利用TRIzol_试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA.doc

利用TRIzol_试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA.txt“我羡慕内些老人 羡慕他们手牵手一直走到最后。━交话费的时候，才发现自己的话那么值钱。第30卷第
5期
西安交通大学学报
(医学版
) Vol. 30 No. 5
2009年
10月Journal of Xipan Jiaotong University (Medical Sciences) Oct. 2009

利用
TRIzol ó试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总
RNA

李冬民
1,2 ,任吴超
1,2 ,王　璇
1,2 ,王飞苗
1,2 ,高　玉
1,2 ,
韩　燕
1,2 ,宁启兰
1,2 ,宋天保
1,3 ,吕社民
1 ,2
(西安交通大学医学院
:1.环境与疾病相关基因教育部重点实验室
;2.遗传学与分子生物学系
;
3.人体解剖学与组织胚胎学系
,陕西西安　
710061)

摘要
:目的　建立胰腺高质量总
RNA快速、经济、稳定的提取方法。方法　应用
TRIzol ó试剂和液氮提取大鼠胰腺总
RNA ,通过总
RNA含量和
A260/ 280比值的测定及
10 g/L非变性琼脂糖凝胶电泳评估总
RNA的质量
,并用
RT2PCR检
测大鼠胰岛素
1、胰高血糖素、胰α2淀粉酶和
β2actin的表达。结果　利用
TRIzol ó和液氮提取的大鼠胰腺总
RNA量
可达到
3～6μg/ mg胰腺组织
,A260/ 280比值在
1. 75～1. 89之间。在
10 g/L非变性琼脂糖凝胶电泳时
,均可见
28S及
18S条带
,并且在
28S、18S条带间可见明显的云雾状阴影。大鼠胰岛素
1、胰高血糖素、胰α2淀粉酶、
β2actin RT2PCR
产物电泳结果显示均有清晰的条带。结论　应用
TRIzol ó试剂和液氮成功地提取了大鼠胰腺高质量的总
RNA ,后者
可用于
RT2PCR研究。
关键词
:大鼠胰腺
;总
RNA提取
; TRIzol ó试剂
;液氮
中图分类号
:Q813　　　文献标志码
:A　　　文章编号
:167128259 (2009) 0520639204

, REN Wu2chao1 ,2 , WAN G Xuan1 ,2 , WAN G Fei2miao1,2
HAN Yan1,2 , NINGQi2lan1 ,2 , SON G Tian2bao1 ,3
(1. Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases ,
Ministry of Education of China/
A method with TRIzol ó reagent and liquid nitrogen to
extract high2quality RNA from rat pancreas

LI Dong2min1,2 , GAO Yu1,2 ,
,L B She2min1 ,2

Medical School of Xipan Jiaotong University , Xipan 710061 ;

2. Department of Genetics and Molecular Biology , Medical School of
Xipan Jiaotong University , Xipan710061;3. Departmentof HumanAnatomy,
Histology and Embryology , Medical School of Xipan Jiaotong University , Xipan 710061 , China)
ABSTRACT : Objective　To establish a quick , economical and reproducible method for high2quality RNA
extraction from pancreas. Methods　We utilized TRIzol
ó
Reagent and liquid nitrogen to isolate total RNA from
the rat pancreas. The RNA quality was determined by detection of its content and optic density ( A) at 260/ 280 nm ,
and electrophoresis in 1 % non2denatured agarose gel. Then reverse transcription2polymerase chain reaction (RT2
PCR) was performed to detect expression of the pancreas2specific genes. Results　The content of the total RNA

extracted from the rat pancreas reached 3 -6 μg/mg pancreatic tissues, and A260/280 ratio was 1. 75 -1. 89.
Electrophoresis of the total RNA showed 28S and 18S rRNA bands with clear smear between them. The RT2PCR
products of pancreas2specific genes including insulin 1 , glucagon , α2amylase and housekeeping gene β2actin all
exhibited clear bands on 1 % agarose gel , which were located in the expected positions , respectively. Conclusion　
These results suggest that we have successfully isolated the high2quality and intact RNA from the rat pancreas with
TRIzol
ó
Reagent and liquid nitrogen. The extracted total RNA can be used in RT2PCR for pancreatic gene expres2
sion.
KEY WORDS : rat pancreas; total RNA extraction; TRIzol
ó
reagent; liquid nitrogen

收稿日期
:2008212223　　修回日期
:2009203218

基金项目
:国家自然科学基金资助项目
(No. 30400249 ;30571725 ;30630058) ;陕西省国际科技合作重点项目
(No. 20072KW206) ;陕西省自然科学
基金资助项目
(No. 2004C256) ;陕西省卫生厅基金资助课题
(No. D204028)
SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina (No.30400249;30571725;30630058) ,theInternationalCooperational
Foundation of Shaanxi Province (No. 20072KW206) , the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No. 2004C256) , and the
Foundation of Health Department of Shaanxi Province (No.D204028) .

