乙酸型甲烷八叠球菌细胞工厂的设计与构建研究进展.pdf

第 卷第 期 年 月生 物 加 工 过 程 ：收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学青年基金（）；山东省自然科学优秀青年基金（）；江苏省自然科学青年基金（）；山东大学齐鲁青年学者人才计划作者简介：严云峰（），男，河南灵宝人，博士研究生，研究方向：产甲烷古菌胞外电子传递与细胞工厂构建；闫震（联系人），教授，：引文格式：严云峰，闫震乙酸型甲烷八叠球菌细胞工厂的设计与构建研究进展生物加工过程，（）：，（）：乙酸型甲烷八叠球菌细胞工厂的设计与构建研究进展严云峰，闫 震，（山东大学 环境科学与工程学院 山东省水环境污染控制与资源化重点实验室，山东 青岛；山东大学苏州研究院，江苏 苏州）摘 要：在整个地球演化历史过程中，产甲烷古菌在生物地球碳循环中一直扮演着重要角色。据报道，约三分之二的地球生物甲烷通量来自乙酸型产甲烷途径，乙酸型甲烷八叠球菌（）是目前发现为数不多的可以进行乙酸型产甲烷途径的模式产甲烷古菌，对 代谢途径的解析、改造和应用可为温室气体甲烷的减排与其作为能源的合理利用提供新思路。本文综述了 的产甲烷代谢途径、遗传改造策略、细胞工厂构建 个方面的研究进展，分析了 与其他进行乙酸型产甲烷代谢的产甲烷古菌在以上三方面的异同，并对进一步设计和构建其作为微生物细胞工厂所面临的问题与挑战进行了展望。关键词：乙酸型甲烷八叠球菌；产甲烷代谢；遗传改造；细胞工厂；产甲烷古菌；生物甲烷中图分类号：；文章编号：（），（，；，）：，：；甲烷既是可再生的清洁能源，也是第二大温室气体，全球甲烷排放量中有超过 来自地球厌氧环境中栖息的产甲烷古菌。作为地球上最古老的生命之一，产甲烷古菌在生物地球碳循环中扮演着重要角色，它的生长代谢及其产甲烷过程与地球气候的变化息息相关。目前已知的生物甲烷排放主要来自乙酸型与 型两条产甲烷途径，而乙酸型产甲烷途径贡献了其中的三分之二。因此，深刻认识乙酸型产甲烷途径的微观作用机制，可为甲烷的减排及其作为能源的合理利用奠定理论基础。乙 酸 型 甲 烷 八 叠 球 菌（）是一种严格厌氧的产甲烷古菌，属于广古菌门、甲烷微菌纲、甲烷八叠球菌科、甲烷八叠球菌属。于 年从美国加利福尼亚州附近海域的海洋沉积物中分离获得，数十年来，已成为研究乙酸型产甲烷途径的模式菌株。不仅如此，由于代谢途径的多样性与可遗传操控性，表现出作为开发合成生物学底盘和构建微生物细胞工厂的巨大潜力。因此，笔者在综述 的产甲烷代谢途径、遗传改造策略和细胞工厂构建 个方面研究进展的基础上，分析 与其他进行乙酸型产甲烷代谢的产甲烷古菌在这三方面的异同，并对进一步设计和构建其作为微生物细胞工厂所面临的问题与挑战进行展望。乙酸型产甲烷途径尽管乙酸型产甲烷途径贡献了地球上约三分之二的生物甲烷排放，但是目前分离得到的可以进行该途径代谢的产甲烷古菌仅限于甲烷八叠球菌属（）与甲烷丝菌属（），。乙酸型产甲烷代谢途径及 种能量代谢模式见图。与其他乙酸型产甲烷古菌在代谢途径方面呈现一致性（图（）。乙酸分子首先需要从胞外跨膜转运至胞内，在目前分离的所有乙酸型产甲烷古菌的基因组内都发现了乙酸转运蛋白基因。转运乙酸的分子机制在许多乙酸营养型细菌中已被深入研究，即通过质子的协同转运来实现乙酸分子的跨膜转运。乙酸型产甲烷途径的第一步是将乙酸活化为乙酰辅酶。属代表菌株，如、与，都能利用乙酸激酶（）和磷酸转乙酰酶（）催化乙酸转化为乙酰 辅 酶，而 属 代 表 菌 株，如，却利用乙酰辅酶 合成酶（）催化该反应。