人IL-17AF定量检测试剂盒(ELISA)说明书.doc

仅供科研使用，不得用于临床检验。
人IL-17AF定量检测试剂盒（ELISA）说明书
【货 号】YKE-1434

【产品名称】
通用名称：人IL-17AF定量检测试剂盒（ELISA）
英文名称： Human IL-17AF

【包装规格】
96人份/盒

【预期用途】
仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中IL-17AF的浓度。

【检验原理】
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人IL-17AF单克隆抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的IL-17AF与固相抗体和检测抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP)。洗涤后，加入显色底物TMB，避光显色。颜色反应的深浅与样本中IL-17AF的浓度成正比。加入终止液终止反应，在450 nm波长(参考波长570 -630 nm)测定吸光度值。
【主要组成成分】
主要成分
组分
规格
数量
包被微孔板
96T
1板
标准品
4000pg/mL
2管
抗体
80uL
1管
辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素
150uL
1管
10×检测缓冲液
5mL
1瓶
标准品稀释液
5mL
1瓶
TMB显色液
10mL
1瓶
TMB终止液
10mL
1瓶
洗涤缓冲液(20X)
30ml
1瓶
封板膜

4张
注意：使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致
【样本要求】
样本类型和采集
细胞培养上清
300 g 离心 10 分钟去除沉淀物，即刻检测, 或者分装，-20℃以下贮存。
血清样本
分离管分离血清。在 1000 g 离心之前，使血样凝集 30 分钟。吸取血清样本之后即刻检测，或 者分装，-20℃以下贮存。
血浆样本
EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。1000 g 离心 3 0 分钟收集样本。即刻检测，或者 分装，-20℃以下贮存。 本试剂盒可能适用于其它生物学样本。
细胞培养上清、血清和血浆已经过验证。

注意：检测前，样本中可见的沉淀必须去除。不要使用严重溶血或高血脂的样本。 样本应分装并贮存于-20℃，以避免人IL-6活性的丢失。如果在 24 小时内检测，样本可以 存放在 2 - 8℃。 避免样本的反复冻融。在检测前，冷冻样本应该缓慢地恢复至室温，轻柔地混匀。

样本保存和稳定性
样本在2-8℃条件下，可以储存72h，或者在- 20℃储存6个月。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。

【检验方法】
试剂准备
检测前请将所有的试剂、样本恢复至室温。 如果浓缩的试剂出现结晶，37℃温浴，直至结晶全部溶解。

1×洗液
吸取 20×浓缩洗液 30 ml 至 1 L 的量筒，加蒸馏水或去离子水至600 ml，轻轻混匀，避免泡 沫。 转移至干净瓶内。2 - 25℃贮存，1×洗液可稳定 30 天。

1×检测缓冲液
吸取 10×浓缩检测缓冲液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸馏水或去离子水至 50 ml，轻轻混匀，避 免泡沫。 2 - 8℃贮存，1×检测缓冲液可稳定保存 30 天。
检测抗体 稀释前充分混匀。根据标准品和待测样本的数量，用 1×检测缓冲液按 1：100 稀释浓缩的检 测抗体。 注意：请在 30 分钟内使用稀释后的检测抗体。

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素
稀释前充分混匀。 根据标准品和待测样本的数量，用 1×检测缓冲液按 1：100 稀释浓缩的辣根过氧化物酶标记的 链霉亲和素。 注意：请在 30 分钟内使用稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

样本稀释
如果样本需要稀释，请用试剂盒提供的 1×检测缓冲液稀释血清/血浆样本，用细胞培养基稀释 细胞培养上清。
人IL-17AF标准品
用蒸馏水或去离子水重溶人IL-17AF标准品，重溶体积标注在人IL-17AF标准品的标签上。轻柔 地涡旋震荡，确保充分混匀，重溶后标准品的浓度为4000 pg/ml。重溶后静置 10 - 30 分钟。稀释 前充分混匀。 请使用聚丙烯管进行标准品稀释。

标准曲线制作血清/血浆样本标准曲线的制作：
取 250 μl 浓缩的人IL-17AF标准品，加入 250 μl 标准品稀释液，作为标准曲线的最高浓度 (2000 pg/ml)。在每一个试管中加入 250 μl 标准品稀释液。使用高浓度标准品做 1：1 系列稀释。每次移 液时，请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。

细胞培养上清样本标准曲线的制作：
取 250 μl 浓缩的人IL-17AF标准品，加入 250 μl 细胞培养基，作为标准曲线的最高浓度 (2000 pg/ml)。在每一个试管中加入 250 μl 细胞培养基。使用高浓度标准品做 1：1 系列稀释。每次移液 时，确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零
【检测步骤】
检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温。
1. 准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。
2.将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封好封口。
3.加入300 μl1×洗液静置浸泡30秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。
4.复孔加入100 μl2倍倍比稀释的标准品。空白孔复孔加入100 μl标准品稀释液。
5. 样本孔加入50 μl1×检测缓冲液和50 μl样本。
6. 每孔加入50 μl稀释的检测抗体。保证步骤4、5、6连续加样，不要间断。加样过程在15分钟内完成。
7. 使用封板膜封板。300转/分钟振荡，室温孵育2小时。
8.弃掉液体，每孔加入300 μl洗液洗板，洗涤6次。每次洗板，在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能，必须彻底移除残留液体。
9.每孔加入100 μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
10. 使用新的封板膜封板。300转/分钟振荡，室温孵育45分钟。
11. 重复步骤8。
12. 每孔加入100 μl显色底物TMB，避光，室温孵育5 -30分钟。
13. 每孔加入100 μl终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。
14. 在30分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和570 nm或630 nm参考波长下的OD值。校准后的OD值为450 nm的测定值减去570 nm或630 nm的测定值。仅使用450 nm测定会导致OD值偏高，并且准确度降低。
【结果计算】
计算标准品和样本的平均OD值，然后减去零浓度标准品的OD值。
以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线。回归分析确定最佳拟合曲线。通过对浓度值和OD值取对数拟合，可以对标准曲线进行线性化。此过程可能可以得到更多样本的浓度，但数据的准确度会降低一些。
注意：标准曲线最高浓度点的终浓度为4000 pg/ml。如果完全按照说明书的步骤操作(50 μl样本+ 50μl检测缓冲液)，计算样本浓度时请乘以稀释因子2。
如果样本按照说明书进行了稀释，最终的稀释倍数为2。如果样本进行了其它方式的稀释，计算样本浓度时请乘以相应的稀释倍数。
【检验方法的局限性】
1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。
2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。
4、使用试剂盒配套的样品稀释液。
5、如果样本值高于最高标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。
6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排除该因素。
7、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。

【产品性能指标】
1、物理性能
试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。
2、剂量反应曲线线性
校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。
3、精密度
批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%。
批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%。
4、检测范围
62.50pg/ml→4000pg/ml
5、灵敏度
最低检出剂量小于10.24pg/mL。
6、回收率
三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次回收率评估，回收率在85%-115%之间。
7、特异性
本试剂盒识别天然和重组人IL-17AF，与结构类似物无交叉。
8、稳定性
2℃-8℃保存，有效期6个月。
【注意事项】
生物安全
1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。
2、试剂盒的液体组分中，含有proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。
3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。
技术提示
1、混合蛋白溶液时，避免起泡。
2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。
3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。
4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。
6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
7、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

废物处理
所有使用或未使用的试剂，所有污染性的一次性材料，应当遵循