胰高血糖素样肽1受体激动剂对高糖高脂环境下大鼠心肌细胞损伤的改善作用及其铁死亡机制.pdf

第 49 卷 第 4 期2023年 7 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.4Jul.2023DOI：10.13481/j.1671587X.20230401胰高血糖素样肽 1受体激动剂对高糖高脂环境下大鼠心肌细胞损伤的改善作用及其铁死亡机制孟根托娅1,袁向珍1,解晓江2,成玲3,刘苗1（1.内蒙古医科大学附属医院体检中心，内蒙古 呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学附属医院心血管内科，内蒙古 呼和浩特 010050；3.内蒙古医科大学附属医院医务部，内蒙古 呼和浩特 010050）摘要 目的目的：探讨胰高血糖素样肽 1 受体（GLP-1R）激动剂 Exendin-4（E4）对高糖高脂（HGHL）环境下心肌细胞损伤的影响，阐明其相关机制。方法方法：大鼠心肌 H9C2 细胞分为对照组、HGHL 组、HGHL+E4组和 HGHL+E4+铁死亡激活剂（Erastin）组，H9C2细胞采用 33 mmol L1葡萄糖和 500 mol L1棕榈酸脂诱导 HGHL 模型，HGHL+E4 组和 HGHL+E4+Erastin 组 H9C2 细胞在诱导形成 HGHL细胞模型后分别采用 100 nmol L1 E4和 5 mol L1 Erastin进行处理，CCK-8法检测各组细胞存活率，Hoechst 33258荧光染色法观察各组细胞凋亡情况，流式细胞术检测各组细胞凋亡率，2，7-二氢二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针检测各组细胞中活性氧（ROS）水平，采用相关试剂盒检测各组细胞中谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水 平，JC-1 染 色 法 检 测 各 组细胞中线粒体膜电位（MMP）水平，FerroOrange 荧光探针检测各组细胞中铁离子（Fe2+）水平，Western blotting 法 检 测 各 组 细 胞 中 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 4（GPX4）和 溶 质 载 体 家 族 7 成 员 11（SLC7A11）蛋白表达水平。结果结果：与对照组比较，HGHL 组细胞存活率明显降低（P0.05），细胞出现碎裂和皱缩，呈典型凋亡表现，细胞凋亡率及细胞中 ROS和 MDA 水平明显升高（P0.05），细胞中 GSH 和 MMP 水平明显降低（P0.05），Fe2+水平明显升高（P0.05），GPX4 和 SLC7A11 蛋白表达水平明显降低（P0.05）；与 HGHL 组比较，HGHL+E4 组细胞存活率明显升高（P0.05），凋亡细胞减少，细胞凋亡率及细胞中 ROS和 MDA 水平明显降低（P0.05），细胞中 GSH 和MMP水平明显升高（P0.05），Fe2+水平明显降低（P0.05），GPX4和 SLC7A11蛋白表达水平明显 升 高（P0.05）；与 HGHL+E4 组 比 较，HGHL+E4+Erastin 组 细 胞 存 活 率 明 显 降 低（P0.05），细胞碎裂和皱缩现象明显减轻，细胞凋亡率及细胞中 ROS和 MDA 水平明显升高（P0.05），细胞中 GSH 和 MMP 水平明显降低（P0.05），Fe2+水平明显升高（P0.05），GPX4 和 SLC7A11蛋白表达水平明显降低（P0.05）。结论结论：GLP-1R激动剂能够减轻 HGHL环境下心肌细胞损伤，其保护作用可能与其抑制铁死亡有关。关键词 高糖高脂；心肌细胞；胰高血糖素样肽 1受体激动剂；Exendin-4；铁死亡中图分类号 R587.2 文献标志码 A文章编号 1671587X(2023)04082309收稿日期 20221208基金项目 国家自然科学基金项目（81560045）；内蒙古自治区科技厅自然科学基金项目（2020MS08145）作者简介 孟根托娅（1978），女，内蒙古自治区呼和浩特市人，副主任医师，医学硕士，主要从事心血管疾病基础和临床方面的研究。通信作者 袁向珍，主任医师，硕士研究生导师（E-mail：）823第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）Improvement effect of glucagon-like peptide-1 receptor agonist on injury of cardiomyocytes in rats in hyperglycemia and hyperlipidemia environment and its iron death mechanismMENGGENTUOYA 1,YUAN Xiangzhen1,XIE Xiaojiang2,CHENG Ling3,LIU Miao1（1.Physical Examination Center，Affiliated Hospital，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China；2.Department