新型冠状病毒Omicron变异株RBD二聚体蛋白抗体的制备与鉴定.pdf
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1、2023,45(4)DOI:10.13836/j.jjau.2023090Acta Agriculturae Universitatis Jiangxienshttp:/江西农业大学学报 新型冠状病毒Omicron变异株RBD二聚体蛋白抗体的制备与鉴定王婷1,2,陶飞飞1,2,刘仕国1,2,余文捡1,2,王宇1,2,黎美凤1,2,李名志1,2,刘树荣1,2,王毅豪1,2,孔令保1,2*(1.江西农业大学 生物科学与工程学院,江西 南昌 330045;2.南昌市动物病毒与基因工程重点实验室,江西 南昌 330045)摘要:【目的】研究旨在构建新冠病毒 Omicron变异株(B.1.1.529)R
2、BD重组质粒 pET-28a-RBD-dimer,利用 E.coli BL21(DE3)原核细胞表达S-RBD二聚体蛋白并制备其多克隆抗体,用于研究Omicron变异株RBD的免疫学功能。【方法】运用 Golden Gate无缝克隆技术将密码子优化的 RBD二聚体基因克隆到 pET-28a载体中,构建pET-28a-RBD-dimer重组质粒。经表达条件优化后,以镍离子亲和层析法分离纯化RBD二聚体蛋白。将纯化的蛋白作为免疫原制备鼠源抗RBD二聚体蛋白的多克隆抗体,利用间接ELISA、IFA及Western blotting试验技术分别检测多克隆抗体的效价和特异性。【结果】ELISA试验结果显
3、示该多克隆抗体的效价高达1:256 000,IFA及Western blotting试验结果表明该多克隆抗体可特异性识别原核、真核细胞表达的RBD二聚体蛋白以及商业化RBD蛋白,具有较好的特异性、反应原性和灵敏性。【结论】研究成功使用原核细胞表达Omicron RBD二聚体蛋白,其具有较好的免疫原性,可以有效制备具有较高抗体效价、特异性及灵敏度的多克隆抗体,为进一步研究原核表达的RBD二聚体蛋白的生物学功能,Omicron变异株的鉴别诊断和亚单位疫苗的开发提供依据。关键词:Omicron变异株;受体结合域;原核表达;多克隆抗体中图分类号:Q71 文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OS
4、ID):文章编号:1000-2286(2023)04-0972-11Preparation and Identification of Antibody Against Dimerized RBD Protein of Novel Coronavirus Omicron Variant StrainWANG Ting1,2,TAO Feifei1,2,LIU Shiguo1,2,YU Wenjian1,2,WANG Yu1,2,LI Meifeng1,2,LI Mingzhi1,2,LIU Shurong1,2,WANG Yihao1,2,KONG Libao1,2*(1.College of
5、 Bioscience and Bioengineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.Nanchang Key Laboratory of Animal Virus and Genetic Engineering,Nanchang 330045,China)收稿日期:20230118 修回日期:20230220基金项目:国家自然科学基金项目(31860038,31960699)和国家级大学生创新训练计划项目(202210410032)Project supported by the National Nat
6、ural Science Foundation of China(31860038,31960699)and the National Innovation and Entrepreneurship Training Project for University Students(202210410032)作者简介:王婷,副教授,博士,orcid.org/0000-0002-0207-3778,;共同第一作者;*通信作者:孔令保,教授,博士生导师,主要从事病毒学研究,orcid.org/0000-0001-5459-8296,。王婷,陶飞飞,刘仕国,等.新型冠状病毒Omicron变异株RBD二
7、聚体蛋白抗体的制备与鉴定 J.江西农业大学学报,2023,45(4):972-982.WANG T,TAO F F,LIU S G,et al.Preparation and identification of antibody against dimerized RBD protein of novel coronavirus omicron variant strainJ.Acta agriculturae universitatis Jiangxiensis,2023,45(4):972-982.第 4 期王婷等:新型冠状病毒Omicron变异株RBD二聚体蛋白抗体的制备与鉴定Abstr
8、act:Objective This study aims to construct the RBD recombinant plasmid pET-28a-RBD-dimer of novel coronavirus Omicron variant strain(B.1.1.529),express the S-RBD dimer protein using prokaryocyte E.coli BL21(DE3)and prepare polyclonal antibodies to study the immunological function of Omicron RBD.Meth
