银杏素通过抑制Nrf2_HO-1_GPX4信号通路诱导神经胶质瘤细胞铁死亡.pdf

D3366银杏素通过抑制Nrf2/HO-1/CPX4信号通路诱导神经胶质瘤细胞铁死亡赵印生，等银杏素通过抑制Nrf2/HO1/G PX4信号通路诱导神经胶质瘤细胞铁死亡赵印生，鲍龙，孙铁霖，李洋锦州医科大学附属第一医院神经外科，辽宁锦州12 10 0 0【摘要】目的：探讨银杏素抑制核因子E2相关因子2（Nrf2）/血红素氧合酶-1（HO-1)/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）信号通路,对神经胶质瘤细胞铁死亡的影响。方法：以人神经胶质瘤细胞U251为研究对象，分为对照组、银杏素低（银杏素-L,2.5mol/L）、中（银杏素-M,5mol/L）、高（银杏素-H,10umol/L)浓度组、Nrf2激活剂-SFN（莱硫烷,2 0 molSFN）组、银杏素-H+SFN（10 mol/L银杏素+2 0 molSFN)组;流式细胞仪、CCK-8、D CFH-D A、W e s t e r n b l o t 分别检测U251细胞的细胞凋亡率、增殖水平、活性氧（ROS)含量以及Nrf2/HO-1/GPX4通路蛋白表达水平；铁离子检测试剂检测细胞内铁含量；透射电镜观察细胞超微结构。结果：与对照组相比，银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组线粒体膜厚度及改变，增殖率、Nrf2、H O-1、G PX4蛋白表达均显著下降，凋亡率、ROS及铁含量显著增加（P0.05）；与银杏素-H组相比,银杏素-H+SFN组增殖率、Nrf2、H O-1、G PX4蛋白表达均显著增加,调亡率、ROS及铁含量显著下降（P0.05）;与SFN组相比，银杏素-H+SFN组增殖率、Nrf2、H O-1、G PX4蛋白表达均显著下降，调亡率、ROS及铁含量显著增加（P0.05）。结论：银杏素通过抑制Nrf2/HO-1/GPX4信号通路，可以诱导神经胶质瘤细胞铁死亡，进而发挥抗肿瘤的作用。【关键词】核因子E2相关因子2/血红素氧合酶1/谷胱甘肽过氧化物酶4；银杏素；神经胶质瘤；铁死亡【中图分类号】R730.264【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.18.006【文章编号】16 7 2-4992-（2 0 2 3)18-336 6-0 5Ginkgetin induces ferroptosis of glioma cells by inhibiting Nr2/HO-1/GPX4 signalingpathwayHAO Yinsheng,BAO Long,SUN Tielin,LI Yangepartment of Neurosurgery,the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121000,China.【A b s t r a c t 1 Objective:To investigate the impact of Ginkgetin on ferroptosis of glioma cells by inhibiting nuclearfactor E2-related factor 2(Nrf2)/heme oxygenase-1(HO-1)/glutathione peroxidase 4(GPX4)signaling path-way.Methods:Human glioma cells U251 were regarded as the research objects,and they were separated into controlgroup,low(Ginkgetin-L,2.5 mol/L),medium(Ginkgetin-M,5 mol/L),and high(Ginkgetin-H,10 mol/L)concentration Ginkgetin group,Nrf2 activator-SFN(sulforaphane,20 mol SFN)group,and Ginkgetin-H+SFN(10 mol/L Ginkgetin+20 mol SFN)group.Flow cytometry,CCK-8,DCFH-DA and Western blot wereperformed to detect the apoptosis rate,proliferation level,reactive oxygen species(ROS)content and Nrf2/HO-1/GPX4 pathway protein