通讯作者
:宋天保
,教授
,博士生导师
.E2mail: songtbao@;吕社民
,教授
,博士生导师
.E2mail : lushemin @mail. xjtu. edu. cn
作者简介
:李冬民
(19702),女
(汉族
),博士
.研究方向
:2型糖尿病等代谢性疾病的分子发病机制
.

6　　　　　40 西安交通大学学报
(医学版
)第
30卷

1968年
,COX用盐酸胍代替酚作为蛋白质变性
剂
,建立了分离纯化
RNA的方法。
1979年
,CHIR2
GWIN成功地利用异硫氰酸胍裂解、并以氯化铯为
基质经超高速离心从富含核糖核酸酶的组织中
,分离
到未降解的
RNA ,并成为当时提取
RNA的主要方
法。
1987年
, CHOMCZYNS KI和
SACCH I在联合
应用异硫氰酸胍和酚提取
RNA的基础上
,建立了用
酸性异硫氰酸胍
2酚2氯仿抽提一步法分离
RNA的方
法
,由于省略了以氯化铯为基质经超高速离心这一步
骤
,分离
RNA的时间缩短为
4h,不但使
RNA的产
量和纯度大大提高
,而且还可从微量的细胞和组织中
提取
RNA。这种提取
RNA的方法被广泛应用
,并
且被商业化。尽管目前已能成功地从原核生物、真核
生物的多种组织和细胞中提取
RNA ,但由于胰腺易
自溶和富含内源性核糖核酸酶
[1] ,导致很难获得高质
量的胰腺
RNA ,给研究胰腺组织的基因表达带来很

表
1　大鼠胰腺中表达的
4个基因的引物序列和扩增片段大小

大困难。我们经过反复试验
,利用
TRIzol ó试剂和液
氮从大鼠胰腺组织中成功提取完整的
RNA ,可用于
RT2PCR、Northern blotting、差异显示、抑制性消减
杂交及芯片等的研究。

1　材料与方法

1. 1　实验动物　
SPF级
E3雌性大鼠
4只
,体重
220～250 g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1. 2　主要试剂及仪器　
TRIzol ó试剂
( Invitrogen公
司);反转录试剂盒
RevertaidTM First Strand cDNA
Synthesis ( Fermentas公司
); T aq DNA polymerase
( Ta KaRa公司
)。蛋白核酸定量仪
CE2321
(GENEGUEST) ;凝胶成像系统
(SYNGENE) ;PCR
热循环仪
P TC2200 (BIO2RAD)。用
PrimerPrimier
5. 0设计
PCR引物
,并由上海桑尼生物科技有限公
司合成
,引物序列见表
1。
2AGCAAGCA GGTCATTGTTCC23′
2T T GCGGGTCCTCCACTTC23′
2ACCGT TTACA TCGT GGCT23′Sense primer : 5′
Antisense primer : 5′
Sense primer : 5′
Antisense primer : 5′
Tab. 1　The primer sequence and size of PCR products of the 4 genes expressed in the rat pancreas
Gene Primer sequence

Size of PCR products
Sense primer : 5′

Insulin 1 209 bp

Antisense primer : 5′

Glucagon

492 bp

2GTCTCT GGT GGCAA GGT TA T23′
2ACA T T GGT GTA GCA GGGT T23′

α2amylase

318 bp

2CAAGGGCTCTGTCA GTAGG23′

Sense primer : 5′2CACCC GCGA G TACAA CCTTC23′

β2actin 207 bp

Antisense primer : 5′2CCCA TACCCACCA TCACACC23′

1. 3　大鼠胰腺的取材和保存　取材所用的器械
180
℃干烤
6 h,不能干烤的塑料制品用
1 mL/L DEPC
水
37℃处理过夜
,高压烤干后备用。戊巴比妥钠麻
醉
E3大鼠
,快速取胰腺尾部组织约
20～30 mg,装
入
DEPC处理过的冻存管中
,液氮中保存或液氮速
冻后
-80℃保存备用。

