油酰乙醇胺对大鼠原代血管平滑肌细胞泡沫化病变的治疗作用.pdf

基金项目：国家重点研发计划项目（）作者简介：范盎然，女，生，硕士，实验师，：收稿日期：油酰乙醇胺对大鼠原代血管平滑肌细胞泡沫化病变的治疗作用范盎然，魏鹏，董瑞娟，吴小枫，王旭（北京中医药大学中医学院科研实验中心，北京 ；厦门大学附属第一医院药剂科；通讯作者，：）摘要：目的探讨动脉粥样硬化的脂质代谢过程中，油酰乙醇胺（，）作为重要参与者的作用及其可能的分子机制。方法通过氧化型低密度脂蛋白（，）诱导大鼠原代血管平滑肌细胞泡沫化病变。将大鼠原代血管平滑肌细胞分为正常组（正常培养）、模型组（的 刺激 ）和 组（的 与 刺激 ），使用实时荧光定量 检测细胞泡沫化密切相关的受体与酶的 表达水平，包括过氧化物酶体增殖物激活受体 （，）、类清道夫受体白细胞分化抗原 （，）、族 型清道夫受体（，）、胆固醇酰基转移酶 （：，）、胆固醇调节元件结合蛋白 （，）和肉毒碱棕榈酰转移酶 （，）。使用化学酶促法检测各组实验细胞中总胆固醇（）、甘油三酯（）的含量，并计算细胞内胆固醇酯（，）。采用油红 染色法在显微镜下直观观察各组实验细胞内脂质堆积的情况。结果与正常组相比，模型组 、和 表达升高（），、表达降低（），脂代谢基因 表达降低（）；细胞内 、含量和 显著升高（），细胞内脂滴明显增加。与模型组相比，组 、和 表达降低（），、表达升高（），脂代谢基因 表达升高（）；细胞内 、含量和 降低（），并且可从显微镜直观观察到细胞内脂质堆积程度降低。结论 上调脂代谢基因 表达，可以改善细胞内脂质堆积情况，这一效果可能是通过 通路调控 、等重要脂质代谢基因实现的。关键词：动脉粥样硬化；油酰乙醇胺；血管平滑肌细胞；氧化型低密度脂蛋白；细胞泡沫化中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，：）：（）（）（）（），（），（），（），（），（），：（），（），（）（）（），（），（），（），（），（），（），（），（）；，（），：；动脉粥样硬化（，）是一种慢性动脉疾病，可引起缺血性心脏病、缺血性中风和外周动脉疾病，已经成为世界范围内血管疾病和死亡的主要原因 。泡沫细胞（，）是指细胞过度摄取蓄积脂质致使细胞内胆固醇酯（，）占总胆固醇的比例超过 时的病变细胞。泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化发生发展的关键过程之一 。伴随 发展，泡沫细胞逐渐堆积形成脂质条块，并进一步形成脂质核心，引起粥样硬化坏死，使粥样斑块失稳 ，。泡沫细胞形成之后极易坏死 ，是造成斑块脱落的最主要因素，斑块脱落则可导致心脑血管疾病等不良临床事件 ，。因此，治疗细胞泡沫化已经成为治疗动脉粥样硬化的一个重要研究热点 ，。研究表明，血管平滑肌细胞（，）可在一定条件下转化为泡沫细胞 ，。当血管平滑肌细胞通过清道夫受体、脂质代谢酶等大量摄取氧化型低密度脂蛋白（，）后 ，这些细胞出现脂质代谢紊乱、胆固醇过度堆积等情况，最终导致细胞泡沫化。此外有报道显示，在动脉粥样硬化的晚期发展进程中，来源于血管平滑肌细胞的泡沫细胞占比可高达 。由此可知，血管平滑肌细胞泡沫化是粥样斑块形成的重要组成因素。