expression level of U251 cells,respectively.Iron ion detection reagent was applied to detect in-tracellular iron content.Transmission electron microscope was used to observe cell ultrastructure.Results:Comparedwith the control group,the mitochondrial membrane thickness and ridge changed in Ginkgetin-L,Ginkgetin-M,andGinkgetin-H groups,the proliferation rate,Nrf2,HO-1,and GPX4 protein expressions decreased obviously,the ap-optosis rate,contents of ROS and iron increased obviously(P0.05).Compared with the Ginkgetin-H group,theproliferation rate,Nrf2,HO-1,and GPX4 protein expressions increased obviously in Ginkgetin-H+SFN group,theapoptosis rate,contents of ROS and iron decreased obviously(P0.05).Compared with the SFN group,the prolifer-ation rate,Nrf2,HO-1,and CPX4 protein expressions decreased obviously in Ginkgetin-H+SFN group,the apopto-sis rate,contents of ROS and iron increased obviously(P 98%）；Gibco公司提供DMEM培养基；美国Pierce公司提供化学发光检测试剂盒；Sigma-Aldrich公司提供MTT试剂；美国Mil-lipore公司提供PVDF膜；北京更新生物科技有限公司提供Nrf2激活剂莱硫烷（Sulforaphane，SFN）；碧云天公司提供DCFH-DA试剂盒、RIPA蛋白裂解液；Abcam公司提供Nrf2、H O-1、G PX4、-actin一抗及HRP标记羊抗兔IgG二抗;Invitrogen公司提供AnnexinV-FITC调亡检测试剂盒；普利莱基因技术有限公司提供铁离子检测试剂盒日立公司提供透射电子显微镜；BD公司提供流式细胞仪；美国Biotek公司提供ELx800酶标仪。1.3细胞分组及处理取生长状态良好的U251细胞，设置5个实验组：对照组、银杏素低（银杏素-L）、中（银杏素M）、高（银杏素H)浓度组、SFN组、银杏素-H+SFN组。其中对照组不经任何处理;经前期预实验及参考文献8 给予银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组以2.5 mol/L、5mol/L、10 mol/L处理2 4h;SFN组以2 0 molSFN处理细胞9;银杏素-H+SFN组以2 0 mol SFN、10 mol/L银杏素处理细胞,2 4h后进行指标分析。1.4MTT法检测细胞增殖率将U251细胞以2 10 3个细胞/孔的密度接种在96 孔培养板中。将MTT(10L,10mg/mL)溶液加人细胞中,然后孵育4h，去除上清液后，加入10 0 L二甲亚砜以溶解甲产物终止反应。30 min后，检测57 0 nm处光密度值（O D），得出细胞增殖率。1.5流式细胞术检测细胞凋亡将U251细胞以110 3个细胞/孔的密度接种在6 孔板中，孵育2 4h后，收获细胞并用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。然后按照AnnexinV-FITC调亡检测试剂盒操作，向细胞悬浮液中分别加入5LAnnexinV-FITC、5L碘化丙啶，然后上机测量细胞调亡率。1.6DCFH-DA(ROS）含量格检洲细胞将U251细胞以110/孔接种到12 孔板中。按照1.3处理细胞后，吸去药物并洗涤细胞，然后用不加血清的培养基稀释H2DCFH-DA溶液，将每孔加人50 0 L、10 mol/L的H2DCFH-DA溶液置于培养箱培养,30 min后洗涤细胞，于荧光显微镜拍照并分析结果。1.7细胞内铁离子测定将U251细胞以110/孔的密度接种在6 孔板中。