1. 4　利用
TRIzol ó和液氮提取大鼠胰腺总
RNA　
将胰腺组织从液氮或
-80℃低温冰箱中取出
,立即
放入装有适量液氮的研钵中迅速研磨成粉末
,研磨过
程中始终保持研钵内有液氮。然后
,将胰腺组织粉末
移入
1.5 mL的
EP管中
,加入
1 mL TRIzol ó ,剧烈
震荡
30 s,并在室温放置
5 min。加入
0.2 mL氯仿
,
剧烈振荡
15 s,室温放置
3 min ,4 ℃12 000 ×g离心
15 min,样品分为
3层
:上层无色水相
,下层粉红色有
机相
,中间白膜层。将上清转移至另一新的
D EPC
处理过的
1.5 mL EP管中
(此步绝对不能吸入中间
白膜层
),加入
0.5 mL异丙醇
,混匀后
-20℃放置
30 min。4 ℃12 000 ×g离心
10 min,弃去上清
,用
750 mL/ L乙醇洗涤
RNA胶样沉淀。
4 ℃
7500 ×g
离心
5 min ,室温放置
10～15 min干燥
,加入
60μL
D EPC水溶解
RNA沉淀后
280℃保存。若长期保
存
,RNA也可用无
RNA酶的去离子甲酰胺溶解。

1. 5　大鼠胰腺总
RNA定量及
A260/ 280比值鉴定　用
99μL DEPC水稀释总
RNA 1μL后
,用核酸
/蛋白质
微量定量仪检测大鼠胰腺总
RNA的含量及
A260/ 280
比值。

1. 6　10 g/L非变性的琼脂糖凝胶电泳检测大鼠胰
腺总
RNA　电泳
RNA所用器械如制胶的模具、梳
子、电泳槽等用
30 mL/L过氧化氢溶液浸泡
30 min,
用
DEPC水冲洗
3遍
,室温晾干备用。用对
RNA酶
有抑制作用的
D EPC水配置电泳缓冲液
TA E及其
他所有溶液。用新的
0. 5 ×TA E配制
10 g/L琼脂糖
凝胶
,溴化乙锭
( EB)直接加入凝胶中。点样时
,样品
RNA每
2. 5 μL加入
0. 5 μL6×上样缓冲液
,以
5 V/ cm电压电泳
30 min左右取出凝胶
,在凝胶成像
系统观察所提取的
RNA并拍照记录。
1. 7　RT2PCR法检测胰岛素
1、胰高血糖素、胰α2淀
粉酶和
β2actin的表达　按照
RevertaidTM First

5期李冬民
,任吴超
,王　璇
,等.利用
TRIzol ó试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总
RNA

Strand cDNA Synthesis Kit操作说明
,反转录合成
cDNA第一链。逆转录反应体系总体积
20μL,含胰
腺总
RNA 5 μg、M2MUL V逆转录酶
( 200 u/μL)
1μL。cDNA合成后保存在
-80℃冰箱中备用。

PCR扩增大鼠胰岛素
1、胰高血糖素、胰α2淀粉
酶和
β2actin :取高压灭菌的
0.2 mL的
PCR小管
4
支
,分别依次加入
10 ×PCR Buffer 2. 5 μL、dN TP
Mixture (各
2. 5 mmoL/L ) 2 μL、T aq DNA poly2
merase (5 u/μL) 0. 125μL、上下游引物各
1μL、cD2
NA 0.5 μL、灭菌蒸馏水
17. 875 μL,反应总体积
25μL。混匀后
,短暂离心。反应条件
:94 ℃
5 min ,
94 ℃1 min ,60. 3 ℃
1 min ,72 ℃
1 min延伸
,共
32
个循环
,最后
72 ℃10 min。产物鉴定
:取
20μL PCR
扩增产物在
10 g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定
,用凝胶
成像系统进行分析。

2　结　　果

2. 1　大鼠胰腺总
RNA定量、
A260/ 280比值及
10 g/L
非变性琼脂糖凝胶电泳结果　利用TRIzol ó试剂和
液氮提取的4只E3大鼠胰腺总RNA量可达到3～6
μg/ mg胰腺组织, A260/ 280比值在1. 75～1. 89之间。
在10 g/ L非变性琼脂糖凝胶电泳时,均可见28S及
18S条带,28S与18S条带灰度比值大于1. 8 ,并且在
28S和18S条带间可见明显的云雾状阴影(图1)。
RNA的提取是分子生物学中最常用的操作技术
之一。由于mRNA分子容易受到核糖核酸酶的破坏
而降解,加上核糖核酸酶广泛存在且极为稳定,因此
图
1　利用
TRIzol ó试剂和液氮提取的大鼠胰腺总
RNA
的
10 g/L非变性琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 10 g/L non2denatured agarose gel electrophoresis of
the total RNA isolated from pancreas of 4 E3 rats (1 -4)
with TRIzol ó reagent and liquid nitrogen

