选修一微生物实验.doc

选修一微生物实验（二）
　　　　　　　　　　果酒及果醋的制作
【实验原理】
　　酵母菌能以葡萄汁中的葡萄糖为原料，在无氧的条件下进行酒精发酵。
　　醋酸杆菌在有氧的情况下，可将酒精转变为醋酸。
【方法步骤】

　　【练习题】
　　1．是果酒和果醋醋作的实验流程和某同学设计的果酒和果醋的发酵装置。根据图示回答下列问题：
　　　　　　　　　（1）完成图1中的实验流程。
　　（2）冲洗的主要目的是洗去浮尘_，冲洗应特别注意不反复冲洗，以防止菌种的流失。
　　（3）图2装置中的充气口在果酒发酵时关闭，在果醋发酵时连接充气泵，并不断向内泵入无菌空气（氧）。
　　（4）排气口在果酒发酵时排出的气体是由酵母菌产生的二氧化碳，在果醋发酵时排出的是剩余的空气，为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？防止空气中微生物的污染；出料口的作用是取样的。
　　（5）在用玻璃瓶发酵生产时，必须对玻璃瓶用70%的酒精溶液_进行消毒，然后在玻璃瓶中加入葡萄汁，加入的葡萄汁不应超过玻璃体积的_2/3。
　　（6）若在果汁中混含有醋酸菌，在果酒发酵旺盛时，醋酸菌能否将果汁中的糖发酵为醋酸？说明理由。并写出醋酸菌的代谢类型及其酒精产生醋酸的反应式。　　　　不能。因为果酒发酵时缺氧能抑制醋酸菌的生长，且醋酸菌发酵条件是氧气充足 异养需氧型
　 　　　C2H5OH+O2 CH3COOH +H20+能量
（7）如何检验果酒制作是否成功？
发酵后取样，通过嗅味和品尝进行初步鉴定。此外，还可用显微镜观察酵母菌，并用重铬酸钾检验酒精的存在。
　　2．下面是家庭酿酒的具体操作过程：先将米煮熟，待冷却至30℃左右时，加少许水和一定量的酒药与米饭混合后均匀置于一瓷坛内，在中间要挖一个洞，加盖并简单密封后置于适当的地方保温（28℃左右）12小时既成。请根据上述过程回答以下问题：
　　⑴ 在米饭中央挖一个洞的目的是增加氧气量，保证菌种的数量尽快升到相应数值，此时酵母菌的繁殖方式主要是出芽生殖。
　　⑵ 有经验的主妇在家里酿米酒时,总会发现坛内先“来水”，后“来酒”。先来水的原因是酵母菌先进行有氧呼吸，产生了水 _；后“来酒”的原因是后来由于氧气减少，酵母菌进行酒精发酵而产生酒精。
　　⑶ 请写出“来酒”过程的生化反应方程式⑶ C6H12O6 2C2H5OH+2CO2+能量
　　⑷ 酒药中含有曲霉、毛霉和酵母等多种微生物，酿米酒的反应分糖化和酒化两个过程。糖化指的是曲霉和毛霉能把米饭中的淀粉转化为葡萄糖；酒化则是指酵母菌在没有氧气地条件下，把葡萄糖分解成酒精。如果酒酿制时间加长？味道如何变化？为什么？⑷ 甜度降低，酒味变浓，更多的葡萄糖通过酵母菌的无氧呼吸转化为酒精。
　　⑸ 制作过程并未对用具专门进行灭菌，坛口也未严格密封，但一般情况下，坛内的米饭不会被杂菌污染，试简要阐明原因：
　　　 ① 初始阶段由于接种了酵母菌，使酵母菌在与杂种的竞争中占据优势。
　　　 ② 发酵过程中在与杂菌的竞争中，酵母菌产生的酒精可抑制杂菌的生长繁殖下降，酵母菌等微生物的呼吸作用消耗有机物。
　　⑹ 根据推测，在此酿制过程中，坛内物质的重量会下降，酵母的呼吸作用消耗有机物,原因是酵母的呼吸作用消耗有机物。　　⑺ 请你画出酵母菌种群数量变化的曲线。　　　　
　3．低度的果酒、果醋不但好喝，还具有一定的保健养生功能。下图是两位同学制果酒和果醋时使用的装置。