按照1.3处理细胞后，收集细胞并用RIPA缓冲液裂解。按照说明书制备检测工作溶液，然后将样品与检测液充分混合，并在6 0 下孵育。1h后,加人铁离子检测试剂，室温孵育30min，每孔加人2 0 0 L终溶液，最后使用酶标仪在550 nm处检测，计算细胞内铁离子浓度。1.8透射电子细胞超微结构收集U251细胞并以10 0 0 r/min的速度离心10 min，弃去上清液，然后在4下加入预冷的2.5%戊二醛过夜。次日用冰冷的PBS清洗细胞，在4下加人1%四氧化钱固定30min，然后室温下用梯度乙醇对样品进行脱水，随后将样品包埋并切成1m的超薄切片。通过透射电子显微镜观察处理后细胞的超微结构。1.9Westernblot检测Nrf2/HO-1/GPX4通路相关蛋白表达水平RIPA裂解U251细胞，蛋白浓度通过BCA蛋白测定试剂盒进行测定；蛋白质分离通过SDS-PACE电泳完成，然后将蛋白质转移到PVDF膜，在封闭缓冲液中封闭2 h。之后将膜与以下一抗一起孵育：兔免抗Nrf2单克隆抗体、HO-1兔多克隆抗体、GPX4兔多克隆抗体、-actin次日与二抗一起孵育，最后通过增强化学试剂可视化蛋白，ImageJ软件（V 1.8.0.112）分析表达水平1.10统计学分析以均数标准差（xs）表示各组数据，SPSS27.0软件分析指标,P0.05为差异有统计学意义；多组间比较采用单因素方差分析，进一步行SNK-q检验。2结果2.1各组U251细胞增殖率变化与对照组相比,银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组增殖率均显著下降（7 5.317.54）%、（50.2 45.0 3）%、3368银杏素通过抑制Nrf2/HO-1/CPX4信号通路诱导神经胶质瘤细胞铁死亡赵印生，等（34.52 3.46)%比（10 0.0 0 0.0 0)%，以银杏素-H组降低最为明显（P0.05）；与银杏素-H组相比,银杏素-H+SFN组增殖率显著升高（6 4.2 7 6.43）%比（34.52 3.46)%,P0.05；与SFN组相比，银杏素-H+SFN组增殖率显著降低（6 4.2 7 6.43）%比（12 0.7 112.0 9）%,P0.052.2各组U251细胞凋亡率变化与对照组相比,银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组凋亡率均显著增加（12.431.2 5）%、（2 6.37 2.6 4）%、（39.2 43.9 3)%比（6.7 50.6 8)%，以银杏素-H组增加最为明显（P0.05）；与银杏素-H组相比,银杏素-H+SFN组调亡率显著下降（2 4.8 52.49）%比（39.2 43.93）%,P 0.0 5；与SFN组相比，银杏素-H+SFN组凋亡率显著增加（2 4.8 52.49）%比（4.0 7 0.41）%，P0.05,见图1。10*10*10101010E10三10 10104101010+10101001010210104101010210104100101022103104AnnexinV-FITCAnnexinV-FITCAnnexinV-FITCControlGinkgetin-LGinkgetin-M1010-10101010101010101010101010101010310104101010101041010:10:10:16AnnexinV-FITCAnnexinV-FITCAnnexinV-FITCGinkgetin-HSFNGinkgetin-H+SFN图1观察细胞凋亡变化Fig.1Cell apoptosis was observed2.3各组U251细胞ROS变化与对照组相比,银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组R0S水平均显著增加（3.2 6 0.33、4.550.46、6.2 7 0.6 3比2.150.2 2）,以银杏素-H组增加最为明显（P0.05）；与银杏素-H组相比，银杏素-H+SFN组ROS水平显著降低（3.340.34比6.2 7 0.6 3,P0.05）；与SFN组相比，银杏素-H+SFN组ROS水平显著增加（3.340.34比1.2 40.13,P0.05）,见图2。