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代谢控制发酵Chapter 5 Chapter 5 代代代代谢谢谢谢控制控制控制控制发发发发酵的酵的酵的酵的基本思想基本思想基本思想基本思想 （微生物代（微生物代（微生物代（微生物代谢谢谢谢的人工控制）的人工控制）的人工控制）的人工控制）1.微微生生物物在在正正常常情情况况下下，通通过过细细胞胞内内自自我我调调节节，维维持持各各个个代代谢谢途途径径的的相相互互协协调调，使使其其代代谢谢产产物物既既不不少少又又不不会会过过多多的的积积累累，而而人人类类利利用用微微生生物物进进行行发发酵酵则则需需要要微微生生物物积积累累较较多多的的代代谢谢产产物物，为为此此对对微生物的代微生物的代谢谢必必须进须进行人工控制行人工控制 。人人工工控控制制微微生生物物代代谢谢的的方方法法主主要要有有两两种：种：一、改一、改变变微生物的微生物的遗传遗传特征特征二、控制二、控制发发酵条件酵条件2.第一第一节节 微生物生物合成途径的微生物生物合成途径的遗传遗传控制控制3.图图图图3-13-1谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌鸟鸟鸟鸟氨酸生物合成途氨酸生物合成途氨酸生物合成途氨酸生物合成途径径径径乙乙酰酰谷氨酸合成谷氨酸合成酶酶乙乙酰酰谷氨酸激谷氨酸激酶酶 NONO乙乙酰酰谷氨酸谷氨酸醛醛脱脱氢氢酶酶乙乙酰鸟酰鸟氨酸氨酸转转氨氨酶酶NONO乙乙酰酰谷氨酸谷氨酸OO乙乙酰鸟酰鸟氨酸乙氨酸乙酰酰基基转转移移酶酶鸟鸟氨酸氨甲氨酸氨甲酰酰基基转转移移酶酶精氨琥珀酸合成精氨琥珀酸合成酶酶精氨琥珀酸精氨琥珀酸酶酶4.Arg对对N-乙乙酰酰谷谷氨氨酸酸合合成成酶酶和和N-乙乙酰酰谷谷氨氨酸酸激激酶酶有有反反馈馈调调节节作作用用。当当选选育育瓜瓜氨氨酸酸缺缺陷陷突突变变株株 （Cit-），亚亚适适量量添添加加瓜瓜氨氨酸酸（Cit ），就就会会积积累累大大量的量的鸟鸟氨酸氨酸。5.2、分支途径、分支途径（1）6.7.8.9.例如：谷氨酸棒杆菌例如：谷氨酸棒杆菌例如：谷氨酸棒杆菌例如：谷氨酸棒杆菌 、产产产产氨短杆菌、黄色短杆菌的氨短杆菌、黄色短杆菌的氨短杆菌、黄色短杆菌的氨短杆菌、黄色短杆菌的选选选选育高育高育高育高丝丝丝丝氨酸脱氨酸脱氨酸脱氨酸脱氢氢氢氢酶酶酶酶缺陷型（缺陷型（缺陷型（缺陷型（homhom-）来）来）来）来积积积积累大量累大量累大量累大量LysLys。10.二、二、选选育抗反育抗反馈调节馈调节突突变变株株 所所谓谓抗反抗反馈调节馈调节突突变变株就是已解除了株就是已解除了反反馈调节馈调节作用的突作用的突变变株株。在。在这这些突些突变变株中，株中，因因为为反反馈馈抑制或阻遏，或两者引起的自抑制或阻遏，或两者引起的自动动调节调节作用已被削弱或解除，所以能合成作用已被削弱或解除，所以能合成较较多的最多的最终产终产物。物。11.（一）（一）选选育抗代育抗代谢类谢类似物的突似物的突变变株株（Analogue Resistance Mutant）通常微生物生通常微生物生通常微生物生通常微生物生长长长长需要各种代需要各种代需要各种代需要各种代谢谢谢谢物。如物。如物。如物。如维维维维生生生生素、素、素、素、嘌嘌嘌嘌呤、氨基酸等。在正常情况下，代呤、氨基酸等。在正常情况下，代呤、氨基酸等。在正常情况下，代呤、氨基酸等。在正常情况下，代谢谢谢谢终产终产终产终产物如氨基酸物如氨基酸物如氨基酸物如氨基酸A A过过过过量存在量存在量存在量存在时时时时，就会抑制或阻，就会抑制或阻，就会抑制或阻，就会抑制或阻遏它自身生物合成遏它自身生物合成遏它自身生物合成遏它自身生物合成酶酶酶酶。同。同。同。同时时时时也能整合到蛋白也能整合到蛋白也能整合到蛋白也能整合到蛋白质质质质中去。只有当氨基酸中去。只有当氨基酸中去。只有当氨基酸中去。只有当氨基酸A A 浓浓浓浓度足度足度足度足够够够够高高高高时时时时，A A与与与与调节调节调节调节酶酶酶酶的的的的调节调节调节调节部位或部位或部位或部位或调节调节调节调节基因基因基因基因编码编码编码编码的阻遏蛋的阻遏蛋的阻遏蛋的阻遏蛋白白白白结结结结合，合，合，合，产产产产生反生反生反生反馈馈馈馈抑制或阻遏作用。当抑制或阻遏作用。当抑制或阻遏作用。当抑制或阻遏作用。当细细细细胞胞胞胞中的中的中的中的A A参与蛋白参与蛋白参与蛋白参与蛋白质质质质合成，而使合成，而使合成，而使合成，而使细细细细胞中胞中胞中胞中A A的的的的浓浓浓浓度度度度下降到一定程度下降到一定程度下降到一定程度下降到一定程度时时时时，A A就会从就会从就会从就会从调节调节调节调节酶酶酶酶的的的的调节调节调节调节部部部部位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反馈调馈调馈调馈调节节节节，又重新可以合成新的，又重新可以合成新的，又重新可以合成新的，又重新可以合成新的A A。