of Cardiovascular Medicine，Affiliated Hospital，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China；3.Medical Department，Affiliated Hospital，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China）ABSTRACT Objective：To disuss the effect of glucagon like peptide-1 receptor（GLP-1R）agonist Exendin-4（E4）on injury of cardiomyocytes in the hyperglycemia and hyperlipidemia（HGHL）environment，and to clarify its related mechanism.Methods：The H9C2 cardiomyocytes of the rats were divided into control group，HGHL group，HGHL+E4 group，HGHL+E4+iron death agonist（Erastin）group.The HGHL model of the H9C2 cells was induced by 33 mmol L1 glucose and 500 mol L1 palmitate，and the cells in HGHL+E4 group and HGHL+E4+Erastin group were treated with 100 nmolL1 E4 and 5 mol L1 Erastin.CCK-8 assay was used to detect the survival rates of cells in various groups；Hoechst 33258 fluorescence staining was used to observe the apoptosis of cells in various groups；flow cytometry was used to detected the apoptotic rates of cells in various groups；2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCFH-DA）fluorescence probe was used to detect the levels of reactive oxygen species（ROS）in the cells in various groups；the corresponding kit was used to detect the levels of glutathione（GSH）and malondialdehyde（MDA）in cells in various groups；JC-1 staining was used to detect the mitochondrial membrane potential（MMP）in cells in various groups；FerroOrange fluorescence probe was used to detect the levels of Fe2+in the cells in various groups；Western blotting method was used to detect the expression levels of glutathione peroxidase 4（GPX4）and solute carrier family 7 member 11（SLC7A11）in the cells in various groups.Results：Compared with control group，the survival rate of cells in HGHL group was decreased（P0.05），and the cells were fragmented and collapsed，which showed apoptotic morphology；the apoptotic rate and the levels of ROS and MDA in the cells were increased（P0.05），the levels of GSH and MMP were decreased（P0.05），the level of Fe2+was increased（P0.05），and the expression levels of GPX4 and SLC7A11 proteins were decreased（P0.05）.Compared with HGHL group，the survival rate of the cells in HGHL+E4 group was