20um20m20mControlGinkgetin-LGinkgetin-M20um20m20umGinkgetin-HSFNGinkgetin-H+SFN图2观察ROS水平变化Fig.2Changes in ROS levels were observed2.4各组U251细胞铁离子的变化与对照组相比,银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组铁离子含量均显著增加（49.56 4.96、6 1.2 46.13、7 8.2 47.83比37.0 13.7 1），以银杏素-H组增加最为明显（P0.05)；与银杏素-H组相比，银杏素-H+SFN组铁离子含量显著降低（51.2 9 5.13比7 8.2 47.8 3,P0.05）；与SFN组相比，银杏素-H+SFN组铁离子含量显著增加(51.295.13比2 6.342.6 4,P0.05)2.5各组U251细胞超微结构变化对照组U251细胞中线粒体明显变小，线粒体双层膜密3369MODERNONC.31No.182023年0 9 月第31卷第18 期现代肿瘤医学度厚度增加,减少;银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组线粒体结构得到改善，双层膜密度厚度降低，增加，以银杏素-H组变化最为显著；SFN组细胞体积缩小、破裂严重，线粒体膜密度增厚；银杏素-H+SFN组细胞破裂稍有改善，但线粒体双层膜密度厚度依然较厚增加，减少显著，见图3。ControlGinkgetin-LGinkgetin-M2um2mGinkgetin-HSFNGinkgetin-H+SFN图3透射电镜观察细胞超微结构变化Fig.3Ultrastructural changes of cells observed by transmission electron microscopy2.6各组U251细胞Nrf2/HO-1/GPX4通路相关蛋白表达水平与对照组相比,银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组Nrf2、H O-1、G PX4表达均显著下降,以银杏素-H组降低最为明显（P0.05）;与银杏素-H组相比,银杏素-H+SFN组Nrf2、H O-1、G PX4表达显著增加（P0.05）；与SFN组相比,银杏素-H+SFN组Nrf2、H O-1、G PX4表达显著下降(P0.05）,见图4、表1。Nrf2HO-1CPX4-actinABCDEF图4U251细胞中Nrf2、H O-1、G PX4蛋白表达（Westernblot图）A为对照组;B为银杏素-L组;C为银杏素-M组;D为银杏素-H组;E为SFN组;F为银杏素-H+SFN组。Fig.4Expressions of Nrf2,HO-1 and GPX4 in U251 cells(Westernblot)A is Control group.B is Ginkgetin-L group.C is Ginkgetin-Mgroup.D is Ginkgetin-H group.E is SFN group.F is Ginkgetin-H+SFN group.3讨论胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤类型，占所有中枢神经系统肿瘤的2 7%和恶性肿瘤的8 0%10 。目前的治疗方式是最大程度的进行手术切除辅以放疗、化疗，但仍存在着手术切除不完全,放疗量大，化疗易耐受等不足1,因此神经胶质瘤的治疗一直是当前研究的重点。表1各组细胞中Nrf2、H O-1、G PX4表达的比较(xs,n=6)Tab.1Comparison of Nrf2,HO-1 and GPX4 expression in each group(xs,n=6)GroupNrf2/-actinHO-1/-actinGPX4/-actinControl0.69 0.070.88 0.090.73 0.08Ginkgetin-L0.34 0.04a0.44 0.05a0.36 0.04aGinkgetin-M0.48 0.05 ab0.62 0.07 ab0.55 0.06 abGinkgetin-H0.13 0.02 abc0.22 0.03 abc0.15 0.02 abcSFN0.95 0.101.16 0.120.98 0.10Ginkgetin-H+SFN0.54 0.06 de0.65 0.07 de0.51 0.06 de注：与对照组比较，aP0.05；与银杏素-L组比较,bP0.05；与银杏素-M组比较,cP0.05;与银杏素-H组比较,dP0.05；与SFN组比较,eP0.05。Note:Compared with control group,aP 0.05.Compared with Ginkgetin-L group,bP0.05.Compared with Ginkgetin-M group,cP0.05.Compared with Ginkgetin-H group,dP 0.05.Compared with SFNgroup,eP0.05.