9、od The codon optimized RBD dimer gene was cloned into the pET-28a vector to construct the pET-28a-RBD-dimer recombinant plasmid by Golden Gate.After optimizing expression conditions,the RBD dimer protein was isolated and purified by Ni ion affinity chromatography.Murine polyclonal antibody against R
10、BD dimer protein was prepared by using the purified protein as an immunogen,the potency and specificity of the polyclonal antibody were determined by indirect ELISA,IFA,and Western blotting,respectively.Result The ELISA results showed that the titer of polyclonal antibody was 1 256 000.IFA and Weste
11、rn blotting results indicated that polyclonal antibody could specifically identify RBD dimer protein expressed by prokaryotes or eukaryotes,as well as commercial RBD protein,with good specificity,reactogenicity and sensitivity.Conclusion RBD dimer protein was expressed successfully by prokaryotes.Th
12、e protein has good immunogenicity,and it can be used to prepare polyclonal antibody with high titer,specificity and sensitivity.This study provides a basis for further study on the biological function of RBD dimer protein expressed in prokaryotic cells,the differential diagnosis of Omicron mutant st
13、rain and the development of subunit vaccine.Keywords:Omicron variants;receptor-binding domain;prokaryotic expression;polyclonal antibody【研究意义】新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)是由一种新出现的冠状病毒(SARS-CoV-2)所引起的急性呼吸道传染病。新型冠状病毒肺炎以发热、乏力、干咳为主要表现,严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克以及难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍1-2。新型冠状病毒
14、Omicron变异株于2021年11月9日首次在南非发现并报道,至2021年11月25日南非新增确诊病例2 465例,Omicron变异株占新增病例数的75%3。Omicron变异株导致早期病例数激增,引发公共医疗资源严重挤兑,导致防控难度加大,给预防和控制新型冠状病毒肺炎疫情带来新的挑战。【前人研究进展】与其他4种变异毒株(alpha、beta、gamma和delta)相比,Omicron变异株更容易传播和发生免疫逃逸4-5,主要原因在于广泛分布在Omicron多种蛋白上的突变,其中S蛋白上的突变位点高达30余个,这些突变可能对这种新变异株的传染性和抗体抗性产生影响6。尤其是 S 蛋白(re
15、ceptor binding domain,RBD)上的 15 个突变位点,包括 K417N、S477N、T478K、E484A、N501Y、G339D、S371L、S373P、S375F、N440K、G446S、Q493R、G496S、Q498R和Y505H,其上的任何突变都会引起人们对现有疫苗、单克隆抗体的功效和再感染可能性的担忧7。这是因为新型冠状病毒受体结合域(RBD)负责与细胞受体结合,在病毒进入细胞过程中发挥关键作用8-9。RBD具有促进S蛋白与宿主血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合的能力,这种S-ACE2结合有助于SA
16、RS-CoV-2进入宿主细胞并启动病毒感染过程。此外,研究表明S蛋白上的RBD和ACE2之间的结合自由能(binding free energy,BFE)与病毒感染性成正比,所以能够与RBD特异性结合的抗体将直接中和病毒并有效降低病毒感染性10。【本研究切入点】新冠病毒RBD是中和抗体(neutralizing antibodies,nAbs)的主要靶标之一11。然而,有研究表明原有疫苗对于Omicron变异株的预防效果有所下降 12。随着原有疫苗的预防作用减弱,开发Omicron变异株靶向疫苗对抗当前SARS-CoV-2变异株迫在眉睫。研究发现,RBD单体蛋白的免疫原性是有限的,相比传统的单
17、体,以RBD二聚体形式存在可提高抗体反应和中和抗体滴度13。目前还没有利用原核表达系统制备Omicron RBD二聚体蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体并进行分析与鉴定的相关报道。【拟解决的关键问题】本研究拟将新型冠状病毒Omicron(B.1.1.529)变异株的RBD基因进行密码子优化,构建pET-28a-RBD-dimer重组质粒并进行原核表达、纯化、鉴定及多克隆抗体的制备,以期为RBD二聚体蛋白的生物学功能的研究、Omicron变异株的鉴别诊断和亚单位疫苗的开发奠定基础。1 材料与方法1.1试验材料1.1.1细胞株、质粒及试验动物E.coli BL21(DE3)感受态细胞和E.coli DH5
