一种靶向CA IX的多肽化合物标记与初步评价.pdf
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1、第 卷 第期 年月同位素J o u r n a l o f I s o t o p e sV o l N o A u g 一种靶向C AI X的多肽化合物标记与初步评价杨子欣,王成,李捷,贾丽娜,张岚(中国科学院上海应用物理研究所,上海 ;中国科学院大学,北京 ;上海交通大学医学院附属仁济医院 核医学科,上海 )摘要:为合成靶向碳酸酐酶I X(C AI X)的多肽探针 G a D O T A C AI X P ,建立 G a D O TA C AI X P 的标记及质控方法,对p H和前体多肽D O T A C AI X P 浓度对标记率的影响进行研究,确定 G a D O T A C AI
2、X P 的标记条件为:反应体系的p H为 (n),多肽D O TA C A I X P 浓度为 m g/L(n),反应温度为 ,反应时间 m i n.产品为无色澄明液体、无可见异物,p H为(n),放化纯度 (n),比活度为 G B q/m o l(合成结束后)(n).探针的脂水分配系数为 (n),具有良好的亲水性.G a D O T A C AI X P 在生理盐水和胎牛血清中孵育h,放化纯度 ,具有良好的体外稳定性.G a D O T A C AI X P 无异常毒性.初步评价结果表明,G a D O T A C AI X P 标记方法简单、放化纯度高、性质稳定、无异常毒性,具有开展进一步
3、研究的价值.关键词:G a 标记;多肽;碳酸酐酶I X(C AI X)中图分类号:T L ;R 文献标志码:A文章编号:()收稿日期:;修回日期:通信作者:贾丽娜,张岚d o i:/t w s S y n t h e s i sa n dP r e l i m i n a r yE v a l u a t i o no fP e p t i d eC o m p o u n d sT a r g e t i n gC AI XYANGZ i x i n,WANGC h e n g,L I J i e,J I AL i n a,Z HANGL a n(S h a n g h a i I n s
4、t i t u t eo fA p p l i e dP h y s i c s,C h i n e s eA c a d e m yo fS c i e n c e s,S h a n g h a i ,C h i n a;U n i v e r s i t yo fC h i n e s eA c a d e m yo fS c i e n c e s,B e i j i n g ,C h i n a;D e p a r t m e n t o fN u c l e a rM e d i c i n e,R e n j iH o s p i t a l,S c h o o l o fM e
5、 d i c i n e,S h a n g h a i J i a oT o n gU n i v e r s i t y,S h a n g h a i ,C h i n a)A b s t r a c t:I no r d e r t o s y n t h e s i z e ap e p t i d e b a s e dc a r b o n i c a n h y d r a s e I X(C AI X)i m a g i n gp r o b e G a D O T A C AI X P ,t h e l a b e l i n ga n dq u a l i t yc o
6、n t r o lm e t h o d sw e r ed e v e l o p e d T h ee f f e c t so f r e a c t i o np Ha n dc o n c e n t r a t i o no f t h ep e p t i d eD O T A C A I X P o nt h e l a b e l i n gy i e l dw e r e s t u d i e d T h e r e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e c o n f i r m e da s:p Hv a l u e t o (n
7、),p e p t i d eD O T A C A I X P c o n c e n t r a t i o n t o m g/L(n),r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ,a n dr e a c t i o n t i m e m i n T h ep r o d u c tw a s c l e a r,c o l o r l e s s l i q u i d,w i t hn ov i s i b l ep a r t i c l e s T h ep Ho f t h ep r o d u c tw a s t o(n),t h er
