DNA粗提取与鉴定实验(课堂PPT).ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,粗提取与鉴定实验,1,内容,课题分析,1,实验操作原理,5,材料器具,3,实验理论基础,4,教学建议,2,实验步骤,6,2,一、课题分析,1,.,教学,目标,（,1,）分析,DNA,的性质及提取的基本思路。,（,2,）探究不同手段提取,DNA,的实验过程。,（,3,）掌握,DNA,提取的过程并灵活运用。,3,2,.,背景描述,生物体的性状之所以能够遗传给后代，是由于其体内具有,DNA,或,RNA,这些遗传物质，,DNA,是遗传物质已经通过实验证实,。,那么,DNA,究竟什么样,？,本,课题通过尝试对植物或动物组织中的,DNA,进行粗提取，了解,DNA,的理化性质，理解,DNA,提取以及鉴定的原理，在一定层面感性认知,DNA,。,一、课题分析,4,DNA,脱氧核苷酸,腺嘌呤,一、课题分析,dAMP,dTMP,dCMP,dGMP,胸腺嘧啶,腺嘌呤,鸟,嘌呤,5,核苷酸结构,6,一、课题分析,脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着,DNA,长链所排列而成的序列，可组成,遗传密码,，指导蛋白质的合成。,7,一、课题分析,读取,密码的过程称为,转录,。,是,以,DNA,双链中的一条单链为模板转录出一段称为,mRNA,（,信使RNA,）的核酸分子,。,多数,RNA,带有合成蛋白质的讯息，另有一些本身就拥有特殊功能，例如,rRNA,、,snRNA,与,siRNA,。,8,一、课题分析,在,细胞内，,DNA,能与蛋白质结合形成,染色体,，整组染色体则统称为,染色体组,。,人正常,的人体细胞中含有,46,条染色体,。,染色体在,细胞分裂,之前会先在,分裂间期,完成复制，细胞分裂间期又可划分为：,G1,期,-DNA,合成前期、,S,期,-DNA,合成期、,G2-DNA,合成后期。,9,一、课题分析,DNA,是高分子聚合物，,DNA,溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被,甲基绿,染成绿色,。,DNA,对紫外线（,260nm,）有吸收作用，利用这一特性，可以对,DNA,进行含量测定,。,当,核酸变性时，吸光度升高，称为,增色效应,；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平,。,较高,温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起,DNA,分子变性，即,DNA,双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开,也称为,DNA,的解螺旋。,10,洋葱内表皮细胞,DNA,被甲基绿染成绿色，,RNA,被派洛宁染成红色,11,二、教学建议,科学,的探究一般过程为“发现问题,提出假设,设计实验,预测结果,得出结论,”,。,通过,本实验的设计的具体的实施，是学员能够接受科学的训练，在训练过程中举一反三，从理论到实践认知,DNA,的提取过程和操作原理,。,从,DNA,的物质组成，到,DNA,的复制时期，联系生物学现象。在理解,DNA,的理化性质的基础上，利用其理化性质对,DNA,进行分离。,12,三、材料器具,材料,：新鲜,菠菜,4kg,。,试剂,：氯化钠,1000g,、,SDS 500g,、无水乙醇,4000ml,、二,苯胺,200ml,。,器材,：,200ml,烧杯,60,个、试管,100,支、研钵,30,个、玻璃棒,30,个、纱布,2,包、不锈钢药勺,30,个、滤纸,5,包。,仪器,：天平,2,台、水浴锅,2,个、漏斗,30,个。,13,DNA,是大分子高分子聚合物，,DNA,溶液为,高分子溶液,，具有很高的粘度。,DNA,对紫外线有吸收作用，当核酸变性时，吸光值升高；,当变性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。温度、有机溶剂、酸碱度、尿素、酰胺等试剂都可以引起,DNA分子,变性,，即使得,DNA,双键间的氢键断裂，双螺旋结构解开。,四、实验理论基础,14,1,、,DNA,对酶、高温和洗涤剂的耐受,性,蛋白酶,能水解蛋白质，但是对,DNA,没有影响,；,大多数,蛋白质不能忍受,60,80,的高温，而,DNA,在,80,以上才会变性,；,洗涤剂,可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对,DNA,没有影响。,四、实验理论基础,15,2,、,DNA,的溶解度,DNA,和蛋白质等其他成分在不同浓度的,NaCl,溶液,中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使,DNA,充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反。,四、实验理论基础,3,、,DNA,在酒精溶液中的溶解性,DNA,不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将,DNA,与蛋白质进一步分离。