据推断，编码 与 的基因是在 亿年前由梭状芽孢杆菌属编码 的基因水平转移至 获得，因此它们不仅具有序列同源性，在催化机制方面也较为相似。第二步为乙酰辅酶 的裂解，由一氧化碳脱氢酶 乙酰辅酶 合成酶复合体（）催化剪切乙酰辅酶 的 键和 键，将甲基基团转移至辅因子四氢八叠甲烷蝶呤（），生成。同时，利用氧化型铁氧还原蛋白（）作为电子受体，接受羰基（）氧化为时产生的电子，生成还原型的铁氧还原蛋白（）。第三步为甲基的转移，由膜复合体甲基转移酶（）催化甲基由 转移至辅酶（），生成甲基辅酶（），该步反应可以耦合膜复合体 产生跨膜钠离子梯度（细胞外浓度高），用于 的合成。第四步为甲烷生成，由 还原酶（）催化 脱甲基反应生成甲烷，该反应利用辅酶（）作为电子供体，与 的脱甲基产物 发生氧化还原反应，最终生成二硫键化合物。作为乙酸型产甲烷途径的几个关键酶，来自 的、与 都被用于研究产甲烷代谢各步催化反应机制。由于篇幅有限，在催化机制方面本文不做详细介绍。乙酸型产甲烷代谢是典型的发酵模式生长代谢途径，即乙酸裂解产生的电子通过细胞膜电子传递链传递至中间代谢产物，在电子传递过程中耦合生成，为产甲烷古菌的生长提供能量。通过对 与 属代表菌株研究，目前总共发现了 种乙酸型产甲烷途径耦合能量代谢的模式，所进行的电子传递是其中一种的代表。对于 种能量代谢模式，电子供体与电子受体分别为上述乙酸型产甲烷途径的代谢产物 与，差异之处 第 期严云峰等：乙酸型甲烷八叠球菌细胞工厂的设计与构建研究进展图 乙酸型产甲烷代谢途径及 种能量代谢模式（修改自文献，）（，）在于细胞膜的电子传递过程。对于可以利用 的 属菌株，如 与，携带电子传递至氢酶膜复合体，该过程既耦合质子由胞内向胞外的跨膜转运，形成跨膜质子梯度，又耦合胞内质子被还原为。产生的可扩散至胞外，被另一个氢酶复合体 在胞外重新氧化为质子，进一步贡献了跨膜质子梯度。氧化 产生的电子经含有醌基的细胞膜电子穿梭体甲基吩嗪（）传递至异化二硫键还原复合体，该电子传递过程也会耦合质子的跨膜转运。将接受的电子传递至胞内的电子受体，生成的 与 可作为产甲烷途径第三步和第四步，也就是 与 催化反应的底物。上述细胞膜电子传递过程所产生的跨膜质子梯度与产甲烷途径第三步膜复合体 所产生的跨膜钠离子梯度驱动 合成酶合成生 物 加 工 过 程 第 卷，为产甲烷古菌的生长提供能量（图（）。对于不能利用 的 ，缺少编码氢酶复合体 与 的基因，但存在一类可以编码固氮细菌膜复合体 的基因，可接受 携带的电子并传递至，同时发现该电子传递过程可以耦合钠离子的跨膜转运（图（），随后的电子传递过 程 与 氢 型 电 子 传 递 一 致。虽 然 属代表菌株，既缺少编码氢酶复合体 与 的基因，也缺少编码复合体 的基因，但是其体内存在一类编码 脱氢酶复合体 的基因（图（）。等发现，复合体在甲基营养型产甲烷途径中参与膜电子传递过程并产生跨膜质子梯度，但是否在 属的乙酸型产甲烷古菌体内行使相似的功能有待生化与遗传实验验证。除了电子传递磷酸化的储能方式外，在 的 菌株基因组内发现存在一类可催化电子歧化反应酶复合体 的基因。电子歧化反应可以耦合热力学吸能与放能电子传递，是近年来在某些厌氧微生物体内发现的一种全新的生物储能方式。等通过对 的 酶催化反应过程分析发现，可催化以辅酶 为电子供体、与 为电子受体的电子歧化传递，并推测该电子传递在自然环境中的低乙酸浓度条件下优化 的能量存储至关重要。遗传改造策略 传统的基因编辑方法在生化和生理学研究基础之上，对乙酸型产甲烷古菌的进一步了解与改造需要借助分子生物学的遗 传 改 造 策 略。