超氧化物歧化酶PPT课件.ppt

超氧化物歧化超氧化物歧化酶酶(SOD)的生的生产产 第六组 钱龙1.SOD知知识简识简介介1.SOD的概念的概念 超氧化物歧化超氧化物歧化酶是一种广泛存在于是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金物、植物、微生物中的金属属酶，是生物体内抗氧化，是生物体内抗氧化酶系中主要成系中主要成员之一。之一。2.SOD的分的分类 按其按其结合的金属离子可分合的金属离子可分为Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD三种三种2.SOD知知识简识简介介3.SOD的理化性的理化性质 3.1 SOD对氰化物和化物和H2O2的敏感性的敏感性 长时间用用过氧化氧化氢处理可使理可使 CuZn-SOD 和和 Fe-SOD失活，而失活，而Mn-SOD不受影响不受影响3.2 SOD的吸收光的吸收光谱特性特性 CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪。由于色氨酸和酪氨酸的含量氨酸的含量较低，它在低，它在280 nm处并没有最大吸收峰。并没有最大吸收峰。CuZn-SOD的可的可见光最大吸收波光最大吸收波长都在都在680 nm左右，左右，这反映了反映了酶分子中分子中Cu2+的光学特性。的光学特性。3.SOD知知识简识简介介3.3 SOD稳稳定性及影响因素定性及影响因素3.3.1 PH、热、蛋白、蛋白酶的影响：的影响：SOD在在pH5.39.6间催化性能催化性能良好，在良好，在pH4.5pH11间能能稳定存在。定存在。pH3.6时，CuZn-SOD中中95%的的Zn要脱落，在要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会的构象会发生不可逆的生不可逆的转变而使而使酶失活。失活。3.3.2 SOD对热的的稳定性与溶液中离子定性与溶液中离子强度有关。当离子度有关。当离子强度度很低很低时,即使加即使加热到到95,其活性其活性损失也很少其他因素：失也很少其他因素：SOD活活性受性受饮料的色料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇只有在无色、近中性、无乙醇饮料中料中SOD活性活性较稳定。另外定。另外还发现有机溶有机溶剂和和Cl对SOD的活性具抑制作用的活性具抑制作用4.SOD的作用的作用welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience 它催化超氧阴离子它催化超氧阴离子转化化为H2O2和和O2的反的反应，即催即催化超氧阴离子自由基化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反生歧化反应，从而清除从而清除O2-，2O2-+2H+H2O2+O2，在生命体的自我保在生命体的自我保护系系统中中起着极起着极为重要的作用，重要的作用，在免疫系在免疫系统中也有重要的功，因中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增而它能防御氧毒性，增强机体抗机体抗辐射射损伤能力，防衰老。能力，防衰老。5.6.实训实训目的目的（1）掌握）掌握SOD酶的提取、分离、的提取、分离、检测一般步一般步骤。2）了解）了解酶在提取在提取过程中的两个参数：回收率、程中的两个参数：回收率、纯化倍数。化倍数。3）掌握离心机的使用。）掌握离心机的使用。7.实训实训原理原理welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出放出 O2-，生成，生成带色的中色的中间产物，中物，中间物的物的积累在滞留累在滞留3045s后，与后，与时间成成线性关系，一般性关系，一般线性性时间维持在持在4min的的范范围内，中内，中间物在物在420nm波波长处有有强烈光吸收。烈光吸收。当有当有SOD存在存在时，由于它能催化，由于它能催化O2-与与H+结合生成合生成O2和和H2O2，从而阻止了中，从而阻止了中间产物的物的积累，因此，通累，因此，通过测定定光吸收即可求出光吸收即可求出SOD的的酶活性。活性。8.