8、a d i o c h e m i c a l p u r i t yo f G a D O T A C AI X P w a s (n),a n dt h es p e c i f i ca c t i v i t yo f G a D O T A C AI X P w a s G B q/m o l(e n do fs y n t h e s i s)(n)T h e l i p i d w a t e rp a r t i t i o nc o e f f i c i e n to ft h ep r o b ew a s (n)w h i c h i n d i c a t e d G
9、 a D O T A C AI X P w a sf a v o r a b l eh y d r o p h i l i c i t y G a D O T A C AI X P s h o w e dg o o d i nv i t r os t a b i l i t y i ns a l i n ea n df e t a lb o v i n es e r u ma t,a n dt h er a d i o c h e m i c a lp u r i t y w a s a f t e rh o u r s Wh i t em i c ed i dn o th a v ea b
10、n o r m a lb e h a v i o r si nu n d u et o x i c i t ye x p e r i m e n t s P r e l i m i n a r yr e s u l t so ft h es t u d ys h o w e dt h a tt h ep r o b e G a D O T A C AI X P i sw o r t h yo ff u r t h e rs t u d yw i t has i m p l e l a b e l i n gm e t h o d,h i g hr a d i o c h e m i c a l
11、 p u r i t y,g o o d i nv i t r os t a b i l i t ya n df a v o r a b l eb i o s e c u r i t y K e yw o r d s:G a l a b e l i n g;p e p t i d e;c a r b o n i ca n h y d r a s e I X(C AI X)碳酸酐酶I X(c a r b o n i ca n h y d r a s eI X,C AI X)是一种与肿瘤相关的跨膜金属酶.C AI X通过调节C O和HO生成碳酸氢盐与质子的可逆反应降低肿瘤细胞外环境的p H,肿瘤细
12、胞黏附力也随之降低,该现象促进了肿瘤的转移和侵袭.除胃肠黏膜组织外,正常组织中几乎没有C AI X的表达.C AI X在多种实体瘤中过表达,如肾癌、宫颈癌、头颈部癌、乳腺癌和肺癌等,因此C AI X是肿瘤诊断的理想靶点.近年来,以C AI X为靶点的小分子、抗体和多肽 类 放 射 性 分 子 影 像 探 针 均 被 广 泛 报道 .小分子抑制剂类探针有着较高的结合亲和力和较短的血液半衰期,使其成为开发靶向C AI X探针时有吸引力的候选药物.但由于碳酸酐酶亚型之间的高度同源性,小分子抑制剂类探针开发时面临着靶向特异性的重要挑战.目前小分子探针 F VM 已经进入临床实验,然而更多研究显示该探针
13、的肿瘤摄取与背景组织相当.L a u等合成了小分子探针 F Am B F A B S,通过P E T/C T显像实现了HT 肿瘤的可视化,但图像显示靶/非靶比值较低.抗体类探针具有优异的靶向特异性,且在非靶组织中呈现低摄取,已被广泛应用于成像领域.多种靶向C AI X的抗体探针已进入 临 床 实 验 阶 段,如 I g i r e n t u x i m a b的P E T/C T显像可以准确无创地识别肾透明细胞癌的病灶,可为肾癌患者制定诊疗计划提供帮助.但由于抗体类探针分子量较大,肿瘤穿透能力相对较差且血液清除缓慢,导致早期显像的靶/非靶比值低,以及体内代谢时间长引起的高辐射毒性.多肽类探针