目前已知细胞泡沫化进程与清道夫受体家族蛋白和脂质代谢相关酶密切相关，如 类清道夫受体白细胞分化抗原 （，）和 族 型清道夫受体（，）；胆固醇酰基转移酶（：，）、胆固醇调节元件结合蛋白 （，）、肉毒碱棕榈酰转移酶 （，）等 ；而过氧化物酶体增殖物激活受体 （，）则与清道夫受体密切相关，对调节动脉粥样硬化及血脂异常具有重要意义 ，。油酰乙醇胺（，）作为 的天然配体，其扮演的角色在机体能量和脂质的代谢过程中，都是非常重要的 ，通过研究 调控 通道、清道夫受体及脂代谢，进而调节细胞泡沫化，有望达到治疗动脉粥样硬化的目的。鉴于所述血管平滑肌细胞、清道夫受体、脂质代谢基因等与动脉粥样硬化病变之间的紧密联系与调控方式，本研究采用大鼠原代血管平滑肌细胞作为研究对象，成功造模泡沫化病变细胞模型，通过实时荧光定量 、油红 染色及化学酶促反应试剂盒等检测大鼠原代平滑肌细胞中脂代谢相关基因和细胞中脂质堆积情况的变化，探讨 的天然配体 对大鼠原代平滑肌细胞泡沫化的调控作用。材料与方法 大鼠及主要试剂和仪器雄性普通 大鼠 只，体质量 ，斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证号：（京）；购于北京协生生物科技有限责任公司；、胰蛋白酶购于 公司；高糖细胞培养液购于 公司；胎牛血清购于 公司；孔细胞培养皿购于 公司；油红 染色试剂，、酶促反应检测试剂盒购于北京 公司；试剂购于德国 公司；逆转录试剂盒购于日本 公司；荧光染料试剂盒购于日本 公司；细胞培养箱购于 公司；低温高速离心机购于 公司；倒置荧光显微镜购于日本 公司；仪购于德国 公司；荧光定量 仪购于 公司；所用引物购于上海生工公司，引物序列见表 。大鼠原代血管平滑肌细胞的分离培养及处理放血法处死大鼠，将处死的大鼠，立即用 酒精浸泡消毒。在无菌条件下取一段胸主动脉，无菌 洗去血液。轻轻拨去血管膜外的纤维脂肪组织只保留血管组织，纵向剪开血管。用手术刀片轻 刮血管内壁数次。将血管切成约 大小的山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期表 基因引物序列 基因上游引物序列下游引物序列 碎块，装入培养瓶中，以含有 胎牛血清的高糖 细胞培养液浸泡，在 、条件下培养 ，将培养瓶翻转 继续培养。后，显微镜下可观察到成功从组织块中爬出，贴壁生长的平滑肌细胞。每 换 次培养液，一般 周出现致密的细胞层。待细胞融合至 左右时，传代细胞，取第 代的形态稳定细胞进行实验。实验细胞分为 组：正常组使用含有 胎牛血清的高糖 细胞培养液正常培养；模型组在正常组的基础上加入终浓度为 的 刺激 ；组在正常组的基础上加入终浓度为 的 和 共同刺激 。每组设 个复孔。实时荧光定量 检测大鼠原代血管平滑肌细胞泡沫化密切相关的受体与酶的 表达水平将实验细胞按照分组培养 后，根据说明书使用 提取细胞总 。使用逆转录试剂盒将得到的细胞总 逆转录为 。使用 荧光染料试剂盒将得到的实验细胞 进行扩增，通过 实时荧光定量 仪检测实验结果。细胞油红 染色显微镜下观察大鼠原代血管平滑肌细胞泡沫化程度油红 是有特异性脂溶性染料，可使细胞内甘油三酯等中性脂肪着色，呈现非常明显的红色脂滴状。将实验细胞按照分组培养 后，用移液器去除细胞培养液，灭菌 溶液冲洗实验细胞 次以去除培养液残留，用 多聚甲醛溶液室温固定细胞 。