不 同 于 其 他 产 甲 烷 古 菌，属的乙酸型产甲烷古菌不仅能利用多种 底 物 进 行 生 长 代 谢 产 甲 烷，而 且 和 作为遗传操作的模式产甲烷古菌，还能在固体培养基中很好地维持单细胞形态，这些特征都为乙酸型产甲烷古菌的遗传改造提供了便利。一方面，传统的遗传改造策略是利用片段同源重组或位点特异性整合来完成对宿主染色体上基因的敲除、插入或置换（图）。通常有 种方法可用于构建靶基因敲除菌株（图（）和图（），一种是利用 衍生质粒经过两次同源重组实现基因的无标记敲除（表），前提是靶基因是非必需的且敲除后生长速率不受影响，理论上基因成功敲除的概率为；另外一种是先利用线性化的 衍生质粒经两侧同源重组进行靶基因敲除，再导入 质粒，利用翻转重组酶（）识别和重组两侧的特异性位点（），从而去除筛选和反筛选标记基因（）编码的操纵子标记，特点是“疤痕”将保留在删除位置（表）。目的基因在染色体上的插入通常利用位点特异性整合的方式将整个质粒整合到特定的 位点（图 （），通常选用 衍生质粒或 系列衍生质粒，特点是均可以通过 位点 特 异 性 重 组 整 合 至 基 因 组内。相应地，要求宿主菌株应携带组成型表达的 位点特异性重组酶基因（）和整合到染色体 上的 位点。的基因进行阳性检测对于染色体上关键基因的确定至关重要。使用四环素（）依赖性启动子（）对检测基因启动子进行原位置换，利用四环素抗性阻遏蛋白（）与启动子内的操作子序列（）作用机制来控制检测基因的表达水平，再比较在基因不同表达水平下菌体生长情况来确定基因的必要性，。启 动 子 原 位 置 换 是 利 用 线 性 化 的 系列衍生质粒通过两侧同源重组来实现。同样地，重组时利用的 操纵子标记可通过导入 质粒来去除，从而实现无标记的遗传改造（图（）。另一方面，传统的遗传改造策略是利用可自主复制的穿梭载体在不整合至宿主基因组的情况下完成目的基因的表达。研究人员以 自身的 质粒为基础，开发出一系列可在 中自主复制的穿梭载体，在 单个细胞中利用 复制子可获得约 个拷贝数，。以常用的穿梭质粒 为例，质粒上含有可在 中复制的 复制子、可供筛选的氨苄青霉素抗性基因以及可在 中复制的 复制子和可供筛选的嘌呤霉素抗性基因（表）。同时，质粒还提供一个大型的多克隆位点方便目的基因相关表达原件的插入。需要注意的是，为避免自主复制质粒整合到染色体上，转化时所用的宿主应缺失 基因且不包含任何 附着位点。另外，传统的遗传改造策略还包括通过改造和优化核心启动子及核糖体结合序列（）增强蛋白 第 期严云峰等：乙酸型甲烷八叠球菌细胞工厂的设计与构建研究进展图 传统遗传改造策略（修改自文献）（）的表达。在古菌和真核生物中，转录起始速率由相同的 个核心启动子元件控制，分别是 盒、聚合酶转录因子识别元件（）和转录起始位点（）。另外，古菌中 的翻译启动与细菌类似，都是基于 序列识别。等通过将合理设计的突变引入 的 亚基（）基因的核心启动子和 中，建立了对 蛋白质水平的表达调控，结果发现：通过改造核心启动子和核糖体结合位点可使 的调控蛋白质水平在 倍范围内发生可预测的变化。这一发现为乙酸型产甲烷菌代谢工程改造提供了更精准的调控策略。介导的基因编辑技术 技术具有精准、高效和脱靶率低等特点，已经广泛应用于真核和原核生物的基因编辑。近年来，针对产甲烷古菌的 生 物 加 工 过 程 第 卷表 甲烷八叠球菌遗传改造过程中所用到的质粒 质粒名称基因型用途文献、构建基因敲除菌株、构建基因敲除菌株、表达 重组酶、构建基因插入和表达菌株、构建基因插入和表达菌株、（）染色体上基因必需性测试、自主复制载体基因编辑技术已成功应用于 与 型产甲烷古菌 改造，这无疑为产甲烷古菌的遗传改造提供了新策略。