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实验二 从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定
土壤是微生物生活的大本营，微生物的种类和数量极其丰富，从土壤中可分离、纯化得到许多有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程即微生物的分离纯化，常用平板分离法，为获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、T、氧气等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂抑制其他菌生长，从而淘汰其他不需要的微生物，如高氏一号，加酚液为抗菌药物，抑制细菌，马丁氏加孟加拉红、氯霉素（类抗生素，还有红霉素、磺胺，抑制细菌和放线菌，不抑真菌），再用平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌株。
第一部分 培养基的配制
一、 实验目的和内容
目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。
内容：1、牛肉膏蛋白胨培养基的配制；2、高氏一号培养基的配制；
3、马丁氏培养基的配制。
二、 实验材料和用具
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、氯霉素、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4.3H2O、MgSO4.7H2O、FeSO4.7H2O。
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布。
三、 操作步骤
（一） 牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15~20g、水1000ml、pH7.4~7.6。
1、称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速，并及时把试剂瓶盖紧.
2、加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。
3、调pH 用pH试纸或酸度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/LHCl进行调节。pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4、过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养结果的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。
5、分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。（分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。）分装量：固体培养基约为试管高度的1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。
6、加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7、包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8、灭菌 将上述培养基于121.3oC 湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9、摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2；待其凝固。
10、无菌检查 将灭菌的培养基放入37oC温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。
（二） 高氏1号培养基的配制
高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：
可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g,K2HPO4.3H2O 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 琼脂15~20g, 水1000ml, pH7.4~7.6。
1、称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。对微量成分FeSO4.7H2O可先配成高浓度的储备液后再加入,方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4.7H2O,配成浓度为0.01g/mL的储备液,再在1000mL培养基中加入以上储备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2、pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同（一）。
（三） 马丁氏培养基的配制
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：
K2HPO4 1g， MgSO4.7H2O 0.5g, 蛋白胨5g, 葡萄糖10g, 琼脂15~20g, 水1000ml，自然pH
1、称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需量的水中。待各成分溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3ml,混匀后,再加入琼脂加热融化,方法同(一).
2、pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同（一）。
3、氯霉素的加入 氯霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化待温度降至45oC左右时才能加入。可先将氯霉素配成1%的溶液（配好的氯霉素溶液保存于-20oC），在100ml培养基中加入1%氯霉素0.3ml，使每毫升培养基中含氯霉素30μg。
四、注意事项
1、在配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免金属离子进入培养基中，影响细菌生长。
2、称药品用的牛角匙不要混用。
3、称完药品应及时盖紧瓶盖。
五、实验报告
写出本实验培养基的名称、数量、配制过程，并指明要点。
六、问题与思考
1、 配制培养基有哪几个步骤？在操作过程中应注意些什么问题？为什么？
2、 培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌？若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基如何进行无菌检查？
3、 在马丁氏培养基中加入氯霉素的目的是什么？