increased（P0.05），and the apoptosis was decreased；the apoptotic rate and the levels of ROS and MDA were decreased（P0.05），while the levels of GSH and MMP were increased（P0.05），the level of Fe2+was decreased（P0.05），and the expression levels of GPX4 and SLC7A11 proteins were decreased（P0.05）.Compared with HGHL+E4 group，the survival rate of the cells in HGHL+E4+Erastin group was decreased（P0.05），the cell fragmentation and wrinkling were obviously decreased，the apoptotic rate and the levels of ROS and MDA were increased（P0.05），the levels of GSH and MMP were decreased（P0.05），the level of Fe2+was increased（P0.05），and the expression levels of GPX4 and SLC7A11 proteins were decreased（P0.05）.Conclusion：GLP-1R agonists can reduce the cardiomyocyte injury in the HGHL environment，and the protective effect may be related to inhibiting the iron death.KEYWORDS High sugar and high fat；Cardiomyocyte；Glucagon like peptide-1 receptor agonist；Exendin-4；Iron death824孟根托娅，等.胰高血糖素样肽 1受体激动剂对高糖高脂环境下大鼠心肌细胞损伤的改善作用随着社会经济的飞速发展，糖尿病发病率和死亡率均呈上升趋势。最新调查结果1显示：全世界约有 5.366亿成年糖尿病患者，约占 2079岁人群的 10.5%，预计至 2045 年糖尿病患者可增加至7.832 亿，现已成为严重威胁人类健康的慢性病之一。多数糖尿病患者存在血脂异常，典型表现包括空腹和餐后血清中甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白 B水平升高，血脂异常现象可导致糖尿病患者患心血管疾病风险增加2。糖尿病诱发的心血管疾病是糖尿病的主要并发症，也是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一3-4。胰 高 血 糖 素 样 肽 1（glucagon like peptide-1，GLP-1）是一种肽类激素，主要由人体内远端肠道中的肠内分泌 L 细胞、胰腺中的 细胞和中枢神经系 统 组 织 分 泌。GLP-1 通 过 与 GLP-1 受 体（glucagon like peptide-1 receptor，GLP-1R）相互作用，以葡萄糖依赖性方式刺激胰岛素分泌并抑制胰高血糖素分泌，从而参与葡萄糖稳态的调节。而GLP-1R 激 动 剂 可 以 与 GLP-1R 结 合，发 挥 与GLP-1 相 同 的 作 用5。目 前，GLP-1R 激 动 剂Exendin-4（E4）已被广泛应用于糖尿病和其他胰岛 素 抵 抗 相 关 疾 病 的 治 疗 中6-7。研 究8表 明：GLP-1R 激动剂 E4 可以改善血管内皮功能，在保护心血管系统方面发挥积极作用。本研究在细胞水平采用高糖高脂（hyperglycemia and hyperlipidemia，HGHL）诱导培养大鼠心肌 H9C2细胞，旨在探讨 GLP-1R 激动剂 E4 对 HGHL 环境下心肌细胞的作用及其相关机制，为揭示糖尿病心血管并发症的病理机制提供理论依据。1 材料与方法 1.1细胞细胞、主要试剂和仪器主要试剂和仪器大鼠心肌 H9C2细胞（中国科学院上海细胞库），青霉素-链霉素双抗液、DMEM 培养基、胎牛血清和胰蛋白酶（美国 Gibco公司），葡 萄 糖 和 棕 榈 酸 脂（美 国 Sigma 公司），E4（上海爱必信生物科技公司），铁死亡激活剂Erastin（美 国 Selleck 公 司），CCK-8 试 剂 盒 和Hoechst 33258 染 色 液（北 京 百 莱 博 科 技 有 限 公司），Annexin-FITC/PI 双染凋亡试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），2，7-二氢二氯荧光素 二 乙 酸 酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）活 性 氧（reactive oxygen species，ROS）荧光探针（北京索莱宝科技有限公司），谷 