　　同学甲用A（带盖的瓶子）装置制葡萄酒，在瓶中加入适量葡萄汁，发酵温度控制在18~25℃，每隔12h左右将瓶盖拧松一次（注意不是打开瓶盖），之后再将瓶盖拧紧。当发酵产生酒精后，再将瓶盖打开，盖上一层纱布，温度控制在30~35℃，进行制果醋的发酵。
　　同学乙用B装置，温度控制与甲相同，不同的是制果酒阶段除充气口用夹子夹紧外，排气的橡胶管也用夹子夹住，并且每隔12h左右松一松夹子放出多余的气体。制果醋阶段适时向充气口充气。经过20天左右，两位同学先后完成了自己的发酵制作。据此回答有关问题：
　　⑴ 酵母菌与醋酸杆菌在结构上的最大区别是后者无成形细胞核。从制酒和制醋两阶段对装置的处理方式判断，酵母菌和醋酸杆菌的异化作用类型依次是兼性厌氧型、需氧型。
　　⑵ 同学甲在制酒阶段，每隔12h左右就要将瓶盖拧松一次，但又不打开，这样做的目的是放出CO2(制酒阶段的后期，酵母菌无氧呼吸会产生大量气体，如不及时放出会把瓶子或瓶盖胀破)；不打开瓶盖，是防止氧气和有害杂菌进入。
　　 用反应式表示出A和B装置酿酒过程刚开始时发生的主要化学变化：

　　⑶ B装置中排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连，这样做的原因是排出CO2，防止污染。
　　⑷ 制葡萄酒时要将温度控制在18~25℃，而制葡萄醋时要将温度控制在30~35℃，原因是酵母菌和醋酸菌发酵的最适温度不同（18~25℃是酵母菌生长和发酵的合适温度，30~35℃是醋酸菌的生长和发酵的合适温度）；碳源、氮源、水、无机盐和生长因子。葡萄汁为酵母菌、醋酸杆菌等微生物的生长提供的营养成分是碳源、氮源、水、无机盐和生长因子。
　　⑸ 制作过程一般不需额外添加酵母菌和醋酸杆菌即可完成。为了提高果酒品质也可在果汁中加入人工培养的酵母菌。利用选择培养基可分离获得较为纯净的酵母菌菌种。　
　　　　　　　　　腐乳的制作
实验原理
　　1．参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉。
　　2．毛霉是一种丝状真菌，常见于土壤、水果、蔬菜、谷物上，具有发达的白色菌丝。
　　3．毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。
实验步骤
　　1、制腐乳胚
　　（1）将豆腐切成3cm×3cm×1cm的若干块。所用豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。
　　2、让豆腐块长出毛霉
　　（1）将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内，粽叶可以提供菌种，并能起到保温的作用。每块豆腐等距离排放，周围留有一定的空隙。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时，将平盘用保鲜膜包裹，但不要封严，以免湿度太高，不利于毛霉的生长。
　　（2）将平盘放入温度保持在15～18℃的地方。毛霉逐渐生长，大约5d后豆腐表面丛生着直立菌丝。
　　（3）当毛霉生长旺盛，并呈淡黄色时，去除包裹平盘的保鲜膜以及铺在上面的粽叶，使豆腐块的热量和水分能够迅速散失，同时散去霉味。这一过程一般持续36h以上。
　　3、腌制
　　（1）当豆腐凉透后，将豆腐间连接在一起的菌丝拉断，并整齐排列在容器内，准备腌制。 （2）长满毛霉的豆腐块（以下称毛坯）与盐的质量分数比为5∶1。将培养毛坯时靠近平盘没长直立菌丝的一面统一朝向玻璃瓶边，将毛坯分层盘立摆放在容器中。分层加盐，并随层加高而增加盐量，　　　 　在瓶口表面铺盐厚些，以防止杂菌从瓶口进入。约腌制8d。　　〔注〕用盐腌制时，注意盐都用量。盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。
　　4、加卤汤调味
　　1）将黄酒、米酒和糖，按口味不同而配以各种香辛料（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等）混合制成卤汤。卤汤酒精含量控制在12％左右为宜。〔注〕酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。
　　2）将广口玻璃瓶刷干净后，用高压锅在100℃蒸汽灭菌30min。将腐乳咸坯摆入瓶中，加入卤汤和辅料后，将瓶口用酒精灯加热灭菌，用胶条密封。在常温情况下，一般六个月可以成熟。
注意事项
　　1．酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵所发生的主要变化是毛霉在豆腐（白坯）上的生长。发酵的温度为15～18℃，此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长。毛霉生长大约5d后使白坯变成毛坯。前期发酵的作用，一是使豆腐表面有一层菌膜包住，形成腐乳的“体”；二是毛霉分泌以蛋白酶为主的各种酶，有利于豆腐所含有的蛋白质水解为各种氨基酸。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制并配入各种辅料（红曲、面曲、酒酿），使蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。
　　2．毛霉是一种低等丝状真菌，有多个细胞核，进行无性繁殖。毛霉是食品加工业中的重要微生物，它可以产生能够分解大豆蛋白的蛋白酶，常用于制作腐乳和豆豉。
　　【练习题】
　　1．绍兴腐乳独具特色，它采用优质黄豆作为原料，经严格筛选，再经浸泡、冲洗、磨煮、滤渣、点浆、压坯、划坯成型。再将白坯放入竹笼后喷洒万分之二的毛霉菌种，在20℃左右的气温下，经5天左右的前期发酵，即可腌渍，加盐量为毛坯的30%，一层毛坯加盐一层，在室温20℃左右的情况下，经10天腌渍即成腌坯。正常腌坯色泽黄亮、坚硬，四角方整，由毛霉形成一层表皮，即可装入坛中，进行后期发酵。入坛时加入佐料即黄酒、红曲浆，酱籽及花椒等，用荷叶封口后堆叠，在25～30℃环境下，经5～6个月即可成熟。请结合以上材料，回答下列问题：
　　（1）请总结出做腐乳的制作流程图：