等研究发现，利用 介导的同源定向修复手段进行基因的插入和敲除是非常精准且高效的（图（）。一方面，所有的转化子在基因组内都能发生所需的突变且没有脱靶活性；另一方面，遗传改造所需时间由传统方法的 周缩短至 周，将多个 在同一转录本中表达，进而引导 在不影响转化效率的前提下同时对宿主染色体引入多个突变，极大地减少了构建复杂菌株所需的时间。另外，通过设置合适的对照实验，基于 的质粒转化结果就可以很好地确定染色体上基因的必要性，还可以操纵必需基因，如添加串联亲和标签等。在 中，以 基因编辑技术应用为例，的表达、以及同源修复片段（）的合成都依赖于 系列质粒的构建。完整的 衍生质粒上除了关键的 复制子和 筛选标记外，还包括（）引导表达的化脓链球菌、甲醇诱导型启动子 介导转录的 和同源修复片段（切割位点两侧各 的同源序列）。如果采用脂质体介导的方法转化质粒并以自主复制的方式在菌体内表达，必须注意的是为避免质粒整合至基因组内，转化时所用的宿主应缺失 基因且不包含任何 附着位点。此外，近期 等研究发现，通过 引导 特异性切割产生致命的 双链断裂（）不仅可以通过修复片段的同源 重 组 来 进 行 基 因 编 辑，而 且 可 以 通 过 与 非同源末端连接（）机制共表达的方式在微同源区产生长度不等的缺失来完成遗传改造。在产甲烷古菌中的基因编辑策略除了利用 系统的 引导 切割和定向修复进行基因的缺失和插入之外，还可以利用 引导存在缺陷或失活的 与 结合（），在不产生切割的前提下阻断基因转录的起始和延伸来抑制基因表达（图（）。等通过将 衍生质粒中的 替换为 来制备目的 系列衍生质粒，并以 中参与固氮的基因簇为靶向评估 介导的靶基因抑制效果，结果发现：当 靶向固氮基因（）的两个独立区域（启动子 和关键基因）时，转录本的丰度降低幅度，的固氮功能丧失；当 靶向固氮酶辅因子合成必需基因（）时，转录的本丰度降低幅度，固氮功能未完全丧失；当 靶向 阻遏子编码基因（）时，操纵子转录本的丰度增加，可以通过固氮作用正常生长。这一系列结果揭示了 系统在靶基因抑制方面的突出效果，为产甲烷古菌的遗传改造提供了新思路和新方法。总的来说，产甲烷古菌的遗传改造是一个相对较新的发展领域，其独特的代谢过程和重要的生态学意义使其成为近年来遗传研究的热点。此外，产甲烷古菌可以作为整个古菌域的遗传改造模型，针对现有基因编辑方法的优化改进以及扩大产甲烷古菌遗传改造的研究范围都有着较好的研究前景。以 为底盘细胞的细胞工厂构建 基于产甲烷途径构建细胞工厂厌氧消化是实现有机废弃物资源化最有效的 第 期严云峰等：乙酸型甲烷八叠球菌细胞工厂的设计与构建研究进展图 和 遗传改造机制（修改自文献，）（，）技术之一，实现形式是产生以甲烷为主要成分的生物沼气，对环境污染物处理和可再生能源生产具有重要意义。厌氧消化最终的产甲烷阶段由产甲烷古菌负责，这也是整个厌氧消化反应的关键限速和控制步骤。然而，多数产甲烷古菌对环境因素极其敏感，如 的突然变化、盐或有机物浓度的增加、负载速率的改变或有毒化合物的引入，通常会导致系统故障，这会极大地影响产甲烷阶段的代谢速率。与其他产甲烷古菌相比，属菌株对所处环境的变化有着更强的抵抗性。等发现，与 可耐受的总铵质量浓度高达 、盐质量浓度高达 （以计）以及乙酸盐质量浓度高达 ，并且可以抵抗 个单位的 变化。基于这些特点，当环境因素影响生物沼气生成的稳定性和高效性时，可将 作为合适的生物增强型接种物强化厌氧消化过程中的甲烷再生。