胱 甘 肽（glutathione，GSH）和 丙 二 醛（malonic dialdehyde，MDA）检测试剂盒（南京建成 生 物 工 程 研 究 所），JC-1 探 针 线 粒 体 膜 电 位（mitoehondrial membrane potential，MMP）检测试剂 盒（武 汉 伊 莱 瑞 特 生 物 科 技 有 限 公 司），FerroOrange荧光探针（日本 Dojindo公司），RIPA裂解液、BCA 蛋白测定试剂盒、PVDF 膜和 ECL化学发光液（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗谷胱甘肽过氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）单克隆抗体、兔抗溶质载体家族 7 成员 11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）单克隆抗体、兔抗 GAPDH 多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG抗体（英国 Abcam 公司）。酶标仪（美国 MD 公司），倒置显微镜、光学显微镜和荧光显微镜（日本 Olympus公司），流式细胞检测仪（美国 Thermo Fisher Scientific公司），蛋白电泳系统（北京六一生物科技有限公司）。1.2细胞分组和处理细胞分组和处理H9C2 细胞接种于含 10%胎牛血清和 1%青霉素-链霉素双抗的 DMEM 培养基中，置于 37、5%CO2培养箱中常规传代培养。取对数生长期 H9C2细胞，待融合至约 80%时，以2105 mL1密度接种于 6孔细胞培养板，实验分为4 组：对照组，H9C2细胞正常培养；HGHL组，H9C2细胞采用含33 mmol L1葡萄糖和500 mol L1棕榈酸酯的 DMEM 培养基孵育 24 h；HGHL+E4 组，H9C2 细 胞 采 用 含 33 mmol L1葡 萄 糖、500 mol L1棕 榈 酸 酯 和 100 nmol L1 E4 的DMEM 培养基孵育 24 h；HGHL+E4+铁死亡激活剂 Erastin（HGHL+E4+Erastin）组，H9C2细胞采用含 33 mmol L1葡萄糖、500 mol L1棕榈酸酯、100 nmol L1 E4 的 DMEM 培养基共孵育24 h，同时加入终浓度 5 mol L1 Erastin处理。处理结束后，收集 4组细胞进行后续实验。1.3CCK-8 法检测各组细胞存活率法检测各组细胞存活率将 H9C2 细胞按照每孔 5103个的密度接种于 96 孔细胞培养板中，进行分组处理后，每孔加 10 L CCK-8 试剂，置于培 养 箱 内 孵 育 2 h，采 用 酶 标 仪 检 测450 nm 波长处吸光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率=（实验组 A 值空白组 A 值）/（对照组 A值空白组 A值）100%。1.4Hoechst 33258荧光染色法检测各组细胞凋亡荧光染色法检测各组细胞凋亡情况情况将处理后的各组细胞进行爬片，加入细胞固定液室温固定 30 min，PBS缓冲液洗涤细胞。加入Hoechst 33258 染液，室温避光静置 10 min，双蒸825第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）水清洗，并用滤纸吸干水分，滴加抗荧光猝灭剂封片，通过荧光显微镜观察细胞染色情况并拍照，活细胞呈均匀蓝染，凋亡细胞内可见致密浓染颗粒。1.5Annexin-FITC/PI双染法检测各组细胞凋双染法检测各组细胞凋亡率亡率收集处理后的各组 H9C2细胞，经胰蛋白酶消化后，1 000 r min1离心 5 min，弃上清，PBS缓冲液洗涤细胞并重悬，1 000 r min1离心 5 min，弃上清后在沉淀中加入 500 L Binding Buffer重悬，依次加入 5 L FITC 标记的 Annexin 和 PI 染液，轻轻混匀，室温避光孵育 10 min 后，在 1 h 内上机检测各组细胞凋亡率。细胞凋亡率早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率。1.6DCFH-DA 荧光探针检测各组细胞中荧光探针检测各组细胞中 ROS 水水平平收集处理后的各组 H9C2 细胞，吸弃培养液，PBS 缓 冲 液 洗 涤 细 胞，采 用 PBS 缓 冲 液 稀 释DCFH-DA 试剂液，在各组细胞中加入10 mol L1 DCFH-DA 工作液，在 37、5%CO2培养箱中孵育 30 min，弃原液，PBS 缓冲液洗涤细胞并重悬，荧光显微镜观察细胞荧光强度并拍照，采用Image J软件分析平均荧光强度，以荧光强度表示细胞中ROS水平。1.7采用试剂盒检测各组细胞中采用试剂盒检测各组细胞中 GSH 和和 MDA 水水平平收集处理后的各组 H9C2细胞，PBS 缓冲液洗涤细胞，1 000 r min1离心 5 min，收集细胞沉淀，再加入 PBS 缓冲液重悬，通过超声裂解细胞，参照 GSH 和 MDA测定试剂盒说明书进行操作，计算细胞中 GSH 和 MDA水平。