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亲水作用色谱（HILIC）在体内药物分析中的研究进展

姓名: 李沙沙 学号： 201212282939
专业： 药剂 导师 赵永星

亲水作用色谱（HILIC）在体内药物分析中的研究进展

摘 要 近年来亲水作用色谱（HILIC）成为色谱领域研究的热点之一。亲水作用色谱是一种结合亲水固定相与极性有机溶剂-水体系流动相的色谱分离技术，对反相作用色谱中难以保留的极性化合物能够实现有效分离。本文简要介绍了HILIC的分离机制，固定相，联用技术，并综述了其在体内药物分析中的研究进展。
关键词 亲水作用色谱；体内药物分析；分离机制；固定相
Hydrophilic interation charomatography and its Research Development in Biopharmaceutical Analysis
Abstract Hydrophilic interaction chromatography(HILIC) is popular in the analy-
sis of hydrophilic solute in recent years. Hydrophilic interaction chromatography(HI
LIC) separation system consists of polar stationary phase and mobile phase with high polar organic solvent content and small portion of water phase. It has been shown to be a powerful tool for separating polar analytes which have poor retention on traditi-
onal reversed-phase liquid chromatography.This article briefly reviews concept, me-
chanism and stationary phase of HILIC, and its recent Research Development in Biopharmaceutical Analysis.
Key words HILIC ; Biopharmaceutical Analysis ; stationary phase ; mechanism

体内药物分析是对体液或组织中药物及其代谢物、生物标记物等进行的定性或定量分析。生物样品成分复杂，因此分析物检测手段的选择成为需要密切关注的问题。反相液相色谱（RPLC）是当前分离分析和分离制备中应用最为广泛的色谱模式，其依靠疏水固定相与溶质之间的疏水相互作用实现弱极性和中等极性化合物的高效分离。生物基质中含有其他多种亲水性组分，包括内源性物质以及外源性物质，当目标化合物在反相色谱保留较弱时，可能会与这些成分发生共洗脱。对强极性化合物的保留很弱，甚至不保留，因此强极性化合物在上不能得到很好的分离。目前，用来分离强极性化合物的液相色谱方法主要有离子交换色谱法（IEC）、正相色谱法（NPLC）和亲水作用色谱法（HILC）。
亲水作用色谱（HILIC）的概念是由 Alpert[1]首次提出，它是指采用极性固定相 (如硅胶或衍生硅胶) 和含高浓度极性有机溶剂（如乙腈）和低浓度水溶液流动相的色谱模式，具有和反相色谱正交的选择性所使用的流动相与传统反相色谱相似，弱洗脱剂为有机相，强洗脱剂为水相，可达到与反相色谱相媲美的柱效和对称峰形，化合物的洗脱顺序则与正相色谱相似，即以亲水性增加的顺序流出，能为亲水性强极性的化合物提供合适的保留，含水的流动相又可显著改善样品的溶HILIC分离系统包括极性固定相和流动相包括高浓度强极性溶剂低浓度和水。HILIC对极性化合物的良好保留和独特选择性，已使其成为体内药物定量分析的重要补充工具。

1. HILIC的分离机制和影响保留的因素

1.1 HILIC的分离机制
Alpert[1]认为，极性样品在 HILIC中的保留基于分配机理。但同时指出：导致两相之间发生分配的原因并不清楚，有可能也包含了某些偶极偶极相互作用，并认为弄清保留机理仍需要大量的研究。在后续的研究中，也有人提出保留是基于溶质在固定相上的吸附[2]。而更多的实验现象则表明 HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种效应[3]。
1.2 影响保留的因素
HILIC分离效果受到多种因素的影响，例如流速、柱温、固定相键合的基团缓冲体系、缓冲盐的种类和浓度等[4] 。Guo等[5]以及Qinming等[6]的研究结果表明，尽管不同的固定相填料表现出不同的选择性，但影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈含量的增加会显著增加样品的保留因子。此外，在不同的温度下，不同样品在不同固定相上的保留行为变化趋势不一，实际应用时需根据所用的色谱柱作有针对性的调整。不同种类的缓冲盐和浓度对不同样品在 HILIC色谱柱上的保留影响也不相同。