当。当。当。当A A的的的的浓浓浓浓度再次度再次度再次度再次上升到一定上升到一定上升到一定上升到一定值时值时值时值时，反，反，反，反馈调节馈调节馈调节馈调节再次再次再次再次发发发发生生生生.。12.我我我我们们们们说说说说代代代代谢谢谢谢物物物物和和和和调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的变变变变构构构构部部部部位位位位或或或或阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的结结结结合合合合是是是是可可可可逆逆逆逆的的的的。而而而而代代代代谢谢谢谢类类类类似似似似物物物物，结结结结构构构构类类类类似似似似物物物物，即即即即A A则则则则不不不不同同同同，在在在在培培培培养养养养基基基基中中中中添添添添加加加加A A其其其其空空空空间间间间结结结结构构构构与与与与A A相相相相似似似似。当当当当细细细细胞胞胞胞中中中中大大大大量量量量存存存存在在在在A A时时时时，它它它它也也也也能能能能和和和和A A一一一一样样样样与与与与调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的调调调调节节节节部部部部位位位位或或或或调调调调节节节节基基基基因因因因编编编编码码码码的的的的阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白结结结结合合合合，发发发发生生生生反反反反馈馈馈馈抑抑抑抑制制制制与与与与阻阻阻阻遏遏遏遏作作作作用用用用。由由由由于于于于A A不不不不能能能能整整整整合合合合到到到到蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子中中中中去去去去，细细细细胞胞胞胞中中中中的的的的AA浓浓浓浓度度度度不不不不会会会会自自自自行行行行下下下下降降降降。只只只只要要要要AA结结结结合合合合到到到到调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的调调调调节节节节部部部部位位位位或或或或阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白上上上上就就就就不不不不能能能能脱脱脱脱落落落落下下下下来来来来，这这这这种种种种结结结结合合合合是是是是不不不不可可可可逆逆逆逆的的的的。这这这这样样样样也也也也就就就就没没没没有有有有A A的的的的生生生生物物物物合合合合成成成成，氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸缺缺缺缺乏乏乏乏的的的的细细细细胞胞胞胞会会会会因因因因饥饥饥饥饿饿饿饿而而而而死死死死亡亡亡亡。因因因因此此此此代代代代谢谢谢谢结结结结构构构构类类类类似似似似物物物物对对对对微微微微生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞来来来来说说说说是是是是有有有有毒毒毒毒的的的的，只只只只要要要要有有有有结结结结构构构构类类类类似物存在，菌种不会存活。似物存在，菌种不会存活。似物存在，菌种不会存活。似物存在，菌种不会存活。13.若若若若我我我我们们们们通通通通过过过过诱诱诱诱导导导导等等等等手手手手段段段段获获获获得得得得突突突突变变变变株株株株，已已已已解解解解除除除除了了了了终终终终产产产产物物物物对对对对酶酶酶酶的的的的反反反反馈馈馈馈调调调调节节节节，也也也也就就就就是是是是说说说说终终终终产产产产物物物物 A A不不不不再再再再与与与与调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的调调调调节节节节部部部部位位位位或或或或阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白结结结结合合合合。那那那那么么么么A A的的的的结结结结构构构构类类类类似似似似物物物物A A也也也也同同同同样样样样不不不不再再再再与与与与调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的调调调调节节节节部部部部位位位位或或或或胞胞胞胞质质质质阻阻阻阻遏遏遏遏蛋蛋蛋蛋白白白白结结结结合合合合，也也也也就就就就是是是是A A对对对对菌菌菌菌株株株株的的的的毒毒毒毒害害害害作作作作用用用用表表表表现现现现不不不不出出出出来来来来，我我我我们们们们就就就就说说说说该该该该菌菌菌菌株株株株对对对对A A有有有有抗抗抗抗性性性性。