弃甲醛溶液，用 异丙醇溶液清洗样本 次，室温下自然晾干细胞培养皿中液体成分。在上述风干的细胞培养皿中加入油红染色试剂，静置 ，用去离子水冲洗 次，显微镜观察拍照。化学酶促法检测样本中总胆固醇（）、甘油三酯（）的含量将实验细胞按照分组培养 后，去除细胞培养液，用灭菌 冲洗实验细胞 次，用胰酶消化细胞至 离心管中。，离心 ，加入氯仿 甲醇混合物（），超声细胞破碎仪将细胞破碎完全。收集上清液，在真空干燥机中处理至完全干燥，滴入 异丙醇将其完全溶解。用化学酶促法检测样本中总胆固醇（）、甘油三酯（）的含量，并计算细胞内胆固醇酯（，）占比，即 ，其中 。统计学分析使用 统计软件，单因素方差分析法（）分析三组数据，实验数据用平均数 标准差表示。为差异有统计学意义。结果 对平滑肌细胞清道夫受体 的影响与正常组相比，模型组大鼠原代平滑肌细胞中 的表达明显升高（），而 的表达则明显抑制（，见图 ）。与模型组比较，组 的表达受到抑制（），的表达得到上调（，见图 ）。对平滑肌细胞相关脂代谢基因 的影响与正常组相比，模型组 和 明显上调（），表达明显下降（，见图 ）。而与模型组比较，组中 和 基因表达明显下降（或 ），而 表达显著上调（，见图 ）。，与正常组比较，；与模型组比较，图 培养 对 造模的平滑肌细胞清道受体 的作用 与正常组比较，；与模型组比较，图 培养 对 造模的平滑肌细胞相关脂代谢基因 的作用 对平滑肌细胞 的影响与正常组相比，模型组大鼠平滑肌细胞在 的诱导下，表达受到抑制（）；而与模型组相比，组 表达明显上调（，见图 ）。对原代平滑肌细胞内脂质蓄积的影响正常组大鼠原代平滑肌细胞内红色脂滴几乎不可见；而与正常组相比，模型组红色脂滴显著增多；与模型组相比，组脂滴明显减少，与正常组染色结果接近（见图 ）。对平滑肌细胞胆固醇含量以及泡沫化的影响与正常组相比，模型组平滑肌细胞内 、含量和 比值都明显呈上升趋势（）；而与模型组相比，组中 、含量与 比值均得到了下调（，见图 ）。与正常组比较，；与模型组比较，图 培养 对 造模的平滑肌细胞的 的作用 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 正常组 模型组 组图 对原代平滑肌细胞内脂质蓄积的作用 与正常组比较，；与模型组比较，图 和 处理 对平滑肌细胞内 、含量及 比值的作用 ，讨论 的起始过程是动脉炎症及脂代谢异常导致的血管内壁脂质沉积，即泡沫细胞形成。随后的发展中伴有平滑肌细胞增生和迁移、坏死的泡沫细胞被迁移细胞包裹形成脂质核心、动脉内壁增厚等过程，最终形成粥样坏死病灶和血管壁硬化。是众多心血管疾病的主要诱因之一，严重威胁人类健康。（）是低密度脂蛋白，广泛存在于人类的血液中，它的血液含量与饮食习惯相关，当摄入过多的油脂类食物时，在血液中含量升高。是氧化性低密度脂蛋白，它由人类血液中的 经过炎症氧化过程转变而来，血管平滑肌细胞对它的摄入和积累，是导致泡沫细胞形成的主要诱因，而泡沫细胞形成则是 发生发展的关键过程之一。如果可以阻止或者减缓这一过程的发展进程，将对于 的防治产生重大意义。本文旨在研究泡沫细胞产生和发展时，可否通过 达到有效的干预效果，故而选择了与这一过程息息相关的基因进行检测和分析。