液相色谱测甲醇含量.doc

实验二：液相色谱仪的硬件与软件操作
一、实验目的
1.了解高效液相色谱仪的基本结构及仪器掌握分离分析的基本原理；
2.学习掌握液相色谱仪的硬件操作及软件操作。
二、 实验原理
高效液相色谱仪为岛津液相色谱仪由SPD-20A检测器、LC-20AT泵（A、B泵）、微量进样器（50μL）、Atlantis C18色谱柱、CBM系统控制器等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程。各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到CBM系统控制器，数据以图谱形式打印出来。

三、 实验仪器与试剂
仪器：岛津液相色谱仪LC-20AT，SPD-20A检测器，LC-20AT泵，微量进样器（50 μL），Atlantis C18色谱柱
试剂：甲苯标准液（1000 ppm）、甲醇（AR），超纯水

四、实验步骤：
1. 准备
每次进样之前都应该用甲醇洗针15—20次
1.1流动相前处理
准备所需的流动相，用合适的0.45 μm滤膜过滤，超声脱气20 min（这里用的是流动相是甲醇（AR）(B)和超纯水(A)，分别用有机相系和水相系的0.45 µm滤膜过滤）。
1.2样品的配置
配制样品浓度为1000 ppm（也可在平衡系统时配制）。
甲苯标准液（1000 ppm）的配置：用移液管分别量取1 mL的甲苯用甲醇(AR)定容在10 mL的容量瓶中得到甲苯标准液（105 ppm）。然后用移液管量取1 mL刚定容的甲苯标液（105 ppm）再用甲醇（AR）定容在10 mL的容量瓶中得到甲苯标准液（104 ppm）。并用移液管量取1 mL刚定容的甲苯标准液（104 ppm）再用甲醇（AR）稀释定容在10 mL的容量瓶中，这样就配制成甲苯标准液（1000 ppm）。
1.3根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱和定量环。
（如图，注意箭头方向向上，切勿装反了柱子，损坏色谱柱。）

1.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
2. 高效液相色谱操作流程
2.1开机
接通电源，依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器。待泵和检测器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站（即电脑桌面上的CS-Light Real Time Analysis）。
2.2参数设定
2.2.1波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按[func]键接着按[Enter]键，用数字键输入所需波长值254 nm，按[Enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕。
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2.2.2流速设定：在A泵显示初始屏幕时，按[func]键，用数字键输入所需的流速（柱在线流速一般不超过1 ml/min，流速设置过大，柱压加大，影响柱效）。按[Enter]键确认。按[CE]键退出。

2.2.3流动相比例设定： 在A泵显示初始屏幕时，按[conc]键，用数字键输入流动相B的浓度百分数。本次实验设置流动相比例：水（A）20%、甲醇（B）80%。按[Enter]键确认。按[CE]键退出。
3. 更换流动相并排气泡
将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中，两个泵上部中间的黑色旋钮(排液阀)逆时针旋转90~180度，分别按A、B泵的[purge]键对泵进行冲泵，脱去流动相中的气泡。屏幕显示为“Purgeing line”,当冲泵完成后则恢复初始屏幕，各泵各冲2次；将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀.

4. 平衡系统
按《N2000色谱数据工作站操作规程》打开"在线色谱工作站"软件，输入实验信息并设定各项方法参数后，按下"数据收集"页的 [查看基线] 按钮。
4.1等度洗脱方式 ;
按A泵的[pump]键，A、B泵将同时启动，pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。检查各管路连接处是否漏液（可用滤纸擦拭检查），如漏液(压力值迅速下降)应予以排除。观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，则从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中，设流速为5ml/min，按[pump]键，冲洗3min后再按[pump]键停泵，重新接上柱并将流速重设为规定值。。观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min，噪声为<0.001mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。
5. 进样
5.1在桌面上找到CS-Light Real Time Analysis，双击图标。输入用户名Admin，点击确定。

5.2进样前在CS-Light Real Time Analysis中:点击“单次分析”，接着点击“样品记录”，在样品记录名称中输入所要检测得样品名称，然后点击“数据文件”选择该样品储存在哪里，最后在“数据储存的文件夹”后面输入该样品名称，点击确定。在信号采集菜单中设定停止时间（8 min）和延迟时间（5 min）。

5.3用甲醇清洗进样器后，并抽取试样液排除气泡至20 mL。接着按下右上方的[CBM调零]键以及检测器中的[Zero]键，同时迅速按下[开始]按钮，紧接着进样。

五、数据软件处理
1. 单次数据分析
1.1 在桌面双击“CS-Light Postrum Analysis”，点击确定按钮后，在“文件夹目录中”选中该样品记录双击鼠标，先打开保存的路径，找到样品记录甲苯的色谱峰。使用放大缩小按钮，调试图谱中的色谱峰全部完整显示在方框内

1.2 在谱图上单击鼠标右键的“显示设置”，在“显示设置”中选择“展开色谱”根据实际需要填写的“时间”和“强度”后点击确定。用鼠标点击“编辑”可根据需要选择改变“积分”中的“最小峰面积/高”、“斜率”等参数设置（通常改变一项参数，就能达到去除杂质峰的效果）。通常改变“最小峰面积”值比较快捷方便。然后又点击“定量”在“定量方法”中选择“面积归一法”，然后点击查看。复制谱图到Word文档，在谱图中点击鼠标右键选择“复制”；复制数据，单击鼠标左键全选，然后鼠标右键“复制表格到剪贴板”。在Word文档中全选中表格内容，单击“插入”—“表格”—“插入表格”。将处理后的谱图复制到Word文档，打印出来，观察记录的各峰保留时间，确定各个峰的归属，从而达到定性分离的目的。保存Word文档。

2. 多组数据进行比较
2.1同样方式，在桌面双击“CS-Light Postrum Analysis”，点击确定按钮后。先找到所需要对比的多组数据保存路径，选定打开。

2.2可以选中想要平移的谱线根据需要选择右上方的五组箭头按钮以及数字按钮，进行上下平移，可以使两组数据对比更显著。复制谱图到Word文档，在谱图中点击鼠标右键选择“复制”复制数据，单击鼠标左键全选，然后鼠标右键“复制表格到剪板”。 在Word文档全选中表格内容，单击“插入”—“表格”—“插入表格”。将处理后的谱图复制到Word文档，打印出来，观察记录的各峰保留时间，确定各个峰的归属，从而达到定性分离的目的。保存Word文档。

六、关机
分析完毕后，按A泵[conc]键—[Enter]—100%—[Enter],用100%甲醇冲洗泵1小时左右至基线平稳。先按[pump]键暂停，而后退出色谱工作站、关闭CBM系统控制器、主机。再自上而下依次关闭检测器、A泵和B泵的[power]键。