随着以 为底盘微生物的遗传改造技术的快速发展，以 纯培养物作为微生物细胞工厂的研究也越来越受到关注。等通过引入来源于 的编码广泛特异性酯酶基因，将 的酯酶活性提高 倍，使其将源自乙酸甲酯和丙酸甲酯的甲基转化为甲烷，进一步增加了 可用底物的范围。等利用 作为细胞工厂合成化工原料异戊二烯：其一是将异戊二烯合成酶基因 导入 中，在以甲醇为底物的分批培养条件下，的异戊二烯产量是细菌 的 倍，是自养型蓝细菌 的 倍；其二是将 基因导入 中后发现，能以甲醇或者 为底物生产异戊二烯，不过产率分别为（底物为甲醇）的 和 。近期，等通过敲除编码 产甲烷途径的关键酶 的基因与适应性进化培养，可重构其产甲烷生长代谢途径为 依赖型的产乙酸生长代谢途径，这对于进一步了解产甲烷途径的功能进化过程以及拓宽产甲烷古菌作为微生物细胞工厂的应用范围具有重要意义。基于反向产甲烷途径构建细胞工厂在厌氧发酵链的末端，产甲烷古菌产生的生物甲烷，一部分被同处于厌氧环境的甲烷氧化古菌（）所消耗，未被消耗的部分排放入大气，若能有效利用 在厌氧环境中作为“甲烷汇”的重要功能，就可缓解甲烷排放入大气对地球造成的温室效应。所进行的甲烷厌氧氧化属于热力学吸能反应，需要耦合体外电子受体，如硝酸盐、三价铁或四价锰的还原才能进行，这造成 生 物 加 工 过 程 第 卷生长极其缓慢，目前还没有纯培养物被分离，更没有可进行遗传改造的分子生物学技术，所以很难开发作为细胞工厂进行甲烷生物转化研究。由于 与产甲烷古菌起源于广古菌门共同的祖先，应用基于宏组学技术对 的富集培养物研究发现，与产甲烷途径及其能量代谢相关的关键基因在 宏基因组也普遍存在并具有较高的表达丰度，基于此，被认为采用反向的产甲烷途径进行 甲 烷 厌 氧 氧 化。系 统 发 育 进 化 分 析 发 现 与 的若干分支亲缘关系较近，因此以 与 等纯菌株为底盘细胞研究反向产甲烷途径提供了理想平台。等通过生物化学技术研究 与胞外三价铁的电子互营机制，揭示了胞外三价铁驱动甲烷厌氧氧化的分子机制（图）。近期，等研究发现，可利用三价铁或阳性电极作为电子受体进行甲烷厌氧氧化，但是否可以进行以甲烷作为唯一碳源的生长代谢还有待进一步研究。图中左侧为 产甲烷代谢途径，右侧为 反向产甲烷代谢途径。其中反应（）是反向产甲烷代谢途径的第一步，反应不可逆且需辅以三价铁作为电子受体；反向产甲烷途径的反应（）中所需 来自 氧化过程中产生；其余反应步骤均可逆图 产甲烷代谢途径和反向产甲烷途径的比较（修改自文献）（）利用遗传改造技术构建以 为底盘细胞的甲烷转化细胞工厂也在如火如荼地进行中。等将 编码反向产甲烷代谢途径第一步催化甲烷氧 化 的 关 键 酶 的 基 因 克 隆 至 以强化甲烷厌氧氧化，辅以三价铁作为电子受体，可实现以 作为微生物细胞工厂转化甲烷为生物燃料前体乙酸。等将 中编码 羟基丁酰辅酶 脱氢酶的基因（）克隆至甲烷氧化强化型 中 以 此 合 成 乳 酸，最 高 获 得 约 的乳酸产量。另外，等还将甲烷氧化强化型 、电活性细菌 以及经甲烷驯化的污泥共培养，可将甲烷转化为电能，具体机制为 利用反向产甲烷途径捕获甲烷并产生乙酸，甲烷驯化污泥中的微生物（如 ），通过提供电子穿梭体促进电子转移，以乙酸盐来产生电子，以创建微生物燃料电池，将甲烷直接转化为电能。表 总结了近年来将乙酸型甲烷八叠球菌作为细胞工厂的应用实例。