实训实训器材器材welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience 大蒜，冷丙大蒜，冷丙酮 ，磷酸磷酸缓冲液（冲液（PH7.8，0.05mol/L)氯仿仿-乙醇混合液乙醇混合液 邻苯三酚苯三酚 浓盐酸酸仪器：器：天平、天平、石英砂、石英砂、研研钵、冷冷冻离心机、离心机、50mL离心管离心管 （8）、）、紫外紫外-可可见分光光度分光光度计、250mL三角瓶（三角瓶（8个）、个）、玻璃棒玻璃棒 （8根）、根）、试剂瓶瓶250mL（3个）、个）、500mL （3个）、个）、250mL烧杯杯 （16个）、个）、试管管带胶塞胶塞(80根根)、移液管、移液管(5根根)9.SOD的生的生产产1.SOD酶的提取的提取 称取称取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，胞后，加入加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸的磷酸缓冲液（冲液（pH7.8）15ml，继续研磨研磨20min,使使SOD酶充分溶解到充分溶解到缓冲液中，然后冲液中，然后6000r/min冰冰冻离心离心15min，放弃沉淀，取上清液。，放弃沉淀，取上清液。2.去除去除杂蛋白蛋白 上清液中加入上清液中加入0.25倍体倍体积的的氯仿仿乙醇混合液乙醇混合液搅拌拌15min,6000r/min离心离心15min，放弃沉淀，得到的上清，放弃沉淀，得到的上清液即是粗液即是粗酶液液10.SOD的生的生产产3.SOD酶的沉淀分离的沉淀分离 粗粗酶液在液在搅拌下拌下缓慢加入固体硫酸慢加入固体硫酸铵至至饱和和浓度度60%，持，持续搅拌拌15min，6000r/min离心离心15min，得到，得到SOD酶沉淀沉淀4.将沉淀溶入将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸的磷酸缓冲液冲液5mL中，中，然后然后6000r/min离心离心15min，放弃沉淀，取上清液，用，放弃沉淀，取上清液，用凝胶凝胶sephacylS-200进行行纯化，然后超化，然后超滤浓缩。11.SOD的生的生产产5.用紫外分光光度用紫外分光光度计测定定浓液的蛋白含量液的蛋白含量6.将将浓缩冷冷冻干燥后即得成品。干燥后即得成品。12.连连苯三酚自氧化速率的苯三酚自氧化速率的测测定定 取取4.5ml缓冲液，在冲液，在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入10 连苯苯三酚液，迅速三酚液，迅速摇匀匀 空白：取空白：取4.5ml缓冲液，在冲液，在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入10 缓冲液，迅速冲液，迅速摇匀匀 倒入光径倒入光径1cm的比色杯中，在的比色杯中，在325nm波波长长下于恒温池中下于恒温池中每隔每隔30s测测A值值一次一次 计计算算线线形范形范围围内，每内，每1minA的增的增值值，此即，此即连连苯三酚的自苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min13.酶酶活活测测定定测定方法与定方法与测连苯三酚自氧化速率相同苯三酚自氧化速率相同取取1.5ml缓冲液，在冲液，在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入3ml酶液，加入液，加入10 连苯三酚液，迅速苯三酚液，迅速摇匀匀空白：取空白：取1.5ml缓冲液，在冲液，在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入3ml酶液，加入液，加入10 缓冲液，迅速冲液，迅速摇匀匀计算加算加酶后后连苯三酚自氧化速率苯三酚自氧化速率14.SOD的生的生产产15.结结果果计计算算酶活力活力单位位 提取液提取液酶活力活力单位：位：=2（OD1-OD2）5/0.1=粗粗酶液活力液活力单位：位：=2（OD1-OD2）5/0.1=酶液活力液活力单位：位：=2（OD1-OD2）5/0.1=总活力活力 提取液提取液总活力活力U=活力活力单位位总体体积=粗粗酶液液总活力活力=活力活力单位位总体体积=酶液液总活力活力=活力活力单位位总体体积=比活力比活力 提取液提取液酶液比活力液比活力U/mg=活力活力单位位/蛋白蛋白质浓度度=粗粗酶液比活力液比活力U/mg=活力活力单位位/蛋白蛋白质浓度度=酶液比活力液比活力U/mg=活力活力单位位/蛋白蛋白质浓度度=16.注意事注意事项项welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience1.SOD的安全性的安全性 大量大量试验和和临床床应用表明，用表明，无无论何种何种给药方式，除罕方式，除罕见的超敏反的超敏反应外，外，SOD对人体无毒性。人体无毒性。虽然然SOD是是Mr在在30 000以上的蛋白以上的蛋白质，但却未但却未发现具有抗原性，具有抗原性，其原因其原因也正在也正在进一步研究中。一步研究中。17.2.SOD生生产时的注意事的注意事项2.1 在破碎在破碎细胞胞时要注意安全，一定要破碎的要注意安全，一定要破碎的彻底底2.2 PH的控制力度很重要，以及在的控制力度很重要，以及在实验中的温度等中的温度等 2.3 要学会正确使用分光光度要学会正确使用分光光度计18.