（resistanceresistance）我我我我们们们们常常常常常常常常将将将将经经经经过过过过各各各各种种种种手手手手段段段段诱诱诱诱变变变变的的的的突突突突变变变变株株株株放放放放到到到到含含含含有有有有终终终终产产产产物物物物结结结结构构构构类类类类似似似似物物物物A A的的的的培培培培养养养养基基基基上上上上，挑挑挑挑出出出出长长长长出出出出来来来来的的的的抗抗抗抗性性性性菌菌菌菌株株株株。若若若若突突突突变变变变株株株株抗抗抗抗A A性性性性能能能能越越越越强强强强（在在在在含含含含高高高高浓浓浓浓度度度度A A上上上上长长长长出出出出来来来来），则则则则说说说说明明明明该该该该菌菌菌菌株株株株解解解解除除除除A A对对对对其其其其生生生生物物物物合合合合成成成成系系系系统统统统的的的的反反反反馈馈馈馈调调调调节节节节就就就就越越越越彻彻彻彻底底底底，那那那那么么么么A A积积积积累累累累就就就就越多。越多。越多。越多。14.根根据据上上述述原原理理，只只要要选选取取结结构构类类似似物物抗抗性性突突变变株株，就就有有可可能能得得到到解解除除反反馈馈抑抑制制或或阻阻遏遏的的突突变变株株。在在这这个个意意义义上上结结构构类类似似物物抗抗性性可可以以作作为为解解除除反反馈馈调调节节菌菌株株的的“筛筛子子”。除了氨基酸外除了氨基酸外还还有有嘌嘌呤、呤、嘧啶嘧啶、维维生素等的生素等的结结构构类类似物。通似物。通过选过选育育这这些些结结构构类类似物菌株似物菌株，已，已获获得氨基酸、核苷酸、得氨基酸、核苷酸、核苷、核苷、维维生素等各种代生素等各种代谢产谢产物的高物的高产产菌菌株。株。15.（二）从（二）从营营养缺陷型回复突养缺陷型回复突变变株中株中获获得得对对途径中途径中调节调节酶酶解除反解除反馈馈抑制的突抑制的突变变株株 调调节节酶酶的的变变构构特特性性是是由由它它的的结结构构基基因因决决定定的的，若若调调节节酶酶因因编编码码它它的的基基因因发发生生突突变变而失活，而失活，则则有两种可能：有两种可能：1、是是编编码码为为催催化化亚亚基基与与调调节节亚亚基基的的基基因因发发生了生了变变化。化。2、仅仅仅仅是是编编码码催催化化亚亚基基（或或活活性性部部位位）的的基因基因发发生生变变化。化。16.若若若若通通通通过过过过再再再再次次次次突突突突变变变变，使使使使调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的活活活活性性性性恢恢恢恢复复复复，这这这这时时时时又有两种可能：又有两种可能：又有两种可能：又有两种可能：一一一一是是是是催催催催化化化化亚亚亚亚基基基基和和和和调调调调节节节节亚亚亚亚基基基基恢恢恢恢复复复复（或或或或大大大大体体体体恢恢恢恢复复复复）到到到到第第第第一一一一次次次次突突突突变变变变前前前前那那那那样样样样的的的的状状状状态态态态。另另另另一一一一种种种种是是是是催催催催化化化化亚亚亚亚基基基基得得得得到到到到恢恢恢恢复复复复，而而而而调调调调节节节节亚亚亚亚基基基基却却却却丧丧丧丧失失失失了了了了调调调调节节节节作作作作用用用用，这这这这情情情情况况况况实实实实质质质质上上上上是是是是编编编编码码码码调调调调节节节节亚亚亚亚基基基基的的的的DNADNA突突突突变变变变，解解解解除了反除了反除了反除了反馈馈馈馈抑制作用。抑制作用。抑制作用。抑制作用。调调调调节节节节酶酶酶酶的的的的失失失失活活活活与与与与否否否否，可可可可能能能能直直直直接接接接表表表表现现现现为为为为某某某某种种种种营营营营养养养养缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型。可可可可以以以以采采采采用用用用营营营营养养养养缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型的的的的回回回回复复复复突突突突变变变变的的的的方方方方法法法法，从从从从营营营营养养养养缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型回回回回复复复复突突突突变变变变株株株株中中中中获获获获得得得得对对对对途途途途径径径径中中中中的的的的调节调节调节调节酶酶酶酶解除反解除反解除反解除反馈调节馈调节馈调节馈调节的的的的调节调节调节调节突突突突变变变变株。株。株。株。17.三、三、产产物降解物降解酶酶缺失突缺失突变变株株 为为了使了使产产物在物在发发酵液中酵液中稳稳定地存在，定地存在，以提高以提高发发酵酵单单位，可通位，可通过诱变获过诱变获得缺乏降得缺乏降解解产产物物酶酶的突的突变变株，其方法是株，其方法是诱变处诱变处理后，理后，如如图图所示：所示：18.19.四、增加前体物的合成四、增加前体物的合成 通通过选过选育某些育某些营营养缺陷型或养缺陷型或结结构构类类似似物抗性突物抗性突变变株以及克隆某些关株以及克隆某些关键键酶酶的方法，的方法，增加目的增加目的产产物的前体合成，有利于目的物的前体合成，有利于目的产产物的大量物的大量积积累。