14、分子量适中,靶向性良好,并能实现在血液中快速清除,具有良好的药代动力学性质,因此放射性标记肽在核医学影像中越来越受到关注,但靶向C AI X多肽类探针的报道较少.课题组曾利用点击化学方法制备放射性标记肽 F C AI X P ,m i c r oP E T/C T显像结果显示,探针可以特异性的识别肿瘤中C AI X阳性区域,但腹部器官对该探针具有较高的摄取,不利于腹部转移灶的诊断,这可能是该探针稳定性差导致.本研究针对多肽探针 F C AI X P 体内外稳定性差的问题,对多肽结构进行进一步的优化和修饰,并利用正电子核素 G a进行标记.对 G a D O T A C AI X P 的 制 备
15、方法、质量控制和体外稳定性进行初步研究,以期获得一种多肽类的C AI X靶向放射性分子影像探针.实验设备与材料 实验设备 G e/G a发生器:美国E c k e r t&Z i e g l e r公司;C R C t R活度计:北京派特生物技术有限公司;高速离心机:c e n t r i f u g e R,德国E p p e n d o r f公司;高效液相色谱仪:系列,美国 安 捷 伦 公 司;分 析 用C 柱:Z O R B A XE c l i p s eX B DC 柱,mm mm,m,美国安捷伦公司;放射性薄层色谱扫描仪(R a d i o T L C):美国E c k e r
16、t&Z i e g l e r公司;自动同 位 素第 卷计数仪:美国P e r k i nE l m e r公司;澄明度检测仪:天津市精拓仪器科技有限公司.实验材料多肽D O T A C AI X P :纯度,强耀生物科技有限公司;乙酸钠(N a OA c):纯度 ,阿拉丁公司;m o l/L HC l溶液:南京化学试剂股份有限公司;正辛醇、乙腈和三氟乙酸(T F A):G R级,美国S i g m a公司;生理盐水:安徽双鹤药业有限责任公司;L i g h tC 小柱:美国W a t e r s公司;I T L C S G色 谱纸:美国安捷伦公司.其他实验试剂及材料均购买自国药集团化学试剂有
17、限公司.实验方法 G a D O T A C AI X P 的放射化学合成将前体多肽D O T A C AI X P 溶于生理盐水,制成浓度为m g/m L的溶液备用.用m L m o l/L HC l淋洗 G e/G a发生器,收集 G a的淋洗液以备标记使用.G a D O T A C AI X P 的 合 成 方 法示于图.在 G a HC l淋 洗液 中,加 入 多 肽D O T A C AI X P 溶液,然后用m o l/L乙酸钠溶液调节反应体系的p H,加热振荡反应.反应结束后冷却,反应溶液通过L i g h tC 柱,用 m L超纯水洗去杂质和盐分,用m L体积分数为 的乙醇淋
18、洗L i g h tC 柱,收集产品并用生理盐水稀释,通过 m一次性无菌滤器过滤后备用.G a D O T A C AI X P 的质量控制取产品适量,目视观察产品的颜色、澄清度,在澄明度仪下检测产品的可见异物;利用广泛p H试纸测定产品的p H;采用R a d i o T L C和R a d i o H P L C法对产品进行鉴别并测定探针的放射化学纯度;采用R a d i o H P L C法测定产品的比活度.本研究中比活度的计算方法为:探针比活度探针的活度/活性分子的物质的量(G B q/m o l).R a d i o T L C分 析 方 法 如 下:以 体 积 比 为的甲醇和水溶液
19、配制的m o l/L的乙酸铵溶液作为展开剂,以I T L C S G色谱纸为固定相,展开距离为c m.R a d i o H P L C分析方法如下:流动相A为HO(T F A),B为乙腈.采用等梯度洗脱:m i n,B,流速为m L/m i n,紫外检测波长为 n m,进样量为 L,柱温.脂水分配系数(L o gP)将 L纯化后的 G a D O T A C AI X P (MB q)产品加入到等体积的正辛醇中,混合物在室温下充分混匀,经离心后静置分层.从水相和有机相各取样 L分别置于计数管中,用计数器测定放射性计数.共进行六组平行实验,采用下面公式计算L o gP l o g(正辛醇/生理
20、盐水).其中正辛醇为正辛醇层取样中的计数,生理盐水为生理盐水层取样中的计数.体外稳定性将 L探针 G a D O T A C AI X P (约 MB q)溶液,分别加入m L生理盐水和m L胎牛血清中,下孵育,分别在 、h取样,采用R a d i o T L C检测其放化纯度,以评价其体外稳定性.异常毒性取正常小鼠(I C R小鼠,雄性,江苏华创信诺医药 科 技 有 限 公 司),体 重 g(n),每只小鼠在s内经静脉注射 L G a D O T A C AI X P (MB q)产品溶液,给药后饲养观察 h,考察小鼠的存活情况.图 G a D O T A C AI X P 的合成F i g
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