2. HILIC的固定相

HILIC固定相的种类繁多,不同 HILIC固定相具有不同的选择性和适用范围，而对HILIC 固定相的保留特性缺乏系统的研究，因此选择“合适”的 HILIC色谱柱十分困难。目前已有多种商品化 HILIC色谱柱面市，其中多数为硅胶基质，也有少数采用聚合物基质，以满足更大范围流动相条件的变化。
2.1 NPLC固定相直接用于HILIC
NPLC使用的极性固定相主要有纯硅胶、氨基键合相、氰基键合相和二醇基键合相等。这些固定相具有较强的极性和亲水性，都能直接用于HILIC。
2.1.1硅胶固定相
美国Water公司还专门推出了硅胶亲水色谱柱，由于硅胶表面没有修饰层，因而硅胶的表面吸附活性、表面结构不均匀性和硅羟基的酸性使色谱峰形和分离重复性产生一定的问题。另外，由于缺乏修饰层的保护，纯硅胶固定相在 模式下的使用寿命较短，一般只能进样 500次左右[7]。Water公司提出了有机无机杂化硅胶的概念并推出了系列色谱柱，乙基桥杂化硅胶被应用于 ，其使用寿命比纯硅胶柱有了很大提高[8]。
2.1.2 二醇基键合相和氰基键合相
二醇基键合相和氰基键合相等正相固定相也可以用于HILIC 模式，但同样由于键合相亲水性不足，存在着溶质保留时间较短的问题[9]。
2.2 新型HILIC固定相
当前HILIC固定相的种类很多，根据键合相的化学结构进行分类，HILIC 固定相可分为酰胺型、多元醇羟基型和两性离子型等。这几类基团具有很好的亲水性，十分适合作为亲水色谱的固定相，而且在一定程度上可以解决传统正相固定相用于 HILIC所存在的问题。
2.2.1 两性离子固定相 (ZIC-HILIC)
两性离子是指在一个分子中同时存在正电荷中心和负电荷中心。Irgum 等[10]将两性离子固定相应用于离子色谱中，发现使用纯水就可以进行离子色谱分离。两性离子固定相在离子色谱模式下的分离机理说明了其具有很好的亲水性，适合用于 HILIC模式。最近对多种氨基糖苷类药物在多种 HILIC柱上色谱行为的系统研究表明[11]，与未修饰硅胶柱氨基柱和酰胺柱相比能实现最佳分离；柱温影响检测灵敏度而与保留时间无关；流动相中的离子强度影响峰型和保留时间。
2.2.2 离子交换固定相
常用于离子交换色谱的离子型固定相具有很好的亲水性，因此也可以应用于 HILIC模式。基于磷酸化肽在HILIC 模式下离子型固定相上的保留特性，Alpert[12]于2008 年提出了电荷抑制的亲水作用色谱（ERLIC），实质为离子排斥与亲水作用混合色谱模式。

3. HILIC在体内药物分析中的特点

未经衍生化的普通硅胶柱目前是应用最为广泛的HILIC 色谱柱，对于碱性药物，需要酸性的流动相，未衍生硅胶柱在HILIC 模式下因处于高有机相环境中，不会如处于反相色谱条件时那样易溶解。同时，HILIC 还能获得高的色谱柱效对称的峰形。HILIC以高浓度有机溶剂和低含量水组成的流动相，具有低黏度和高渗透性的特点，与相似柱粒径和流速的反相液相色谱相比，色谱柱压大大降低，因此可在高流速下以低反压进行分离，从而实现快速分析。HILIC 所使用的高挥发性有机相尤其适宜与电喷雾( ESI ) 质谱联用，可提供良好的灵敏度。由于HILIC 进样时采用高比例有机溶剂，生物样品制备过程最后一步无需以高水相有机溶剂复溶，可有效提高样品通量[13]，对不稳定或不适合蒸发复溶的分析物还可得到更低的检出限和更高的回收率。由于HIL IC利用被测组分与硅羟基的相互作用,因此不需要加离子对试剂(如烷基磺酸盐)的洗脱液就能对大范围内的碱性药物进行分离,流动相组成简单,一般为甲醇-水相缓冲液或乙腈-水相缓冲液,常用的缓冲液有硝酸铵--氨水、乙酸铵-乙酸/甲酸/三氟乙酸及磷酸盐/磷酸等[13]。HILIC的流动相组成简单，固定相稳定。