1.8JC-1 染色法检测各组细胞中染色法检测各组细胞中 MMP 水平水平处理后的各组 H9C2细胞经 PBS缓冲液洗涤，按每孔1104个细胞的密度接种于 24孔细胞培养板中，置于 37、5%CO2培养箱中孵育 24 h 后弃原液，加入 JC-1 荧光染 料 工 作 液 100 L 和 细 胞 培 养 液100 L，轻轻混匀，在培养箱中避光孵育 20 min，JC-1 缓冲液洗涤细胞，1 000 r min1离心 5 min 后弃上清液，加入培养液重悬细胞，通过荧光显微镜观察细胞染色情况并拍照，采用荧光酶标仪进行分析，绿色 荧 光（激 发 波 长 485 nm，发 射 波 长535 nm）代表凋亡或坏死细胞，红色荧光（激发波长 550 nm，发射波长 600 nm）代表正常细胞，以红色荧光信号强度与绿色荧光信号强度的比值表示MMP水平。1.9FerroOrange 荧光探针检测各组细胞中铁离荧光探针检测各组细胞中铁离子子（Fe2+）水平水平将处理后的各组 H9C2 细胞用无血清培养基清洗，加入 1 mol L1 FerroOrange 工作液 500 L，置 于 37 、5%CO2培 养 箱 中 孵 育30 min，采用荧光显微镜观察细胞中荧光表达，采用 Image J 软件分析平均荧光强度，以荧光强度表示细胞中 Fe2+水平。1.10Western blotting 法检测各组细胞中法检测各组细胞中 GPX4和和 SLC7A11 蛋白表达水平蛋白表达水平收集处理后的各组H9C2 细胞并加入 RIPA 裂解，提取细胞总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。在蛋白样品中加入上样缓冲液，100 金属浴煮变性。取等量总蛋白样品上样至凝胶孔，通过 SDS-PAGE 电泳分离，并转移至 PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，TBST漂洗，加入 GPX4、SLC7A11和 GAPDH 抗体，置于 4 摇床孵育过夜。TBST 漂洗，加入对应二抗，室温孵育 1 h。TBST 再次漂洗后，ECL 化学发光法使 PVDF 膜显影，曝光，采用 Image J 软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。1.11统计学分析统计学分析采用 SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，采用 Graphpad 8.3.0 软件绘制统计图。各组 H9C2细胞存活率和凋亡率，各组细胞中ROS、MDA、GSH、MMP 和 Fe2+水平，各组细胞中 GPX4 和 SLC7A11 蛋白表达水平，均符合正态分布，以 xs 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以 P0.05为差异有统计学意义。2 结 果 2.1各组细胞存活率各组细胞存活率与对照组比较，HGHL 组细胞存活率明显降低（P0.05）；与 HGHL 组比较，HGHL+E4 组 细 胞 存 活 率 明 显 升 高（P0.05）；与 HGHL+E4 组 比 较，HGHL+E4+Erastin 组 细 胞 存 活 率 明 显 降 低（P0.05）。见图 1。2.2各组细胞凋亡情况各组细胞凋亡情况Hoechst 33258 染色后观察，对照组细胞结构完整，染色均匀；HGHL 组部分细胞出现碎裂和皱缩，细胞核染为致密亮蓝色，呈 典 型 凋 亡 表 现；与 HGHL 组 比 较，HGHL+E4 组细胞染色较为均匀，有少量细胞碎裂且细胞核呈致密亮蓝色；与 HGHL+E4组比较，HGHL+E4+Erastin 组 碎 裂 和 皱 缩 细 胞 数 增 加，可见较多细胞核呈致密亮蓝色，细胞受损明显。见图 2。826孟根托娅，等.胰高血糖素样肽 1受体激动剂对高糖高脂环境下大鼠心肌细胞损伤的改善作用2.3 各 组 细 胞 凋 亡 率各 组 细 胞 凋 亡 率 与 对 照 组（8.63%0.89%）比较，HGHL 组细胞凋亡率（50.00%5.17%）明显升高（P0.05）；与 HGHL 组比较，HGHL+E4 组细胞凋亡率（10.19%1.15%）明显 降 低（P0.05）；与 HGHL+E4 组 比 较，HGHL+E4+Erastin 组 细 胞 凋 亡 率（47.60%4.89%）明显升高（P0.05）。见图 3。2.4各组细胞中各组细胞中 ROS 水平水平与对照组（8.580.78）比较，HGHL 组细胞中 ROS 水平（38.503.55）明显升高（P0.05）；与 HGHL 组比较，HGHL+E4 组 细 胞 中 ROS 水 平（10.201.02）明 显 降 低（P0.05）；与 HGHL+E4 组 比 较，HGHL+E4+Erastin组细胞中 ROS水平（35.853.24）明显升高（P0.05）。见图 4。2.5各组细胞中各组细胞中 GSH 和和 MDA 水平水平与对照组比较，HGHL 组 细 胞 中 GSH 水 平 明 显 降 低（P0.05），MDA 水 平 明 显 升 高（P0.05）；与HGHL 组比较，HGHL+E4 组细胞中 GSH 水平明A：Control group；B：HGHL group；C：HGHL+E4 group；D：HGHL+E4+Erastin group.