18、感受态细胞购自吐露港 973江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷生物科技有限公司;原核表达载体 pET-28a、真核表达载体 pCAGGS-HA、pCAGGS-HA-JEV NS1、pCAGGS-HA-PEDV nsp15、pCAGGS-HA-ASFV B602L与HEK-293T细胞均由江西农业大学病原微生物研究所保存;Balb/c雌鼠(六周龄)购自湖南SJA实验动物有限公司,SPF级(动物生产许可证号:SCXK 2021-0002)。1.1.2主要试剂质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;T4 DNA连接酶和Bsa限制性内切酶购自NEB公司;PrimeSTAR高保真酶购自TaK
19、aRa公司;卡那霉素(Kana)、IPTG、蛋白胨、酵母粉购自北京索莱宝生物科技有限公司;Ni-NTA Agarose购自QIAGEN公司;His标签单克隆抗体(鼠源)、HA标签单克隆抗体(鼠源和兔源)、-actin单克隆抗体(鼠源)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗鼠购自武汉三鹰生物技术有限公司;四甲基联苯(tetramethylbenzidine,TMB)溶液、Alexa Fluor 555标记驴抗兔IgG(H+L)和Alexa Fluor 488标记山羊抗鼠IgG(H+L)购自碧云天生物技术公司;96孔酶标板购自康宁公司;弗式完全佐剂与弗
20、式不完全佐剂购自Sigma公司。1.2试验方法1.2.1生物信息学分析及 RBD 基因的合成通过 GenBank 数据库(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)获取Omicron(B.1.1.529)(GenBank:OW996240.1)S 蛋白受体结合域 RBD 的氨基酸序列,使用 IEDB(http:/www.iedb.org/)和Expasy Protscale(https:/web.expasy.org/protscale/)在线分析网站分别预测RBD蛋白的线性B细胞抗原表位和亲疏水性。委托北京擎科新业生物技术有限公司根据大肠杆菌的密码子偏好性对RBD二聚体蛋白进行密
21、码子优化与合成。1.2.2原核表达载体的构建以合成的RBD二聚体蛋白DNA序列为模板,RBD-dimer-F/RBD-dimer-R为引物,使用PrimeSTAR高保真酶扩增目的基因,并通过Golden Gate无缝克隆技术将目的基因克隆至pET-28a载体中,然后转化E.coli DH5感受态细胞获得含pET-28a-RBD-dimer质粒的转化子。随机挑取几个转化子,以T7/RBD-dimer-R为引物进行菌落PCR验证。提取菌落PCR验证正确的转化子质粒,使用T7/T7-ter通用引物进行双向测序验证。本研究使用的引物信息见表1。1.2.3RBD 二聚体蛋白的表达与诱导条件的优化接种含
22、pET-28a-RBD-dimer 质粒的 E.coli BL21(DE3)单菌落至10 mL LB液体培养基(50 g/mL Kana)中于37 振荡培养12 h,按1%比例转接后培养至OD600约为0.6时,加入IPTG诱导目的蛋白表达。首先,随机挑取6个单菌落按上述方法培养后于1 mmol/L IPTG、30 条件下诱导8 h,检测是否有目的蛋白表达。随后,按照控制变量法研究诱导温度、诱导剂浓度与诱导时间对蛋白表达量的影响,以12%的SDS-PAGE分析蛋白的表达情况。1.2.4RBD二聚体蛋白的分离纯化与鉴定按照1.2.3的方法培养后于0.6 mmol/L IPTG、36 诱导8 h进
23、行摇瓶发酵,发酵结束后离心收集菌体。经超声破碎后离心收集沉淀,洗涤后用8 mol/L尿素溶解,采用 Ni-NTA Agarose 亲和层析柱进行纯化。将 RBD二聚体蛋白经 SDS-PAGE电泳后转膜进行 Western blotting鉴定,一抗为鼠源抗His标签抗体(1 5 000),二抗为HRP-山羊抗鼠IgG(1 2 000),以ECL超敏化学发光液显影成像。1.3多克隆抗体的制备参考闫干干等14,陈云雨等15方法并稍作改进,将纯化的蛋白作为抗原免疫 4 只 6 周龄小鼠100 g/(次只),首次免疫使用弗氏完全佐剂,加强免疫使用弗氏不完全佐剂,均与等体积抗原充分乳化后腹腔注射。表1引
24、物信息Tab.1Primers sequence引物PrimerRBD-dimer-FRBD-dimer-RT7T7-ter引物序列Primer sequenceACCTGGGTCTACATGAGAGTCCAACCAACAGAATCTATACCTGGGTCTCAAAGCTTAGAAATTTACACATTTATTCTTCACAATAATACGACTCACTATAGGGGCTAGTTATTGCTCAGCGG 974第 4 期王婷等:新型冠状病毒Omicron变异株RBD二聚体蛋白抗体的制备与鉴定1.4抗体的效价检测参考Sun等16,任肖等17方法进行多克隆抗体的效价检测。设定血清初始稀释倍数为1
25、4 000,8个稀释梯度,每组3个复孔,37 孵育2 h;充分洗涤后每孔加50 L HRP-山羊抗鼠IgG(1 2 000),37 孵育1 h;充分洗涤未结合的二抗后,每孔加100 L TMB显色液,37 避光孵育15 min,用2 mol/L的H2SO4终止反应,再用酶标仪测定吸光值。终末点抗体滴度为读数高于阈值的血清稀倍数(阈值=阴性对照OD值+2SD平均OD值)18。1.5抗体的特异性鉴定1.5.1间接免疫荧光法鉴定(indirect immunofluorescence assay)参考陈金凤等19所述方法,将pCAGGS-HA-RBD-dimer 质粒转染 HEK-293T 细胞,培
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