养殖环境中砖火丝菌的分离鉴定及抗菌药物筛选.pdf

202307期 总第400期生活中常见的“发霉”现象，主要由真菌引起。真菌繁殖迅速，一经污染难以控制，室内环境中的真菌污染不仅降低了居住者的舒适度，而且易诱发多种呼吸道疾病和过敏性反应，对人体和动物的健康都会造成极大威胁。本试验通过对生活环境中常见的霉菌进行分离，研究肉桂醛、双乙酸钠、山梨酸钾、苯扎氯铵抗真菌药对分离菌株的抑菌效果，并通过联合药敏试验研究抗真菌药物的复配效果，筛选出最优的除霉配方。1试验材料1.1仪器DSX-30L-1高压蒸汽灭菌器，SCB-1360型超净工作台，101型电热恒温鼓风干燥箱，DH-420电恒温培养箱，VD-850垂直净化工作台。1.2药品与试剂双乙酸钠，山梨酸钾，肉桂醛，苯扎氯铵，PDB培养基，PDA培养基。试验研究养殖环境中砖火丝菌的分离鉴定及抗菌药物筛选吴少强1，钟玥婷1#，张心怡1，黄塬婷1，邱咏柯1，陈思羽1，符华林2*（1.四川农业大学动物医学院兽药创新制剂工程技术研究中心，四川 成都 611130；2.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130）摘要：为了解养殖环境真菌污染情况，并筛选相应抗菌药物，本试验刮取养殖环境中墙角等真菌污染严重部位的真菌，用PDA培养基进行分离纯化培养，以ITS1、ITS4为引物进行DNA测序，将所得序列结果与NCBI核酸数据库参考菌株进行相似性比对，确定分离菌株的种属，再分别测定双乙酸钠、山梨酸钾、肉桂醛、苯扎氯铵四种抗真菌药的最小抑菌浓度（MIC），选出最优成分进行复配及联合抑菌试验，并以分级抑菌浓度（FICI）指数作为复配抑菌试验结果评价的判定依据，筛选出联合抗真菌药物的最佳比例。结果得出：墙角分离出的优势真菌鉴定为砖火丝菌（Pyronemadomesticum）；肉桂醛、双乙酸钠、山梨酸钾、苯扎氯铵四种药物对砖火丝菌的MIC值分别为128、4、1 mg/mL及4 g/mL；选择双乙酸钠、山梨酸钾、苯扎氯铵进行联合抑菌试验，其中双乙酸钠与山梨酸钾显示出协同作用，双乙酸钠与山梨酸钾、双乙酸钠与苯扎氯铵、山梨酸钾与苯扎氯铵联用均显示无关作用。试验表明双乙酸钠与山梨酸钾联用可以增强对砖火丝菌的清除效果，值得进一步开发与应用。关键词：砖火丝菌；双乙酸钠；山梨酸钾；苯扎氯铵；肉桂醛；联合抑菌中图分类号：S854.43文献标识码：B文章编号：1001-8964（2023）07-0027-04收稿日期：2022-12-09基金项目：四川省大学生创新创业训练计划项目（202110626070，S202210626087）作者简介：吴少强（2001-），男，江苏南京人，本科，主要从事兽药新剂型研究。E-mail:#为同等贡献*通信作者：符华林（1972-）,男，四川华蓥人，博士，教授，从事兽用药物新型给药系统研究。E-mail:27202307期 总第400期2方法2.1墙角菌种的分离与鉴定从某养殖场实验室墙角、洗手间等潮湿角落用棉签刮取少许真菌，在无菌条件下，将棉签放入装有50mL灭菌肉汤的EP试管中充分浸润，置于摇床上振荡4h，之后取0.2mL稀释溶液转移到PDA培养基上，用无菌涂布棒涂匀后，在32恒温培养箱中培养35d。待菌落长出后，挑取少量菌丝在PDA培养基上做划线分离，待霉菌菌落明显长出，再挑取少量菌丝进行平板划线，经3次平板划线后该菌已得到初步纯化。分离纯化后，将该菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司以 ITS1、ITS4 为引物进行DNA 测序，将测序所得序列在 NCBI 网站进行Blast在线比对，寻找具有较高同源性的核苷酸序列。