累。20.21.五、五、细细胞膜胞膜组组分缺失突分缺失突变变株株 22.23.第二第二节节 生物生物发发酵条件的控制（外因）酵条件的控制（外因）当菌株当菌株选选育确定后，育确定后，环环境条件合适与境条件合适与否是否是发发酵成酵成败败的重要因素。的重要因素。环环境条件既影境条件既影响微生物生响微生物生长长，又影响代，又影响代谢谢速度和方向及速度和方向及产产物形成与物形成与积积累。累。现现以谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamic acidcorynebacterium glutamic acid）发发酵酵为为例来例来说说明控制明控制发发酵条件包括酵条件包括O O2 2浓浓度、度、NHNH4 4浓浓度度 、pHpH、磷酸、磷酸盐浓盐浓度、生物素度、生物素浓浓度度等，等，环环境条件改境条件改变变，可使代，可使代谢转换谢转换方向，方向，不生成不生成GluGlu，而生成乳酸、，而生成乳酸、a-KGAa-KGA、琥珀酸、琥珀酸、谷谷酰酰胺等胺等产产物。物。24.表表3 3-1 1 环环境境因因素素对对G Gl lu u产产生生菌菌发发酵酵的的影影响响 25.26.第三第三节节 代代谢谢控制控制发发酵酵实实例例27.一、丙一、丙酮酮酸的代酸的代谢谢控制控制发发酵酵（一）丙（一）丙（一）丙（一）丙酮酮酮酮酸用途及生酸用途及生酸用途及生酸用途及生产产产产状况状况状况状况 丙丙丙丙酮酮酮酮酸（酸（酸（酸（pyruvic acidpyruvic acidpyruvic acidpyruvic acid）又称）又称）又称）又称a-a-a-a-氧代丙酸，氧代丙酸，氧代丙酸，氧代丙酸，a-a-a-a-酮酮酮酮基丙酸或乙基丙酸或乙基丙酸或乙基丙酸或乙酰酰酰酰基甲酸，基甲酸，基甲酸，基甲酸，为为为为无色至淡黄色无色至淡黄色无色至淡黄色无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的a-a-a-a-氧代氧代氧代氧代羟羟羟羟酸之一。丙酸之一。丙酸之一。丙酸之一。丙酮酮酮酮酸不酸不酸不酸不仅仅仅仅在生物能量代在生物能量代在生物能量代在生物能量代谢谢谢谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用中具有十分重要的作用，而且是多种有用中具有十分重要的作用，而且是多种有用中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体。例如：治化合物的前体。例如：治化合物的前体。例如：治化合物的前体。例如：治疗疗疗疗帕金森病的正多帕金森病的正多帕金森病的正多帕金森病的正多巴和巴和巴和巴和L-L-L-L-半脱半脱半脱半脱氢氢氢氢酸酸酸酸L-LeuL-LeuL-LeuL-Leu、B B B B6 6 6 6和和和和B B B B12121212的前体，也是的前体，也是的前体，也是的前体，也是合成合成合成合成氢氢氢氢化阿托酸，谷物保化阿托酸，谷物保化阿托酸，谷物保化阿托酸，谷物保护剂护剂护剂护剂等多种等多种等多种等多种农药农药农药农药的的的的前体，因此在化工、制前体，因此在化工、制前体，因此在化工、制前体，因此在化工、制药药药药和和和和农农农农用化学品等工用化学品等工用化学品等工用化学品等工业业业业及科学研究中有广泛用途。及科学研究中有广泛用途。及科学研究中有广泛用途。及科学研究中有广泛用途。28.作作作作为为为为一一一一种种种种化化化化工工工工产产产产品品品品，丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸早早早早已已已已实实实实现现现现工工工工业业业业化化化化生生生生产产产产，但但但但是是是是直直直直到到到到20202020世世世世纪纪纪纪90909090年年年年代代代代工工工工业业业业上上上上生生生生产产产产 丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸还还还还沿沿沿沿用用用用Howard Howard Howard Howard FraeerFraeerFraeerFraeer（1932193219321932）开开开开发发发发的的的的酒酒酒酒石石石石酸酸酸酸脱脱脱脱水水水水脱脱脱脱羟羟羟羟法法法法，没没没没有有有有多多多多大大大大改改改改进进进进，此此此此法法法法是是是是将将将将酒酒酒酒石石石石酸酸酸酸+硫硫硫硫酸酸酸酸氢氢氢氢钾钾钾钾混混混混合合合合在在在在220220220220下下下下蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏，馏馏馏馏出出出出物物物物再再再再经经经经真真真真空空空空精精精精馏馏馏馏即即即即可可可可得得得得丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸，工工工工艺艺艺艺简简简简单单单单易易易易行行行行。