第二部分 消毒和灭菌
一、实验目的和内容
目的：了解消毒和灭菌的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。
内容：1、高压蒸汽灭菌； 2、干热灭菌法； 3、过滤除菌法。
二、实验材料和用具
待灭菌的培养基（实验1）和链霉素溶液、自动立式压力蒸汽灭菌器、移液管、手提式高压蒸汽灭菌锅、干热消毒箱、培养皿、试管。
三、操作步骤
（一）高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。
I 自动立式压力蒸汽灭菌器的操作步骤
I-1 装料 开盖，把包扎好的灭菌物品放在灭菌桶内的筛板上，灭菌包体积一般不超过20cmX10cmX10cm为宜，各包之间留有间隙，以利于蒸汽穿透。在堆放灭菌包时应注意安全阀、放汽阀孔位置必须留出空位，保障其畅通放汽，否则因安全阀出气孔堵塞不能工作造成事故。
I-2 开机
I-2-1 加水：接上本机标牌一致的电源，将控制面板上电源开关按至ON处，此时断水灯（黄色）亮，显示电源已正常输入。低水位灯（红色）亮，显示蒸发锅内处断水状态，然后将灭菌桶盖罩住灭菌桶，把生活用水从灭菌桶与蒸锅夹缝内加入，当水位达到高水位时，以上两灯同时灭。此时，应继续加水到高水位灯（绿色）亮时停止。
I-2-2 设定温度：数显窗内，红色数显为灭菌桶内温度，绿色数显为设定温度。按动控制板上增加键或减少键，可在绿色数显上设定所需温度，按动位移键可将闪烁的绿灯数显进位移位设定，当每次所需温度结束时，须按一下确认键进行确认，即可完成设定。此时，红色数显随着蒸发锅内温度上升而变化。
I-2-3 设定时间：温度设定完毕并按确认键后，绿色数显切换成定时状态，按位移键定位，然后再按增加键和减少键，设定所需的保温时间，设定完毕后，须按一下确认键进行确认。保温时间采用倒计时，当灭菌锅内温度达到设定温度时，定时器才开始计时。如在运行过程中要查看时间数和设定温度数，只要按一下确认键，便可切到所需的数显进行阅读。
I-3 密封：以上操作完成后，将压板完全推入固定柱内，将手轮向右旋紧，使盖与主体密封。
I-4 灭菌
I-4-1 排气：为了保证温控仪与灭菌室温度的一致，应将灭菌室内的冷空气排除干净，具体可在加热开始时打开放气阀，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气阀孔排出，一般认为，当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内空气已排净（沸后约5min），然后关上排气阀。同时将下排气阀稍稍的打开，让微量的蒸汽通过下排气阀在整个灭菌过程中不断排出，这样有利于灭菌室上下部温度保持同步。
I-4-2 当设定时间结束时，电控装置自动关闭加热电源，并伴有蜂鸣提醒。此时，应将电源关闭。
I-4-3 灭菌结束后，待其冷却，直至压力表指针回复至0位后，打开排放气阀再待数分钟排去余汽，才能将盖打开，取出灭菌物品，排掉剩水。
II 手提式高压蒸汽灭菌锅（演示）
（二）干热灭菌法
干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、过滤器、移液管等的灭菌。使用的仪器为干热消毒箱。
1、装入待灭菌物品 预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放入消毒箱中，关闭箱门。
2、温度与时间的设定 打开电源开关，在控制面板上对温度和时间进行设定，本实验所需温度为160~170oC，当温度上升到所设定的温度后，计时开始，一般设定时间为2h。
3、灭菌过程 当温度上升到设定的温度后，维持所需（设定）时间，设定时间一结束，数显示窗显示“End”，加温电源切断，并有声音提醒，关闭电源。
4、取出灭菌物品 待消毒箱 温度降到70oC以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。
（三）过滤除菌法
有些物质，如抗生素、血清、维生素等易受热分解，因而要采用过滤除菌法。
目前常采用的过滤器主要为滤膜过滤器，其操作过程如下：
1、按图2-1进行安装，为阻止空气中细菌进入过滤瓶而在接管处塞入棉花，外用纸包好进行121oC湿热灭菌20min。

2、在洁净工作台上，把过滤器与真空泵连接；加入所需灭菌的液体，开动真空泵进行抽滤。抽滤结束后，切断真空泵电源；打开过滤器，取出过滤液备用或保存。
3、过滤器拆装与整理。
四、注意事项
1、使用高压灭菌锅应严格按照操作程序（加水、排冷空气、降零）进行，避免发生事故；灭菌时操作者切勿擅自离开。
2、干热灭菌时消毒箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与消毒箱内壁的钢板接触，以防包装纸烤焦起火。
3、过滤除菌时应检查过滤装置是否漏气，以防污染。
五、实验报告
1、 记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。
2、 试述高压蒸汽灭菌的操作过程及注意事项。
六、问题和思考
1、 比较各种灭菌方法的原理及适用范围。
2、 高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压？
3、 在检测某水体是否存在病毒的实验中，如何排除细胞型生物的干扰？试设计一实验。