许多研究显示，清道夫受体与细胞泡沫化密切相关，这类受体分为 类和 类家族（，）。在血管平滑肌细胞中，主要表达 类家族的受体，而 类家族受体则几乎不表达 ，本文主要实验细胞为血管平滑肌细胞，故而选择 作为检测靶点。主要包括 和 ；是已经在分子水平上得到证实的高密度脂蛋白（，）受体，具有 高亲和力，通过参与选择性摄取 而促进胆固醇流出，对细胞泡沫化起抑制性作用 ，而 基因则是将机体免疫过程和代谢过程联合在一起的重要靶点，因其具备识别众多内源性的配体，如 、长链脂肪酸、非修饰的脂蛋白等的功能，是正常细胞向泡沫化细胞转化的主要受体 。和 与平滑肌细胞接受和吸收 和 息息相关。脂代谢相关酶与细胞脂肪代谢密切相关，进而影响细胞泡沫化的进程。是合成胆固醇酯并将其储存于细胞脂质体中的重要基因 ，在血管 ，中广泛表达。是脂肪合成的转录控制基因 ，其表达水平与甘油三酯和脂肪酸合成基因息息相关，是肝脏脂质代谢的关键调控位点。参与脂肪酸 氧化过程，它的表达水平与脂肪酸在细胞内沉积呈负相关 。通过 、表达的变化可以看出平滑肌细胞对于已经吸收的 的代谢水平。如果细胞可以通过 的调控，将摄入的 代谢转化，则可以阻止细胞因摄入 导致的泡沫化进程。已有多个研究证明，油酰乙醇胺（）的活性与机体能量和脂质代谢密切相关。年 等 研究发现 是与厌食症病人进食过程相关的信号脂质。进而人们发现，长期给予实验动物 ，可使其食欲下降、体重减轻，经过研究，的这一作用就是通过激动 基因而实现的 ，。而 正是在细胞脂质代谢调控中举足轻重的核受体基因 ，。从上述研究可以看出，可以激活脂质代谢核受体基因 ，从而达到提高细胞脂质代谢，使实验动物体重减轻的效果。本文通过实验研究，探讨 对于血管平滑肌细胞吸收和代谢脂质的影响。通过本文实验证明，对由 诱导的动脉粥样硬化过程中的血管平滑肌细胞泡沫化有治疗作用，它能抑制血管平滑肌细胞 表达，抑制 、表达，阻断胆固醇酯进入血管平滑肌细胞的通路；上调血管平滑肌细胞胆固醇逆转运相关受体 表达，促进 表达，促进细胞内胆固醇转运流出，限制胞内脂肪酸沉积，进而调节细胞内脂代谢，减轻血管平滑肌细胞泡沫化。而 作为 的激活剂，它的这一作用的产生是否只是通过激活 通道而达到了后续多个脂质代谢相关基因的联动；通道是如何调控这些脂质代谢基因的，本文还未能完全研究清楚，还有待于下一步继续深入研究。参考文献：，（）：，：，：刘子歌，刘洋，宋国瑞，等 泡沫细胞在动脉粥样硬化形成过程中的作用研究进展 陕西医学杂志，（）：，（）：，（）：，（）：王颖，寇俊杰 对动脉粥样硬化血栓作用研究的进展 心血管康复医学杂志，（）：，（）：，（）：刘峰涛，于紫英 血管平滑肌细胞与动脉粥样硬化斑块稳定性的研究进展 中国心血管杂志，（）：，：，（）：，（）：，（）：弓伊宁，李芙蓉，姚伟娟 巨噬细胞的胆固醇代谢及其影响因素 生理科学进展，（）：（）：，：（），（）：，：，：，（），（）：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 ，（）：，：，：，（）：，（）：葛漫丽，刘婷婷，王继红，等 类清道夫受体 在脂代谢中的作用 中国免疫学杂志，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，：，（）：，