其其其其主主主主要要要要缺缺缺缺点点点点（1 1 1 1）丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸产产产产率率率率较较较较低低低低（为为为为酒酒酒酒石石石石酒酒酒酒量量量量的的的的2929292930%30%30%30%）。（2 2 2 2）得得得得到到到到1g1g1g1g丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸需需需需消消消消耗耗耗耗5g5g5g5g硫硫硫硫酸酸酸酸氢氢氢氢钾钾钾钾，以以以以目目目目前前前前(酒酒酒酒石石石石酸酸酸酸1.51.51.51.5万万万万元元元元/吨吨吨吨,硫硫硫硫酸酸酸酸氢氢氢氢钾钾钾钾0.60.60.60.6万万万万元元元元/吨吨吨吨)市市市市场场场场价价价价计计计计算算算算,仅仅仅仅原原原原料料料料成成成成本本本本至至至至少少少少需需需需8 8 8 8万万万万元元元元/吨吨吨吨,为为为为此此此此在在在在很很很很长长长长一一一一段段段段时时时时间间间间内内内内,丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸的的的的价价价价格格格格居居居居高高高高不不不不下下下下,限限限限制制制制其其其其推推推推广广广广应应应应用用用用。1995199519951995年年年年国国国国外外外外一一一一些些些些研研研研究究究究机机机机构构构构发发发发表表表表丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸钙钙钙钙在在在在减减减减肥肥肥肥保保保保健健健健上上上上具具具具有有有有独独独独特特特特疗疗疗疗效效效效的的的的报报报报道道道道后后后后，国国国国外外外外（主主主主要要要要是是是是美美美美国国国国）对对对对丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸钙钙钙钙的的的的需需需需求求求求量量量量激激激激活活活活，刺刺刺刺激激激激国国国国内内内内一一一一些些些些化化化化工工工工厂厂厂厂一一一一拥拥拥拥而而而而上上上上，一一一一时时时时间间间间国国国国内内内内丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸（化化化化学学学学法法法法）的的的的生生生生产产产产能能能能力力力力达达达达2000200020002000吨吨吨吨/年年年年左左左左右右右右,丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸及及及及其其其其盐盐盐盐的的的的市市市市场场场场价价价价由由由由当当当当时时时时28282828万万万万元元元元/吨吨吨吨降降降降低低低低到到到到9 9 9 9万万万万元元元元/吨吨吨吨。如如如如何何何何解解解解决决决决丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸的的的的市市市市场场场场需需需需求求求求不不不不断断断断扩扩扩扩大大大大，但但但但其其其其价价价价格格格格又又又又无无无无法法法法进进进进一一一一步步步步下下下下降降降降这这这这一一一一矛矛矛矛盾盾盾盾呢呢呢呢？显显显显然然然然开开开开发发发发成成成成本本本本更更更更低低低低的的的的丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸生生生生产产产产技技技技术术术术，即即即即采采采采用用用用直直直直接接接接发发发发酵酵酵酵或或或或生生生生物物物物转转转转化化化化法是解决此法是解决此法是解决此法是解决此问题问题问题问题的根本出路。的根本出路。的根本出路。的根本出路。29.尽管一些微生物能尽管一些微生物能尽管一些微生物能尽管一些微生物能够积够积够积够积累丙累丙累丙累丙酮酮酮酮酸，但其酸，但其酸，但其酸，但其产产产产量无法达到工量无法达到工量无法达到工量无法达到工业业业业生生生生产产产产要求而要求而要求而要求而选选选选育高育高育高育高产产产产丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸菌株十分困菌株十分困菌株十分困菌株十分困难难难难，发发发发酵法生酵法生酵法生酵法生产产产产丙丙丙丙酮酮酮酮酸真正取得酸真正取得酸真正取得酸真正取得突破是突破是突破是突破是1988198819881988年，日本年，日本年，日本年，日本东丽东丽东丽东丽工工工工业业业业株式会社的研株式会社的研株式会社的研株式会社的研究人究人究人究人员宫员宫员宫员宫田令子和米原撤田令子和米原撤田令子和米原撤田令子和米原撤选选选选育出一系列丙育出一系列丙育出一系列丙育出一系列丙酮酮酮酮酸酸酸酸产产产产量超量超量超量超过过过过50g/mL50g/mL50g/mL50g/mL的球的球的球的球拟拟拟拟酵母菌株，使得酵母菌株，使得酵母菌株，使得酵母菌株，使得发发发发酵法生酵法生酵法生酵法生产产产产丙丙丙丙酮酮酮酮酸的工酸的工酸的工酸的工业业业业化成化成化成化成为为为为可能。