,16,1,、实验材料的选取,凡是,含有,DNA,的生物材料都可以考虑，但选用,DNA,含量相对较高,的生物组织，更具有操作性，根据实验目的选取适当的材料和方法,。,鱼卵,、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。,五、实验操作原理,17,2,、细胞破碎,动物细胞,：没有,细胞壁破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,，,同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。,原理：蒸馏水对于细胞来说是一种,低渗,液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了细胞的破裂,(,细胞膜和核膜的破裂,),，从而释放出,DNA,。,植物细胞,：需要先用一定的洗涤剂和氯化钠溶解细胞膜，洗涤剂是一些离子去污剂，能,溶解细胞膜,，有利于,DNA,的释放，氯化钠有利于,DNA,的溶解。,研磨：使,DNA,充分释放，洗涤剂等更容易充分接触细胞膜。用,液氮研磨,可有效的防止,DNA,降解。,五、实验操作原理,18,2,、细胞破碎,DNA,降解的原因：,温度,：高温,易加速磷酸二酯键的水解,。,湿度,：参与磷酸二酯键的水解、影响,DNA,螺旋的形成结构,。,pH,值：氢离子参与与催化磷酸二酯键的水解、过高或过低的,pH,值都易破坏氢键,。,氧,化反应：氧化碱基中的含氮杂环,使其变性,从而进一步改变一级与二级的,DNA,构象,。,DNA,降解,酶：水解,DNA,。,五、实验操作原理,19,3,、,DNA,的纯化,细胞破碎,后主要含有蛋白、多糖和,RNA,等杂质。可根据,DNA,的,性质进行,纯化。首先可通过,过滤,、,离心,等方法去除不溶解的,杂质，然后,再进一步纯化,。,氯化钠,中的溶解度，氯化钠浓度为,2mol/l,时,DNA,溶解度最大,，可,在此浓度下先溶解,DNA,，然后过滤去除不溶解的杂质，然后在,DNA,溶解度最低的氯化钠溶液中（,0.14mol/l,）使,DNA,析出，再过滤去除溶解在氯化钠溶液中的杂质。,五、实验操作原理,20,3,、,DNA,的纯化,利用,蛋白酶,降解蛋白质，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶,K,等，降解蛋白质,。,适当,温度,降解蛋白质，,65-70,，,DNA,不会被变性，蛋白会变性。,不溶于水的,有机溶剂,，酚、氯仿等，,DNA,不溶于这类试剂，蛋白质可溶解在其中，通过静止或离心使有机试剂和水分离，去除杂质。,DNA,结合柱,，硝酸纤维素膜等，在酸性条件下可结合,DNA,，中性和碱性条件下结合能力差。通过,DNA,的等电点调节其所带电荷为正电或负电，通过孔径去除大分子和小分子。,五、实验操作原理,21,4,、,DNA,的析出,溶,于水的有机溶剂可使,DNA,析出，水更容易和有机试剂结合，使,DNA,析出，如一定浓度,乙醇、异丙醇,（乙醇浓度一般在,48-67.5%,，异丙醇浓度在,36%,以上，浓度越高效果越好），低温效果更好（杂质较多），同时，可在一定程度上出去溶于该有机试剂的杂质,。,5,、,DNA,的,溶解,一般采用,TE,（,Tris-EDTA,，,pH8.0,）缓冲液或,去离子水。,五、实验操作原理,22,6,、,DNA,的,鉴定,DNA,与,二苯胺（,沸水浴）会染成,蓝色；,可,被,甲基绿,染成绿色,；,DNA,对紫外线（,260nm,）有吸收作用,；,DNA,可与溴化乙锭（,EB,）花青素类染料结合，可在紫外光下激发荧光,。,五、实验操作原理,23,1.,植物材料的,研磨,：称取新鲜植物材料（菠菜）,100g,，表面清洗后，在研钵中充分研磨，可加入石英砂，将植物组织充分研磨（可加入适量的提取缓冲液）。,2.,将研磨好的样品取出置于,200ml,烧杯中，加入,100ml 10%,的,SDS,轻轻混匀，,65,水浴,10-15min,后取出。,3.,用多层纱布,过滤,，含,DNA,的粘稠物留在纱布上。,4.,用,20mL 2mol/L,的,NaCl,溶液，溶解粘稠物，在,20mL,烧杯中轻缓搅拌,3min,，使尽可能多的,DNA,溶解,在,NaCl,溶液。,六,、实验步骤,24,5.,用放有两层纱布的漏斗,过滤,，滤液中含有,DNA,。,6.,向滤液中加入等体积的无水乙醇（或,95%,的乙醇），用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶液中（,析出,）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。,7,.,在试管中先加入,2mol/L,的,NaCl,溶液,5ml,于两只试管中，其中一只加入,DNA,丝状物，各加入,二苯胺,4ml,试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热,5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有,DNA,的溶液是否有蓝色。,六,、实验步骤,25,