4. HILIC联用技术的发展
4.1 HILIC-MS联用
HILIC可以为强极性和强亲水性的化合物提供合适的保留，而且含有高浓度水溶性有机相的流动相又有利于提高质谱的离子化效率，进而提高质谱分析的灵敏度。HILIC-MS/MS被称为生物分析中的一种高通量定量分析手段。这种联用技术已被成功地用于定量分析药物、生物内源性代谢物、离子液体以及某些结构相似的极性化合物或其代谢的同时分离分析中。
Guo等[14]比较了用RPLC-MS 和HILIC-MS 方法分析人尿样中常见含氮类化合物的区别，发现对于这些极性化合物， HILIC-MS的灵敏度较高，且能检测出该类代谢物的数目也远多于 RPLC-MS方法。Pei li[15]等采用HILIC-MS技术用于进行可替宁在小鼠的血浆和脑组织中代谢和含量测定，发现HILIC-MS与LC-MS相比较，灵敏度更高。
4.2 HILIC的在线联用
对于复杂基质中的靶标物质，通过引入柱切换技术，选用较短的预柱或固相萃取固相微萃取（SPE/SPME ）手段，将目标组分从复杂基质背景中分离萃取出来，并通过电磁阀和管线转移至分析柱上进行分离，可以完成包括除盐、去蛋白、捕集和浓缩痕量组分等样品预处理过程，实现预处理和分析过程的在线联用。除了能够获得和离线处理过程相似的分析结果外，还能有效减小分析误差，节约人力和时间，节省样品量和溶剂使用量，提高分析效率和自动化程度。目前，已有少量采用 固定相作为 HILIC填料用于样品分析的在线预处理步骤的报道。随着填料的不断发展和亲水性样品的分析任务的增加， HILIC在这方面的应用会有更多报道研究。
4.3 HILIC与RPLC的在线联用
在复杂样品的实际研究过程中，经常需要同时了解其中亲水性组分和疏水性组分的组成。采用一维液相色谱（无论 HILIC还是 RPLC）质谱联用技术只能获得其中一类代谢产物的信息。死时间流出的色谱峰通常被排除在后续数据分析过程之外，造成分析方法导致的代谢物信息丢失。但离线的操作方式耗时耗力，也容易引入偶然误差，对于代谢组学研究要求的样品分析通量和海量数据的可靠性，仍然有一定的差距。
HILIC-RPLC在线联用系统[16]具有操作简便、灵活性好、普适性强、分析通量高、数据处理方便，与常规一维分离相比能显著提高分析的分辨率和峰容量等优点，可以满足复杂样品中亲水性和疏水性组分同时定性定量分析的要求。可以检测出比常规HILIC-MS 方法更多的代谢物，有助于构建更加稳定和可靠的多变量数据分析模型，有利于发现更多的潜在标记物，从而得到更加全面和准确的代谢组学研究结果。
5. 结语与展望

色谱条件与样品前处理中所用有机溶剂兼容，可节约大量样品前处理时间，并与质谱尤其是 离子源质谱良好兼容，适用于药物研发中药理毒理学评价药 代动力学研究治疗药物监测和临床诊断研究中的高通量分析 实际上， HILIC的应用领域已不再局限于极性小分子药物及代谢物，相对非极性的化合物和多肽蛋白类药物的成功分析亦见报道[17]通过构建新型流路， HILIC与反相色谱的离线或在线结合应用可极大提高对复杂体系样品的分离效率，尤其适合代谢组学研究具有独特选择性的新型填料不断面世[18]，提供了更高的柱效更广的选择性和更好的耐用性 亦有采用固定相作为填料的报道，HILIC对复杂基质中亲水性样品进行除盐等预处理[19]近年来，可用于HILIC 分离的毛细管整体柱[20]和微控流芯片[21]等新技术不断兴起，拓宽了 HILIC的应用领域有研究发现流动相如使用含高浓度二氧化碳的乙醇-水体系，能达到与高污染的传统乙腈水体系相似的色谱表现，在化学研究更加关注环保的今天具有重要启发意义。
目前，HILIC模式的分离机理还不是十分明确，HILIC存在着多种复杂的相互作用。此外，对主要的 HILIC色谱柱进行系统的色谱评价也是推广HILIC 应用的基础，但是当前缺乏的评价方法和评价样品。色谱柱生产商评价色谱柱时所选择的样品也不尽相同，大多数只是给出少数几个样品的柱效，不能全面地反映色谱柱的特性。随着HILIC 在体内药物分析应用逐渐广泛,需要建立包含几种典型极性（亲水）物质的 HILIC色谱柱“评价样品体系”，为HILIC 应用中色谱柱的选择提供参考以及系统研究并阐明其分离机制将是今后的重要研究课题之一。

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