可能。可能。可能。1989198919891989年年年年实现实现实现实现工工工工业业业业化化化化发发发发酵生酵生酵生酵生产产产产，其，其，其，其产产产产酸率最高达酸率最高达酸率最高达酸率最高达67.8g/L67.8g/L67.8g/L67.8g/L。1992199219921992年日本开始采用年日本开始采用年日本开始采用年日本开始采用发发发发酵法生酵法生酵法生酵法生产产产产丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸产产产产量量量量为为为为400400400400吨吨吨吨/年年年年,售价售价售价售价为为为为4000400040004000日元日元日元日元/Kg/Kg/Kg/Kg。30.（二）酵母代谢控制发酵生产丙酮酸 31.n n、丙、丙、丙、丙酮酮酮酮酸脱酸脱酸脱酸脱羧羧羧羧酶酶酶酶（PDCPDC）；）；）；）；、丙、丙、丙、丙酮酮酮酮酸酸酸酸转转转转氨氨氨氨酶酶酶酶（PTPT）；）；）；）；、丙、丙、丙、丙酮酮酮酮酸酸酸酸羧羧羧羧化化化化酶酶酶酶（PCPC）；）；）；）；n n、丙、丙、丙、丙酮酮酮酮酸脱酸脱酸脱酸脱氢氢氢氢酶酶酶酶复合体（复合体（复合体（复合体（PDHPDH）。）。）。）。n nNANA和和和和B B1 1是丙是丙是丙是丙酮酮酮酮酸脱酸脱酸脱酸脱氢氢氢氢酶酶酶酶系（系（系（系（PDHPDH）的）的）的）的辅辅辅辅因子因子因子因子n nBioBio是丙是丙是丙是丙酮酮酮酮酸酸酸酸羧羧羧羧化化化化酶酶酶酶（PCPC）的）的）的）的辅辅辅辅因子因子因子因子n nB B6 6是丙是丙是丙是丙酮酮酮酮酸酸酸酸转转转转氨氨氨氨酶酶酶酶（PTPT）的）的）的）的辅辅辅辅因子因子因子因子n nB B1 1是丙是丙是丙是丙酮酮酮酮酸脱酸脱酸脱酸脱羧羧羧羧酶酶酶酶（PDCPDC）辅辅辅辅助因子助因子助因子助因子32.33.二、二、D-核糖代核糖代谢谢控制控制发发酵酵（一）（一）D-D-核糖核糖发发酵机制酵机制 34.35.36.（二）（二）D-D-核糖核糖发发酵的代酵的代谢谢控制育种控制育种 1 1、出出发发菌菌株株选选择择 芽芽孢孢杆杆菌菌属属的的细细菌菌转转酮酮酸酸缺缺陷陷突突变变株株积积累累D-D-核核糖糖具具有有普普遍遍性性。而而EcoliEcoli属属伤伤寒寒沙沙门门氏氏等等细细菌菌的的转转酮酮酸酸缺缺陷陷突突变变株株并并不不积积累累核核糖糖，都都采采用用芽芽孢孢杆菌属杆菌属细细菌。菌。37.2 2、转酮转酮酶酶缺陷突缺陷突变变株的分离（株的分离（选选育）育）（1 1）选选育育不不利利用用D-D-葡葡萄萄糖糖酸酸或或L-L-阿阿拉拉伯伯糖糖的的突突变变株株，因因为为D-D-葡葡萄萄糖糖酸酸和和L-L-阿阿拉拉伯伯糖糖必必须须通通过过磷磷酸酸戌戌糖糖途途径径进进行行代代谢谢，若若转转酮酮酶酶发发生生缺缺陷陷，那那样样菌菌体体自自然然也也就就不能利用不能利用D-D-葡萄糖酸或葡萄糖酸或L-L-阿拉伯糖。阿拉伯糖。（2 2）选选育莽草酸缺陷突育莽草酸缺陷突变变株株 （3 3）选选育育L-L-色色氨氨酸酸-、L-L-酪酪氨氨酸酸-、L-L-phephe-、CoQCoQ-、VkVk-或或叶叶酸酸缺缺陷陷突突变变、莽莽草草酸酸缺缺陷陷、4-4-赤赤藓藓糖糖合合成成受受阻阻、转转酮酮酶酶-、转醛转醛酶酶-。38.3 3、其它、其它标记标记 在在维维持持转转酮酮酶酶缺缺陷陷的的情情况况下下，进进一一步步诱诱变变使使菌菌体体带带上上具具有有高高葡葡萄萄糖糖脱脱氢氢酶酶活活性性和和丧丧失失孢孢子子形形成成能能力力，可可使使D-D-核核糖糖大大量量积积累累。葡葡萄萄糖糖脱脱氢氢酶酶是是芽芽孢孢杆杆菌菌属属序序细细菌菌的的孢孢子子所所特特有有的的酶酶，该该酶酶由由于于NADNAD、NADPNADP和和NADHNADH2 2、NADPHNADPH2 2会会发发生生分分子子型型的的变变换换，结结果果在在菌菌体体对对生生长长期期被被诱诱导导，导导致致D-D-核核糖糖大大量量积积累累，若若生生孢孢子子D-D-核核糖糖减少。减少。