2.2菌悬液的制备取纯种培养三代以上的上述分离菌落，32 培养96 h，平皿内加少许灭菌水，用无菌涂布棒刮取孢子1，灭菌水作10-3、10-4、10-5梯度稀释，进行平板计数，得到该菌液浓度为6107CFU/mL。最终将该菌悬液稀释至1.01063.0106CFU/mL。2.3四种抗真菌药物最小抑菌浓度的确定将肉桂醛、双乙酸钠、山梨酸钾、苯扎氯铵用PDB液体培养基倍比稀释，采用二倍逐级稀释法，前三种药设128、64、32、16、8、4、2、1mg/mL 8个浓度梯度，苯扎氯铵则设128、64、32、16、8、4、2、1 g/mL8个浓度梯度。取50L倍比稀释的药物按浓度从高到低的顺序依次加入无菌96孔平板110列试管中，然后向第110列试管加入50 L液体培养基，第11列加入200 L空白肉汤作为阴性对照，第12列加入100L液体培养基和100L供试菌液（106CFU/mL）作为菌液对照。再在110列中加入100L供试菌液（106CFU/mL），每梯度设3个重复，32下培养24h后观察结果。2.4最优成分的复配及联合抑菌试验根据前面的试验结果，筛选出23种最优组分进行联合抑菌试验。参照CLSI M27-A（酵母菌液体培养基稀释法抗真菌药物敏感试验）方案，将药液用PDB培养基稀释为2倍倍比质量浓度（药物终质量浓度范围为：双乙酸钠161/16mg/mL，山梨酸钾41/64mg/mL，苯扎氯铵41/64g/mL）。按照如下方法操作2：由高浓度到低浓度的顺序，取50L倍比稀释的双乙酸钠药液，依次由低浓度到高浓度加入96孔板的第211列；取50 L倍比稀释的山梨酸钾药液，依次加入96孔板的第BH行，除A12孔之外，向其他各孔加入100 L菌悬液，并设置空白对照与纯菌液对照，32 恒温恒湿培养24h后观察结果。以分级抑菌浓度指数（Fractional InhibitoryConcentration Index，FICI）作为复配抑菌试验结果评价的判定依据。计算公式如下所示：FICI指数MICA复配MICAMICB复配MICB式中，MICA复配为A和B联用时A对应的最小抑菌浓度；MICB复配为A和B联用时B对应的最小抑菌浓度；MICA和MICB分别为A、B单独使用时的最小抑菌浓度。FICI指数判定标准：FICI0.5为协同效应，0.5FICI1为部分协同效应，FICI1为相加效应，1FICI4 为无关效应，FICI4 为拮抗效应。用该标准对试验结果进行判定，筛选最优抑霉组合。3结果与分析3.1分离真菌的形态学鉴定经3次平板划线后该菌已得到初步纯化。在PDA培养基上，菌落较大，外观为绒毛状，质地疏松，不透明，菌丝无色或淡色，菌落成熟后外边缘为深绿色，中间部位为白色并有凹痕。分离纯化的结果如图1所示。试验研究图1砖火丝菌的分离纯化28202307期 总第400期3.2分离真菌的分子生物学鉴定以ITS1、ITS4为引物进行DNA测序，得到该菌的正反两段DNA的碱基序列与对应的测序图，其碱基序列为CCCTTCCGTAGGGGAACCTGCGGAAGGATCATTAAAAGTTAATTGGTTATACTCCGGTATAAATCTAATTAAACACCTCTGAGTACCTTACCTGTTGCTTCCGTGAGGCCTGACTCCAGTAGTGGTTCGCCACCACTGGATACTTGCGGAAGGTATACACTTAAACACTTTGAATCTATGTCATCTGTCTGATAATGTTTATAACAACGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTCCTGGTATTCCGGGAGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTAACCTCCTCAAGCTTTTGCTTGGTATTGGAAGAAGAGGCCGCTTGTCGGTCTCCCTTCGAAATGCAATGGCAGATTGCCTCATGTGCCCTGGCGTAATAAGATTTATCTTTCGCTTGTGCATTGGGATGATCCCGCCGCACCCAATTTITCTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAGA。将拼接结果输入 NCBI 网址进行 Blast 比对，比对结果与砖火丝菌同源率最高，鉴定为砖火丝菌。3.3四种药物的MIC测定结果根据MIC的测定结果，得到肉桂醛MIC为128mg/mL，双乙酸钠MIC 为 4 mg/mL，山梨酸钾 MIC 为 1 mg/mL，苯扎氯铵MIC为4g/mL。四种药物的MIC测定结果见表1。四种药物的MIC测定结果指标MIC肉桂醛128双乙酸钠4山梨酸钾1苯扎氯铵0.004表1mg/mL3.4联合抑菌试验结果由表1可知，最佳防霉成分为双乙酸钠、山梨酸钾、苯扎氯铵。将以上三种药物复配进行联合抑菌试验，结果如表2、表3、表4所示。双乙酸钠和山梨酸钾在浓度比为4 1时，FICI0.5有协同作用，双乙酸钠和山梨酸钾的最小抑菌浓度分解降低到了1 mg/mL 和0.25 mg/mL；在 1 2 及 32 1 的浓度比下，FICI 在0.51之间，显示部分协同作用；而双乙酸钠与苯扎氯铵联用，山梨酸钾与苯扎氯铵联用的FICI结果均1，呈现相加或无关作用。4讨论本研究从墙角分离得到的真菌以砖火丝菌为主。砖火丝菌是一种存在于棉制品上的霉菌，对环氧乙烷有较强的抗力，棉制医疗用品曾因此而灭菌不彻底。砖火丝菌常见于洗手池、厨卫等区域的瓷砖缝隙，难以去除。砖火丝菌为孢子生殖，孢子漂浮在空气中，进入人体呼吸道后严重影响人类健康3。传统除真菌产品的成分以次氯酸钠为主，成分单一，防霉效率低。本研究筛选常用的抗真菌药物如肉桂醛、双乙酸钠、山梨酸钾、苯扎氯铵进行MIC试验4-5，得出双乙酸钠、山梨酸钾和苯扎氯铵对砖火丝菌均有较强抑制作用，试验结果符合预期。本研究将抑菌效果最好的双乙酸钠、山梨酸钾、苯扎氯铵进行联合抑菌试验，发现双乙酸钠和山梨酸钾在4 1时有协同作用，除真菌效果良好。而双乙酸钠与苯扎氯铵，山梨酸钾与苯扎氯铵基本呈现无关作用。双乙酸钠与山梨酸钾联用时具有协同作用，能够很好地抑制砖火丝菌。因此，选择双乙酸钠与山梨酸钾作为除霉产品的主药成分。由于市面上防真菌产品主要以次氯酸钠为主，关于成分的改良更新较少，故本试验能为新型除真菌配方的研制提供一定的参考。试验研究双乙酸钠与苯扎氯铵联用的MIC及FICI单独MIC双乙酸钠444苯扎氯铵0.0040.0040.004联合MIC双乙酸钠421苯扎氯铵0.0010.0020.004FICI1.000111.25判定结果无关相加无关表3mg/mL山梨酸钾与苯扎氯铵联用的MIC及FICI单独MIC山梨酸钾111苯扎氯铵0.0040.0040.004联合MIC山梨酸钾10.50.25苯扎氯铵0.0010.0020.004FICI1.000111.25判定结果无关相加无关表4mg/mL双乙酸钠与山梨酸钾联用的MIC及FICI单独MIC双乙酸钠444山梨酸钾111联合MIC双乙酸钠10.252山梨酸钾0.250.50.0625FICI0.50.56250.5625判定结果协同部分协同部分协同表2mg/mL（下转第31页）29202307期 总第400期母羊有无发情反应，统计不返情数。2试验结果2.1发情配种撤拴后第12d，试验山羊母羊除有两只因阴道栓中途脱出未出现发情症状外，其余48只全部出现发情症状，发情率96%。