第 期严云峰等：乙酸型甲烷八叠球菌细胞工厂的设计与构建研究进展表 乙酸型甲烷八叠球菌作为细胞工厂的应用 应用实验方案结果文献产生物沼气将 用作生物增强型接种物对环境变化耐受性增强拓宽可利用底物将 基因克隆至 酯酶活性提高 倍合成异戊二烯将 基因克隆至 约 的总碳通量用于合成 的异戊二烯重构为产乙酸代谢敲除 中编码 的基因并适应性进化超过 的 用于合成（）的乙酸逆转产甲烷途径胞外添加三价铁作为电子受体以甲烷作为唯一碳源生长合成乙酸将 的基因克隆至 ，辅以三价铁作为电子受体乙酸产量（）合成乳酸将 基因克隆至 乳酸产量（）产电将 和 以及经甲烷驯化的污泥共培养电流密度可达 结论与展望详细解析乙酸型产甲烷途径及其能量代谢过程，不仅有重要的环境生态意义，也是开发以乙酸型产甲烷古菌作为底盘细胞构建微生物细胞工厂的理论基础。作为乙酸型产甲烷古菌的模式菌株，具有代谢途径多样、遗传调控策略清晰、纯培养技术成熟等优点，这些都为以 为细胞工厂开发甲烷的生产及其高值化转化技术提供了可能。尽管如此，与其他模式微生物相比，相关的分子遗传改造技术开发和细胞工厂构建还处于初级阶段，仍然面临诸多问题与挑战。首先，与其他模式微生物相比，的生长代谢效率偏低，特别是 的培养、分子遗传操控等技术都需要在严格厌氧条件下进行，这些是开发更为方便快捷的分子遗传改造技术的瓶颈，严重限制了以它作为细胞工厂来生产目标产物的合成效率。其次，对 进行遗传改造的分子生物学工具包还仅为国外的个别课题组开发并拥有，并未由 等 公 益 性 组 织 共 享，这 对 于 构 建 细胞工厂带来了很多的不便。最后，单一的 细胞工厂稳定性较低、环境适应能力较弱、不易扩大培养规模，所以 作为微生物细胞工厂的巨大潜力还有待进一步发掘。为解决 生长效率慢的问题，可利用基因组尺度代谢网络模型与 同位素示踪等技术分析碳代谢流，从全局规模系统地认识代谢网络，预测限制甲烷代谢效率的可调控靶点，再利用代谢工程技术，如启动子工程、调控元件等，平衡各代谢流的基因表达，优化控制各条代谢流的通量，方可实现对于产甲烷和甲烷转化代谢效率的理想优化。为解决无法从公共渠道获得 的遗传改造分子生物工具包的问题，可以尝试利用体外合成的、及 共转化的方式替代复杂的质粒构建过程来进行古菌基因编辑，特别地，这一方法已成功应用于真菌和酵母等细胞的遗传改造。最后，为解决单一 细胞工厂稳定性差、环境适应能力弱的问题，可将 与 其 他 微 生 物 共 培 养，构 建 以 为 中 心 的 合 成 微 生 物 群 落，通 过 与其他微生物的营养互营或种间电子传递过程，提升微生物组细胞工厂的稳定性，缓解环境因子对于 自身代谢生长的负面影响，拓展 作为细胞工厂的应用范围。参考文献：，（）：，（）：，（）：生 物 加 工 过 程 第 卷 ，：，：，（）：，（）：，（）：承磊，郑珍珍，王聪，等产甲烷古菌研究进展微生物学通报，（）：，（）：，（）：，“（）”，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：方晓瑜，李家宝，芮俊鹏，等产甲烷生化代谢途径研究进展应用与环境生物学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，第 期严云峰等：乙酸型甲烷八叠球菌细胞工厂的设计与构建研究进展 ：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：蔡朝阳，何崭飞，胡宝兰甲烷氧化菌分类及代谢途径研究进展浙江大学学报，（）：刘俊霞，陈槐，薛丹，等微生物介导的甲烷厌氧氧化过程及其影响 因 子 研 究 进 展 生 态 学 杂 志，（）：，（），（）：，：，（）：，（）：，（）：（责任编辑 荀志金）生 物 加 工 过 程 第 卷