39.4 4、利用基因工程、利用基因工程 日日日日本本本本岩岩岩岩木木木木盾盾盾盾等等等等人人人人首首首首先先先先将将将将枯枯枯枯草草草草杆杆杆杆菌菌菌菌染染染染色色色色体体体体DNADNADNADNA中中中中的的的的转转转转酮酮酮酮酶酶酶酶基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆到到到到载载载载体体体体质质质质粒粒粒粒PUB110PUB110PUB110PUB110中中中中，然然然然后后后后将将将将氯氯氯氯霉霉霉霉素素素素酰酰酰酰基基基基转转转转移移移移酶酶酶酶基基基基因因因因插插插插入入入入到到到到转转转转酮酮酮酮酶酶酶酶基基基基因因因因之之之之中中中中，造造造造成成成成转转转转酮酮酮酮酶酶酶酶基基基基因因因因的的的的不不不不可可可可逆逆逆逆失失失失活活活活。经经经经限限限限制制制制性性性性内内内内切切切切酶酶酶酶SmalSmalSmalSmal切切切切后后后后得得得得到到到到线线线线状状状状重重重重组组组组质质质质粒粒粒粒，将将将将该该该该线线线线状状状状重重重重组组组组质质质质粒粒粒粒转转转转化化化化到到到到枯枯枯枯草草草草杆杆杆杆菌菌菌菌宿宿宿宿主主主主菌菌菌菌中中中中，构构构构建建建建转转转转酮酮酮酮酶酶酶酶失失失失活活活活的的的的D-D-D-D-核核核核糖糖糖糖工工工工程程程程菌菌菌菌株株株株。其其其其核核核核糖糖糖糖产产产产量量量量达达达达52g/L52g/L52g/L52g/L。小小小小林林林林等等等等人人人人将将将将葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆到到到到载载载载体体体体质质质质粒粒粒粒PHY300PLKPHY300PLKPHY300PLKPHY300PLK中中中中，然然然然后后后后转转转转化化化化到到到到枯枯枯枯草草草草芽芽芽芽孢孢孢孢杆杆杆杆菌菌菌菌中中中中去去去去。构构构构建建建建扩扩扩扩增增增增葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶的的的的D-D-D-D-核核核核糖糖糖糖工工工工程程程程菌菌菌菌，353535350 0 0 0C C C C发发发发酵酵酵酵80h80h80h80h可可可可积积积积累累累累49g/LD-49g/LD-49g/LD-49g/LD-核糖。核糖。核糖。核糖。40.5 5、发发酵控制酵控制 发发发发酵培养基：酵培养基：酵培养基：酵培养基：碳碳碳碳源源源源：葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖、D-D-D-D-甘甘甘甘露露露露糖糖糖糖、山山山山梨梨梨梨醇醇醇醇、D-D-D-D-甘甘甘甘露露露露醇醇醇醇、麦芽糖、乳糖麦芽糖、乳糖麦芽糖、乳糖麦芽糖、乳糖、甘油、甘油、甘油、甘油、糊精、可溶性淀粉等。糊精、可溶性淀粉等。糊精、可溶性淀粉等。糊精、可溶性淀粉等。氮氮氮氮源源源源：干干干干酵酵酵酵母母母母、酵酵酵酵母母母母膏膏膏膏、牛牛牛牛肉肉肉肉膏膏膏膏、蛋蛋蛋蛋白白白白胨胨胨胨 、玉玉玉玉米米米米浆浆浆浆 、（、（、（、（NHNHNHNH4 4 4 4）2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4、CaCOCaCOCaCOCaCO3 3 3 3。要在好气条件下，要在好气条件下，要在好气条件下，要在好气条件下，pHpHpHpH中性，温度中性，温度中性，温度中性，温度373737370 0 0 0C C C C 。41.三、三、r-亚亚麻酸代麻酸代谢谢控制控制发发酵酵 42.（一）（一）（一）（一）丝丝丝丝状真菌利用葡萄糖生物合成状真菌利用葡萄糖生物合成状真菌利用葡萄糖生物合成状真菌利用葡萄糖生物合成r-r-r-r-亚亚亚亚麻酸的代麻酸的代麻酸的代麻酸的代谢谢谢谢途径途径途径途径 43.44.(二二)高高产产r-r-亚亚麻酸麻酸 菌株的菌株的选选育思路育思路图3-9 高产r-亚麻酸 菌株的选育思路45.1 1、出、出发发菌株菌株 多多 采采 用用 被被 孢孢 霉霉（MortierellaMortierella）毛毛 霉霉（MucorMucor）红红酵酵母母（RhodotorulaRhodotorula）小小克克银银汉汉霉霉（CunninghamellaCunninghamella）等等产产油油脂脂高高的的真真菌作出菌作出发发菌株。菌株。46.2 2、切断或减弱支路代、切断或减弱支路代vva-a-亚亚麻酸麻酸-、花生四、花生四烯烯酸酸-、二十碳五、二十碳五烯烯酸酸-vv花生四花生四烯烯酸酸L L、二十碳五、二十碳五烯烯酸酸L L47.3 3、解除反、解除反馈调节馈调节 选选育脂肪酸育脂肪酸结结构构类类似物，似物，如（如（LTBLTBr r），耐高），耐高浓浓度的度的r-r-亚亚麻酸突麻酸突变变株。株。48.4 4、强强化化能能量量代代谢谢 提提高高菌菌体体细细胞胞内内ATPATP的的水水平有利于脂肪酸合成。平有利于脂肪酸合成。选选育育呼呼吸吸抑抑制制剂剂（丙丙二二酸酸、氰氰化化钾钾、亚亚伸伸酸等）抗性突酸等）抗性突变变株。株。