第三部分：从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定
一、 实验目的和内容
目的：1、学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作等技术。
2、识别细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物的菌落特征。
内容：1、用选择培养基、梯度稀释法分离细菌、放线菌、霉菌和酵母菌。
2、用平板划线方法纯分离微生物；3、学习斜面接种操作技术。
4、根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。
二、 实验材料和用具
已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基、马丁氏固体培养基各1瓶，49.5mL无菌水（带玻璃珠）1瓶，100mL无菌水1瓶、已灭菌的80%乳酸、10%酚液、95%乙醇。
无菌培养皿、1mL无菌移液管10支、土壤样品、天平、称量纸、药匙、试管架、接种环、酒精灯、洁净工作台。
三、 操作步骤
（一） 土壤稀释分离
1、取土壤样品 取表层以下5~10cm处的土壤样品，放入灭菌的袋中备用，或放在4oC冰箱暂存。
2、制备土壤稀释液
本操作过程在洁净工作台内进行。
（1）制备土壤悬液：取土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠并装有49.5mL无菌水的三角瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底1/2为好），振荡5~10min，使土样充分打散，即成10-2的土壤悬液。
（2）稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液1ml,放入9ml的无菌水中,即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3~10-8的稀释液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支移液管，每次吸土液，要将移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。
3、混菌法测定菌落数的方法
（1） 细菌：在洁净工作台内，取10-7、10-6两管
稀释液各1ml,分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度
做两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏蛋白胨培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满皿底的2/3为宜），迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板，倒平板时要注意无菌操作，倒平板的方法见图3-1。
（2） 放线菌：取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液5~6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管 图3-1
吸出1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。
（3） 霉菌：取10-2、10-3两管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。在熔好的马丁氏固体培养基中，每100ml加入灭菌的乳酸1ml（淡黄色），轻轻摇匀；再滴入0.3 ml，摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌平板。
（4）酵母菌* 若土样取自果园或菜园的土壤，在（3）即可能分离到。
4、培养 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28~30℃恒温培养，细菌培养1~2d，放线菌培养5~7d，霉菌3~5d。便可观察菌落特征并计数，各培养物可用于进一步纯化分离或直接转接斜面。
（二） 平板划线分离微生物
1、倒平板 按无菌操作要求，在洁净工作台或在火焰旁操作（图3-1），取融化并冷却至不烫手的固体培养基（约50℃），倒入无菌培养皿，倒量以铺满皿底为限，平放待其冷却凝固，备用。
补充无菌操作：紫外灭菌30min→风机打开→5 min后可开始操作→75%酒精消毒挥发后再点酒精灯→酒精灯无菌区r=5cm
2、划线分离 使用接种环，灼烧灭菌后，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平板划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落（用于鉴定、扩大培养、保存）。
菌落号
培养基
湿
干
菌 落 描 述
判断结果
厚薄
大小
松密
大小
表面
边缘
隆起形状
颜色
透明度
正面
反面
水溶性色素
1
2
3
4
5
6
7
8

3、培养方法 同（一）4。
4、菌落观察 从培养好的未知平板中，挑选6-8个不同的单菌落，逐个编号，根据菌落识别要点区分未知菌落类群，并将观察结果填入表3-1。
（三） 斜面接种(掌心、斜面向上，管口灭菌→右手无名小指拔塞→底部至顶部划之字→管口硅塞灭菌)
1、取装有已灭菌的固体斜面培养基试管，分别做好标记（写上菌名，日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上培养基斜面中。
2、接种方法 用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部。注意划线要轻，不可把培养基划破。
3、接种后恒温培养，方法同（一）4。

表4-1 未知菌落的形态观察记录表

四、 注意事项
1、一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。
2、在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，更换一次移液管，使计数准确。
3、放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。
4、观察菌落特点时，要选择分离得很开的单个较大菌落，对培养皿和试管要编好号码，请勿随意移动开盖，以免搞混菌号。
五、 实验报告
1、 记录土壤稀释分离结果，计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌或放线菌的数量。
计算方法：选择长出菌落数20~300之间的培养皿进行计数，按以下公式：
总菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数х稀释倍数
2、 分别记录平板划线、斜面接种的结果，并进行自我评价。
3、 记录未知菌落的辨别结果（填表4-1）。
4、 上交代表细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的斜面试管种各一支，并附各自菌落形态特征观察记录。
六、 问题和思考
1、 在测定土壤微生物含量中，除混菌法还有什么方法？
2、 比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌菌落形态的差异？
3、 设计一个实验，检测实验室空气环境中的微生物类别？

附件：四大类微生物菌落和细胞形态特征的比较(*指高倍镜观察**指用低倍镜观察)
微生物
菌落特征
单细胞微生物
菌丝状微生物
细菌
酵母菌
放线菌
霉菌

主要特征
菌落
含水状态
很湿或较湿
较湿
干燥或较干燥
干燥
外观形态
小而突起或大而平坦
大而突起
小而紧密
大而疏松或大而致密
细胞
相互关系
单个分散或有一定排列方式
单个分散或假丝状
丝状交织
丝状交织
形态特征*
小而均匀，个别有芽孢。
大而分化
细而均匀
粗而分化

参

考

特

征
菌落透明度
透明或稍透明
稍透明
不透明
不透明
菌落与培养基结合程度
不结合
不结合
牢固结合
较牢固结合
菌落颜色
多样
单调、一般呈乳脂或矿烛色，少数红或黑色。
十分多样
十分多样
菌落正反面颜色的差别
相同
相同
一般不同
一般不同
菌落边缘**
一般看不到细胞
可见球状、卵圆状或假丝状细胞
有时可见细丝状细胞
可见粗丝状细胞
细胞生长速度
一般很快
较快
慢
一般较快
气味
一般有臭味
多带酒香味
带有泥香味
往往有霉味

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