银杏素是一种源自银杏叶的生物类黄酮，具有抗炎、抗流感和神经保护活性12 。最近报道了银杏素的抗癌作用，如前列腺癌细胞系研究中，银杏素可抑制异种移植裸鼠的肿瘤生长，是首次通过抑制STAT3发挥抗肿瘤活性的报道13银杏素可以抑制雌激素受体表达降低乳腺癌（MCF-7和T-47D细胞）的细胞活力,诱导癌细胞死亡，呈现剂量依赖性,是一种有前途的治疗乳腺癌的药物14。银杏素可通过抑制Wnt通路有效阻止髓母细胞瘤细胞增殖，是一种有前途的抗髓母细胞瘤候选药物15。除此之外,PAN等16 研究报道银杏素可通过抑制STAT3和激活caspase-3/9对骨肉瘤细胞发挥生长抑制和促调亡作用。本实验结果显示银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组U251细胞增殖率显著下降、ROS含量、细胞调亡率明显增加，呈现剂量依赖性，以银杏素-H组变化作为显著，提示银杏素可以有效抑制U251细胞的增殖，诱导其调亡进而发挥抗肿瘤作用，但作用机制尚不明确。3370赵印生，,等银杏素通过抑制Nrf2/HO-1/CPX4信号通路诱导神经胶质瘤细胞铁死亡DIXON于2 0 12 年首次提出铁死亡，证明铁死亡是一种依赖铁和ROS含量的细胞死亡,其特征主要是细胞学变化，包括线粒体减少或消失、线粒体外膜破裂，铁死亡逐渐被认为是消除恶性细胞的一种适应性特征，对于根除致癌细胞至关重要17 。如ZHANG等18 研究发现RNA结合蛋白RBMS1在肺癌中升高，通过介导铁死亡逃避参与肺癌发展。研究证明Nrf2/HO-1/GPX4通路参与铁死亡的调节进而影响疾病的发展19。如利拉鲁肽广泛用于临床，被批准用于治疗肥胖和糖尿病,研究发现其作用是通过提高 Nrf2/HO-1/CPX4信号通路的表达降低铁死亡发挥作用2 0 。研究表明醋酸棉酚可以通过抑制GPX4途径，诱导脑胶质瘤细胞发生铁死亡,从而发挥抗肿瘤作用2 1。除此之外，银杏素可促进DDP诱导的抗NSCLC作用,这可能是由于通过抑制Nrf2/HO-1诱导铁死亡发挥作用8 。本研究发现银杏素-L、银杏素-M、银杏素-H组线粒体膜厚度及改变,Nrf2、H O-1、G PX4蛋白表达显著下降,ROS及铁含量显著增加，表明银杏素可能通过抑制Nrf2/HO1/CPX4通路诱导铁死亡，实现抗肿瘤作用。为验证该结论，实验引人Nrf2激活剂-SFN,结果发现SFN逆转了银杏素对U251细胞恶性行为的抑制作用。综上所述，银杏素可通过抑制Nrf2/HO-1/GPX4通路，诱导U251细胞铁死亡，发挥其抗肿瘤作用，但实验仅在体外开展，未在体内进行验证，是该文章存在的不足之处，接下来将进行体内实验进行验证。【参考文献】1TAMTAJI OR,BEHNAM M,POURATTAR MA,et al.PIWI-in-teracting RNAs and PIWI proteins in glioma:molecular pathogene-sis and role as biomarkers J.Cell Commun Signal,2020,18(1):168.2MORGAN LL.The epidemiology of glioma in adults:a state of thescience reviewJ.Neuro Oncol,2015,17(4):623-624.3LI J,CAO F,YIN HL,et al.Ferroptosis:past,present and futureJ.Cell Death Dis,2020,11(2):88.4黄庆洋，纪东东，田绣云，等.小檗碱通过激活Nrf2H O-1/GPX4通路抑制小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡J.南方医科大学学报,2 0 2 2,42(6）：937-943.HUANG QY,JI DD,TIAN XY,et al.Berberine inhibits erastin-induced ferroptosis of mouse hippocampal neuronal cells possibly byactivating the Nrf2-HO-1/GPX4 pathway J.Journal of South-ern Medical University,2022,42(6):937-943.5HU WH,CHAN GK,DUAN R,et al.Synergy of ginkgetin and res-veratrol in suppressing VEGF-induced 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