s h a m,美国)垂直板上以每胶条1 5 mA运行3 0 m i n,然后以每胶条3 0 mA运行3 0 m i n,直至溴酚蓝达到凝胶末端取出凝胶。用I m a g e M a s-t e r 2 D P l a t i n u m分析软件对2-D E凝胶图片进行分析处理,选取3次重复中丰度差异大于1.2倍的蛋白质点做进一步分析。1.2.5 S O D活性测定 参照 e l i k2 4的方法测定玉米幼苗叶片中的S O D活性。通过检测在5 6 0 n m处氮蓝四唑的光化学还原抑制率来测定总的S O D活性,1个单位的酶活性被定义为引起氮蓝四唑还原5 0%抑制所需的酶量。1.3 统计分析数据以平均值标准差表示,至少3个生物学重复。所有统计分析均用S P S S 2 0.0进行,采用 D u n c a n进行多重差异显著性分析。2 结果与分析2.1 Z m S O D 基因的克隆和序列分析分别提取2个玉米品种DH 6 0 5和L Y 3 5幼苗叶片的总R NA,经分光光度计检测,D2 6 0/2 8 0均为1.8 2.1,并用1%琼脂糖凝胶电泳检测R NA的质量和完整性,都表明提取的R NA质量很好。以c D-NA为模板P C R扩增产物均在近5 0 0 b p处有一特异性条带,凝胶电泳检测结果如图1所示。测序结果分析显示:DH 6 0 5中Z m S O D 1的O R F全长4 5 6 b p,编码1 5 1个氨基酸;L Y 3 5中Z m S O D 2的O R F全长4 5 9 b p,编码1 5 2个氨基酸。用D NAMAN对Z m S O D 1和ZmS O D 2与G e n B a n k中 的S O D核 苷 酸 序 列 进 行 比 对 发 现:Z m S O D 1与 谷 子(XM_0 1 2 8 4 2 9 6 7)、水 稻(NM_0 0 1 4 0 2 1 5 5)和拟南芥(NM_1 0 0 7 5 7)等植物S O D的c D NA 序列一致性高于7 2.7 7%(图2),Z m S O D 2和以上几种植物S O D的c D NA序列一致性高于7 4.0 7%,表明克隆得到的Z m S O D 1和ZmS O D 2属于S O D基因家族成员。M.D L 2 0 0 0;1-2.Z m S O D图1 Z m S O D 基因扩增F i g.1 Am p l i f i c a t i o n o f Z m S O D2.2 Z m S O D编码的蛋白质理化性质和系统进化分析 用P r o t P a r a m软件对Z m S O D 1和ZmS O D 2编码的蛋白质进行推算,Z m S O D 1编码1 5 1个氨基酸,蛋白等电点5.7 6,分子量1 5.0 5 k D;Z m S O D 2编码1 5 2个氨基酸,蛋白等电点5.6 5,分子量1 5.1 1 k D。预测Z m S O D 1和Z m S O D 2蛋白不稳定系数分别为1 8.5 1和2 2.2 7,脂肪系数分别为7 3.5 8和7 6.3 2,总平均亲水指数分别为-0.2 4 5和-0.1 9 8,均属稳定亲水性蛋白。用TMHMM和S i g n a l P 3.0分 析 显 示Z m-S O D 1和Z m S O D 2序列N端无信号肽及无跨膜结构域,包含1个保守的C u/Z n-S O D功能结构域,属于C u/Z n-S O D家族成员。亚细胞定 位分析Z m-S O D 1和Z m S O D 2是位于细胞基质中的非分泌蛋白,为细胞质型定位。二级结构分析显示,Z m S O D 1和Z m S O D 2蛋白分别包含5 3.6 4%和5 3.2 9%无规则卷曲,3 2.4 5%和3 6.1 8%延伸链,7.2 8%和6.5 8%-转角,以及6.6 2%和3.9 5%-螺旋。同源性和系统进化分析发现,玉米Z m S O D 1和Z m S O D 2蛋白和单子叶植物谷子C u/Z n-S O D蛋白0011西 北 植 物 学 报 4 3卷(登录号X P_0 1 2 6 9 8 4 2 1)的亲缘关系最近,相似性分别高达9 3.4 2%和9 6.0 5%,并且Z m S O D在氨基酸水平与其他植物的S O D s也有很高的相似性,与水稻O s S O D(X P_0 0 1 3 8 9 0 8 4)的 相 似 性 分 别 为9 0.1 3%和9 2.7 6%;与高粱S b S O D(X P_0 2 1 3 0 9 5 9 8)的相似性分别为8 7.5 0%和9 0.1 3%,与拟南芥(N P_1 7 2 3 6 0)的 相 似 性 也 较 高,分 别 是8 1.5 8%和8 4.2 1%(图3)。使用ME GA 5.0软件系统发育分析发现,Z m-S O D首先与禾本科谷子F m S O D和水稻O s S O D聚合在一起,再与禾本科高粱S b S O D聚合在一起,最后与其他科植物的S O D 聚合(图4)。