选选育育ADPADP磷磷酸酸化化抑抑制制剂剂（羟羟胺胺、2.42.4二二硝硝基基酚等）抗性突酚等）抗性突变变株。株。选选育育抑抑制制能能量量代代谢谢的的抗抗生生素素(寡寡霉霉素素、结结元氨霉素、制霉素元氨霉素、制霉素)抗性突抗性突变变株。株。49.5 5、增加前体、增加前体 菌菌体体生生物物合合成成-亚亚麻麻酸酸与与HMPHMP、EMPEMP途途径径直直接接相相关关。增增加加HMPHMP途途径径，NADPHNADPH的的数数量量增增多多，有有利利于于-亚亚麻麻酸酸产产量量的的提提高高。过过量量的的磷磷酸酸盐盐或或通通气气不不足足会会使使EMPEMP途途径径增增强强。而而产产生生NADPHNADPH的的HMPHMP途途径径受受阻阻，导导致致不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸的的合合成成降降低低。通通过过选选育育单单氟氟乙乙酸酸敏敏感感、碘碘乙乙酸酸敏敏感感、萘萘啶啶酮酮酸酸敏敏感感突突变变株株，均均有有助助于于-亚亚麻麻酸酸产产量量的的提提高高。另另据据报报道道，选选育育异异柠柠檬檬酸酸脱脱氢氢酶酶渗渗漏漏突突变变殊殊，也也有利于有利于-亚亚麻酸麻酸产产量的提高。量的提高。50.6 6、选选育育-6-6脱脱氢氢酶酶活力活力强强的突的突变变株株 -6 -6脱脱氢氢酶酶是生物合成是生物合成r-r-亚亚麻酸关麻酸关键键酶酶之一。其活性高低直接与之一。其活性高低直接与r-r-亚亚麻酸麻酸含量的高低密切有关，可采用含量的高低密切有关，可采用选选育呼吸育呼吸缺陷型相反的方法，即呼吸增缺陷型相反的方法，即呼吸增强强型，通型，通过诱变过诱变后菌株涂在含有后菌株涂在含有TTCTTC的一种无色的一种无色的氧化的氧化还还原原剂剂的生的生长长培养基上，若培养基上，若-6-6脱脱氢氢酶强酶强，即可将，即可将TTCTTC还还原成原成红红色的物色的物质质，红红色越色越强强，表明菌体，表明菌体细细胞内胞内-6-6脱脱氢氢酶酶越越强强，r-r-亚亚麻酸的麻酸的积积累量也就越多。累量也就越多。51.7 7 7 7选选选选育低温生育低温生育低温生育低温生长长长长突突突突变变变变株株株株 细细细细胞膜是重要的微生物胞膜是重要的微生物胞膜是重要的微生物胞膜是重要的微生物细细细细胞表面胞表面胞表面胞表面结结结结构，由脂构，由脂构，由脂构，由脂质质质质和蛋白和蛋白和蛋白和蛋白质组质组质组质组成。脂成。脂成。脂成。脂质质质质分子中不分子中不分子中不分子中不饱饱饱饱和脂肪酸的含量和脂肪酸的含量和脂肪酸的含量和脂肪酸的含量越高，其在低温条件下越高，其在低温条件下越高，其在低温条件下越高，其在低温条件下细细细细胞膜的沉胞膜的沉胞膜的沉胞膜的沉动动动动性也就越大，性也就越大，性也就越大，性也就越大，即微生物即微生物即微生物即微生物细细细细胞生胞生胞生胞生长长长长的温度就越低。据的温度就越低。据的温度就越低。据的温度就越低。据报报报报道，道，道，道，选选选选育育育育在相在相在相在相对对对对低温低温低温低温(15)(15)(15)(15)条件下生条件下生条件下生条件下生长长长长良好的突良好的突良好的突良好的突变变变变抹，抹，抹，抹，结结结结果其果其果其果其-亚亚亚亚麻酸的麻酸的麻酸的麻酸的产产产产量提高了量提高了量提高了量提高了1.41.41.41.4倍。倍。倍。倍。52.8 8 8 8选选选选育耐高糖的突育耐高糖的突育耐高糖的突育耐高糖的突变变变变株株株株 在代在代在代在代谢谢谢谢控制控制控制控制发发发发酵中，常采用耐高渗透酵中，常采用耐高渗透酵中，常采用耐高渗透酵中，常采用耐高渗透压压压压突突突突变变变变株。株。株。株。-亚亚亚亚麻酸麻酸麻酸麻酸发发发发酵与培养基中糖酵与培养基中糖酵与培养基中糖酵与培养基中糖浓浓浓浓度有密切关系，在度有密切关系，在度有密切关系，在度有密切关系，在一定范一定范一定范一定范围围围围内，内，内，内，-亚亚亚亚麻酸的麻酸的麻酸的麻酸的产坠产坠产坠产坠随糖随糖随糖随糖浓浓浓浓度的增加而度的增加而度的增加而度的增加而增加，但糖增加，但糖增加，但糖增加，但糖浓浓浓浓度度度度过过过过高就会抑制菌体生高就会抑制菌体生高就会抑制菌体生高就会抑制菌体生长长长长。降低。降低。降低。降低产产产产物的物的物的物的积积积积累。因此，通累。因此，通累。因此，通累。因此，通过选过选过选过选育耐高糖的突育耐高糖的突育耐高糖的突育耐高糖的突变变变变抹。可抹。可抹。可抹。可使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高-亚亚亚亚麻酸麻酸麻酸麻酸的的的的产产产产量。量。量。量。53.四、四、柠柠檬酸代檬酸代谢谢控制控制发发酵酵 2001年以来世界年以来世界柠柠檬酸的檬酸的产产量量为为100万吨左右，万吨左右，2004年我国年我国柠柠檬酸檬酸产产量达量达45万吨，其中万吨，其中80%出口，已出口，已经经成成为为世界世界柠柠檬酸生檬酸生产