图图 2各组细胞凋亡形态表现各组细胞凋亡形态表现（Hoechst 33258，100）Fig.2Apoptotic morphology of cells in various groups(Hoechst 33258,100)*P0.05 compared with control group；P0.05 compared with HGHL group；#P0.05 compared with HGHL+E4 group.图图 1各组细胞存活率各组细胞存活率Fig.1Survival rates of cells in various groupsA：Control group；B：HGHL group；C：HGHL+E4 group；D：HGHL+E4+Erastin group.图图 3流式细胞术检测各组细胞凋亡率流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig.3Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry827第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）显 升 高（P0.05），MDA 水 平 明 显 降 低（P0.05）；与 HGHL+E4 组 比 较，HGHL+E4+Erastin 组细胞中 GSH 水平明显降低（P0.05），MDA水平明显升高（P0.05）。见表 1。2.6各组细胞中各组细胞中 MMP 水平水平与对照组（12.851.17）比较，HGHL 组细胞中 MMP 水平（2.500.21）明显降低（P0.05）；与 HGHL 组比较，HGHL+E4 组 细 胞 中 MMP 水 平（11.581.03）明 显 升 高（P0.05）；与 HGHL+E4 组 比 较，HGHL+E4+Erastin 组细胞中 MMP 水平（2.990.25）明显降低（P0.05）。见图 5。A：Control group；B：HGHL group；C：HGHL+E4 group；D：HGHL+E4+Erastin group.图图 4DCFH-DA荧光探针染色检测各组细胞中荧光探针染色检测各组细胞中 ROS水平水平（100）Fig.4ROS levels in cells in various groups detected by DCFH-DA fluorescence probe staining(100)表表 1各组细胞中各组细胞中 GSH 和和 MDA水平水平TabTab.1 1 Levels of GSH and MDA in cells in various groupsLevels of GSH and MDA in cells in various groups n=6，xs,mB/（molg1）GroupControlHGHLHGHL+E4HGHL+E4+ErastinGSH30.632.6414.281.20*26.792.2515.231.27#MDA1.420.113.790.32*1.550.123.200.27#*P0.05 compared with control group；P0.05 compared with HGHL group；#P0.05 compared with HGHL+E4 group.图图 5JC-1染色法检测各组细胞中染色法检测各组细胞中 MMP水平水平（200）Fig.5MMP levels in cells in various groups detected by JC-1 staining(200)828孟根托娅，等.胰高血糖素样肽 1受体激动剂对高糖高脂环境下大鼠心肌细胞损伤的改善作用2.7 各 组 细 胞 中各 组 细 胞 中 Fe2+水 平水 平 与 对 照 组 比 较，HGHL组细胞中红色荧光强度明显增强，Fe2+水平明 显 升 高（P0.05）；与HGHL组 比 较，HGHL+E4 组 细 胞 中 红 色 荧 光 强 度 明 显 减 弱，Fe2+水平明显降低（P0.05）；与 HGHL+E4 组比较，HGHL+E4+Erastin 组细胞中红色荧光强度明显 增 强，Fe2+水 平 明 显 升 高（P0.05）。见图 6和 7。2.8各组细胞中各组细胞中 GPX4 和和 SLC7A11 蛋白表达水蛋白表达水平平 与 对 照 组 比 较，HGHL 组 细 胞 中 GPX4 和SLC7A11 蛋白表达水平明显降低（P0.05）；与HGHL 组 比 较，HGHL+E4 组 细 胞 中 GPX4 和SLC7A11 蛋白表达水平明显升高（P0.05）；与HGHL+E4 组比较，HGHL+E4+Erastin 组细胞中 GPX4和 SLC7A11蛋白表达水平明显降低（P0.05）。见图 8和表 2。3 讨 论 目前，GLP-1R 激动剂作为一种新型的降糖药物，不仅能有效降糖，还能发挥减轻体质量、降压、降脂和组织保护作用。E4 是 GLP-1R 天然激动剂，通过与 GLP-1R 结合并激活下游信号通路发挥 其 抗 糖 尿 病 功 能。