30只半细毛羊全部发情，发情率100%。第13 d开始配种，第14 d全部配种结束。参配山羊48只，配怀羊48只，配怀率100%。参配半细毛羊30只，配怀30只，配怀率100%。2.2产羔从配种当天算起，第147152d产羔结束。48只黑山羊母羊产羔69只，产羔率100%，其中产双羔母羊21只，占43.75%，产单羔母羊27只，占56.25%。30只半细毛羊母羊产羔30只，产羔率100%。总的来看，山羊组产羔率143.7%，产羔成活率100%；半细毛羊组产羔率100%，产羔成活率100%。详见表1。3讨论羊的同期发情技术已有60余年的发展历史，但在会东县推广应用尚属首次。本研究主要是通过控制卵泡来实现周期发情，和以往通过使用外源性激素来调控黄体的持续时间，从延迟黄体或者溶解黄体的角度来控制母羊发情的方法相比，发情和排卵时间可以做到准确预测，并且不经过发情鉴定即可准确把握人工授精的最佳时间。同期发情技术的优势如下：3.1加快品种改良速度采用母羊同期发情技术，提高并扩大了优良种公羊的利用和杂交改良范围，使其精液得到充分利用，最大限度地利用其优良遗传特性。对于在草场或配种季节有限制的地区，可以提前拟定繁殖计划，集中配种，以加快肉羊品种改良进程。3.2提高母羊生产性能同期发情技术是肉羊生产中一项先进的繁殖技术，能够加快母羊的繁育速度，利于母羊集中发情、集中供精、集中分娩，使多胎羊实现一年两胎或两年三胎、三年五胎，也利于羔羊早期断乳（11.5月龄）和早期出栏上市（46月龄），从而实现肉羊生产效益的最大化。3.3提升羊场管理水平同期发情技术是一项组织严密、科学严谨的技术体系，只有按技术规程正确的操作，才会产生应有的生产效益。目前，我国舍饲肉羊集约化、工厂化生产正处于良性发展阶段，同期发情技术在规模肉羊生产中的广泛应用，将极大地提升规模肉羊场的管理水平和工作效率，对于批量生产商品羊，全年均衡供应和市场销售都具有重要作用。4结论本试验将山羊和绵羊分成两组开展同期发情，均取得较好的效果。山羊组发情率96%，配怀率100%，产羔率143.7%，产羔成活率100%；半细毛羊组发情率 100%，配怀率 100%，产羔率100%，产羔成活率100%。均达到预期目标：同期发情率达到 90%以上，授精配怀率达到 90%以上，成活率达80%，值得在当地推广应用。品种建昌黑山羊凉山半细毛羊试验羊（只）5030发情（只）4830发情率/%96100配怀（只）4830配怀率/%100100产羔（只）6930产羔率/%143.7100成活（只）6930产羔成活率/%100100两组羊的配种和产羔情况表1试验研究参考文献：1 广州立白企业集团有限公司.一种除霉啫喱及其制备方法：中国，CN202010294192.7 P.2020-06-30.2 尹光美，苏刘艳，李俊，等.棋盘法和倍比微量稀释法在体外联合抗真菌活性药物筛选中的应用研究 J.云南民族大学学报（自然科学版），2019，28（3）：246-250.3 Lampe C M，Hansen J M，Rymer T.Sterilizationof products contaminated with PyronemadomesticumJ.Biomedical Instrumentation and Technology，2009，43（6）：489-497.4 王玉琼，廖国建.抗真菌治疗新药研发进展 J.中国抗生素杂志，2021，46（12）：1078-1083.5 康烨，王瑞娜，阎澜.抗真菌药物潜在靶点及化合物研究进展 J.中国真菌学杂志，2021，16（6）：414-419.（上接第29页）31