表明已知的C u/Z n-S O D氨基酸序列中,玉米和禾本科植物的亲缘关系最近,这与b l a s t p结果基本一致。图2 玉米Z m S O D和其他植物的S O D核苷酸序列多重比对F i g.2 M u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t o f Z m S O D n u c l e o t i d e s e q u e n c e s w i t h S O D s f r o m o t h e r p l a n t s图3 玉米Z m S O D和其他植物的S O D氨基酸序列多重比对F i g.3 M u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t o f Z m S O D a m i n o a c i d s e q u e n c e s w i t h S O D s f r o m o t h e r p l a n t s10117期 李玉华,等:玉米Z m S O D基因克隆及其在干旱胁迫下的表达分支点上的数字为自展值百分比。图4 玉米Z m S O D蛋白与其他植物S O D s的系统发育树分析T h e n u m b e r s s h o w n a t t h e b r a n c h e s a r e b o o t s t r a p v a l u e s.F i g.4 T h e p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f Z m S O D a n d o t h e r S O D s f r o m v a r i o u s p l a n t s2.3 Z m S O D响应干旱胁迫分析从图5可以看出,和对照相比,干旱处理导致Z m S O D转录水平在DH 6 0 5和L Y 3 5叶片中都发生显著变化。但干旱胁迫条件下DH 6 0 5幼苗叶片中Z m S O D 1的表达量为对照的6 2.5%,显著下降;而L Y 3 5幼苗叶片中Z m S O D 2的表达量为对照的2.6 8倍。这些结果表明Z m S O D基因响应了干旱处理,且其在不同的玉米品种幼苗叶片中的响应模式存在差异。*和*表示该处理与对照组表达量比较差异显著(P0.0 5)和极显著(P0.0 1)。下同。图5 干旱处理下2个玉米品种Z m S O D的表达*a n d*r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e a t 0.0 5 a n d 0.0 1,r e s p e c t i v e l y,a s c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l.T h e s a m e a s b e l o w.F i g.5 T h e e x p r e s s i o n p a t t e r n s o f Z m S O D i n DH 6 0 5 a n d L Y 3 5 u n d e r d r o u g h t s t r e s s c o n d i t i o n 进一步结合2-D E耦联的MA L D I-TO F法分析2个玉米品种响应干旱胁迫时的蛋白表达模式,质谱分析与N C B I数据库中的玉米蛋白序列库进行比对,只有高得分、较多肽段数和蛋白可信度不低于9 5%的蛋白才被认定为Z m S O D s。图6显示,2个玉米品种幼苗在干旱胁迫条件下,DH 6 0 5中的点1(图6,A、B)和L Y 3 5中的点2(图6,C、D)蛋白表达量和对照比均有显著变化。其中,DH 6 0 5幼苗叶片中的Z m S O D 1在干旱条件下表达量下调,且对照植株叶片中的 表达量为干 旱条件下的1.2 5倍;在L Y 3 5幼苗 叶 片 中 鉴 定 到 的S O D蛋 白 属 于M n-S O D,在干旱条件下表达量上调,为对照的1.7 9倍。从DH 6 0 5和L Y 3 5中鉴定出的Z m S O D,其蛋白名称、登录号、可信度及匹配的肽序列等详细信息都列在表2中。A-B.在对照(A)和干旱胁迫(B)下 登海6 0 5 的2-D E图像;C-D.在对照(C)和干旱胁迫(D)下 蠡玉3 5 的2-D E图像。图6 2个玉米品种干旱胁迫下Z m S O D蛋白的表达A a n d B r e p r e s e n t t h e c o n t r o l a n d t h e d r o u g h t s t r e s s e d p l a n t s o f DH 6 0 5,