2. 2　RT2PCR法检测大鼠胰腺特异性基因的表达　
RT2PCR产物的
10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示
,大
鼠胰腺特异性表达基因胰岛素
1 (209 bp)、胰高血糖素
(492 bp)和胰
α2淀粉酶
(318 bp)以及管家基因
β2actin
(207 bp)均有清晰的条带
,未见非特异性扩增
(图
2)。
图
2　大鼠胰腺特异性表达基因
RT2PCR产物的
10 g/L
琼脂糖凝胶电泳

Fig. 2 RT2PCR analysis of products of pancreas2specific
genes from rat pancreas on 10 mL/ L agarose gel

M : DNA marker ; 1 : insulin 1 ; 2 : glucagon ; 3 : amylase ; 4 : beta2
actin
3　讨　　论

抑制核糖核酸酶的活性成为
RNA提取过程中的关
键问题。常规的组织和细胞
RNA的提取要求所有
与
RNA接触的仪器和装置都要严格处理
,以尽量减
少外源性
RNA酶污染造成的
mRNA降解
[2]。然而
对于易于自溶和富含内源性
RNA酶的胰腺组织的
RNA提取
,常规方法因不能完全抑制
RNA酶活性
而使胰腺
RNA的提取失败。目前
,仅有少量文献报
道胰腺组织的
RNA提取方法
,主要有两种
:①原位
胰腺导管灌注
RNA酶抑制剂
,然后提取
RNA[3] ; ②
将新鲜胰腺组织样品保存于
RNAlater2ICE中
,用液
氮或干冰速冻后
,提取
RNA[ 425]。第一种方法由于胰
腺导管灌注成功与否是提取胰腺完整
RNA关键
,因
而要求有很高的导管穿刺技术
,穿刺失败
,则前功尽
弃
,因而重复性差
;第二种方法也是目前研究中主要
用的方法
,但由于所用试剂较多
,步骤繁琐
,也不容易
在众多实验室推广。

商业所售的
TRIzol ó试剂提取总
RNA ,实质上
是酸性异硫氰酸胍
2酚2氯仿抽提一步法分离
RNA[ 6 ]。按照
TRIzol ó试剂操作步骤通过匀浆可非
常容易地提取多种组织的
RNA。如果直接用匀浆法
破碎富含核糖核酸酶的胰腺组织
,由于胰腺组织中的
细胞不容易迅速与裂解液
TRIzol ó试剂充分接触
,
RNA酶不能迅速被灭活而致提取的
RNA降解。因
此
,在抑制
RNA酶活性的同时
,使组织充分的裂解
,

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(医学版
)第
30卷

降解问题也就迎刃而解。
RNA酶活性在低温环境
(液氮、干冰
)或
RNA酶抑制剂中可被完全抑制
[728] ,
与干冰和
RNA酶抑制剂相比
,液氮具有更经济、易
于获得的优点。

在研究中
,我们利用
TRIzol ó试剂和液氮经过
50余次的实践
,最终成功提取了大鼠胰腺高质量的
总
RNA。总
RNA定量、
A260/ 280比值测定和
10 g/L
非变性琼脂糖凝胶电泳结果均提示
,所提取的大鼠胰
腺总
RNA没有降解
,完整性很好。为了进一步鉴定
所提取的
mRNA的质量及其是否可以用于下游实
验
,如
RT2PCR、Northern blotting、差异显示、抑制
性消减杂交、芯片等的研究
,我们选用
RT2PCR检测
了大鼠胰腺特异性基因的表达。结果显示
,不但管家
基因
β2actin条带清晰
,而且胰腺内分泌部特异性表
达基因胰岛素和胰高血糖素以及外分泌部特异性表
达基因胰
α2淀粉酶
,在
marker所指示的位置均有清
晰的条带
,没有非特异性扩增条带。在设计引物时
,
我们特别注意选择位于不同外显子上的上下游引物
,

从而保证了R T2PCR模板来源于mRNA反转录后
的cDNA ,而非DNA。
利用TRIzol ó和液氮提取大鼠胰腺高质量总
RNA的方法,不但经济、简单方便,而且重复性好。
但在具体操作中有几点要特别注意:①取胰腺组织的
动作一定要快;②胰腺组织在-80℃保存前一定要
用液氮速冻;③研磨过程中要及时添加液氮,保证胰
腺组织在研磨时一直浸在液氮中,防止mRNA降解;
④反转录时也要避免外源性RNA酶的污染。
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(编辑　卓选鹏
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(上接第
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(编辑　卓选鹏
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