与 GLP-1R 的 内 源 性 配 体GLP-1比较 E4半衰期更长，因此 E4对促进葡萄糖依赖性胰岛素分泌具有更有效和更持久的作用9。除了治疗糖尿病外，E4 还可应用于糖尿病并发症和一些其他类型疾病的治疗。E4 通过促进脑部胰A：Control group；B：HGHL group；C：HGHL+E4 group；D：HGHL+E4+Erastin group.图图 6各组细胞各组细胞 FerroOrange荧光探针染色结果荧光探针染色结果（100）Fig.6FerroOrange fluorescence probe staining results of cells in various groups（100）*P0.05 compared with control group；P0.05 compared with HGHL group；#P0.05 compared with HGHL+E4 group.图图 7各组细胞中各组细胞中 Fe2+水平水平Fig.7Fe2+levels in cells in various groupsLane 1：Control group；Lane 2：HGHL group；Lane 3：HGHL+E4 group；Lane 4：HGHL+E4+Erastin group.图图 8各组细胞中各组细胞中 GPX4和和 SLC7A11蛋白表达电泳图蛋白表达电泳图Fig.8Electrophoregram of expressions of GPX4 and SLC7A11 proteins in cells in various groups表表 2各组细胞中各组细胞中 GPX4和和 SLC7A11蛋白表达水平蛋白表达水平TabTab.2 2ExpresExpression levels of GPXsion levels of GPX4 4 and SLC and SLC7 7A A1111 protei proteins ns in cells in various groups in cells in various groups (n=6，xs)GroupControlHGHLHGHL+E4HGHL+E4+ErastinGPX41.640.150.410.03*1.610.140.440.05#SLC7A111.590.120.390.02*1.550.120.370.02#*P0.05 compared with control group；P0.05 compared with HGHL group；#P0.05 compared with HGHL+E4 group.829第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）岛素合成，激活脑胰岛素信号传导和缓解 tau 蛋白过 度 磷 酸 化，进 而 改 善 db/db 小 鼠 认 知 功 能 障碍10；E4 通 过 酪 氨 酸 激 酶 Src/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，Akt）信号通路诱导成骨细胞中的连接蛋白 43（connexin 43，Cx43）表达，从而促进成骨细胞分化11；E4 通过减少自发性和突发性起搏诱导的室性心律失常中的肌质网钙泄漏来发挥抗心律失常作用，可能与其降低 ryanodine受体 2（ryanodine receptor 2，RyR2）磷酸化和抑制钙调素 依 赖 型 蛋 白 激 酶 （calmodulin-dependent protein kinase，CaMK-）活性有关12；E4 能够 降 低 氧 化 应 激 反 应，抑 制 Jun 氨 基 末 端 激 酶（Jun N-terminal kinase，JNK）/p66 Shc 激 活 并 下调 还 原 型 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），防止心肌缺血/再灌注损伤13。本研究结果显示：在 HGHL环境下培养的 H9C2细胞形态发生明显改变，出现受损和凋亡现象，细胞存活率降低，细胞凋亡率升高；在 HGHL 环境下培养H9C2细胞的同时加入 E4处理，细胞形态受损得到明显改善，同时细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，说明 GLP-1R 激动剂 E4 可改善 HGHL 环境下H9C2细胞损伤，减少细胞凋亡。铁死亡是一种铁依赖性细胞死亡模式，其特征为脂质过氧化物过量累积，引起细胞 MMP 水平降低、Fe2+水平升高和胱氨酸/谷氨酸逆转运体受抑制等，影响细胞生物学功能，导致细胞膜氧化损伤14。铁死亡与多种病理过程有密切关联，参与肾损伤、肝损伤、肺损伤、癌症和神经系统疾病的发生发展过程15-18。此外，铁死亡及其调控机制在多种心血管疾病中发挥重要的作用。FANG 等19发现：在多柔比星诱导的心肌病小鼠模型中，过量游离的 Fe2+积聚在心肌细胞线粒体中并导致其膜上脂质过氧化，使用铁死亡抑制剂 ferrostatin-1 和铁螯合剂右雷唑烷可抑制线粒体氧化损伤，明显改善小鼠心肌损伤并降低其死亡率。LI 等20研究表明：铁血病与糖