　　（2）腐乳制作的原理主要利用了微生物产生的蛋白酶等酶类，通过发酵，豆腐中营养物质的种类
　　　 　增加，且更易于消化和吸收。
　　（3）制作腐乳时含水量为70％左右的豆腐较适宜；用盐腌制时，注意控制盐的用量是因为盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味。
　　（4）若你完成了腐乳制作，则可以从色泽、口味、块形等方面评价乳腐的质量。　　【练习题解析】
　　1．　　（1）

　　2．根据王致和发明腐乳的传说，并请回答下列问题：

　　(1) 王致和发现没卖出的豆腐长出了白毛，豆腐长白毛其实是毛霉的白色菌丝。
　　(2) 在腐乳制作的过程中，起主要作用的是微生物毛霉，毛霉是一种丝状的真菌，属于真核细胞生物，乳酸菌与其结构相比，主要的区别是乳酸菌无成形的细胞核。
　　(3) 腐乳与豆腐相比，优点之一是易于吸收，原因是毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成肽和氨基酸，产生的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸等小分子有机物。
　　　　泡菜的腌制及亚硝酸盐的测定
【实验原理】
　　腌制泡菜的原理：在无氧的条件下，天然微生物乳酸菌、假丝酵母等利用蔬菜中的糖或其他营养物质进行发酵，产物有乳酸、醇类等物质，不仅使泡菜酸脆可口，也抑制了杂菌的生长。
　　在腌制泡菜的发酵过程中，也会产生一定量的亚硝酸盐。（亚硝酸盐在食品生产中常用做食品添加剂，起到增色和防腐作用。膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但人体摄入总量达0.3~0.5g时，会引起中毒，总量达3g时，会引起死亡。我国卫生标准规定，亚硝酸盐的残留量在肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，而婴儿奶粉中不得超过2 mg/kg。）　　所测试材料沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，其亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应 ，这一产物再与N－1－萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电或分光光度计比色法定量测定或目测比色法。【试剂】
　　提取试剂：氯化铵缓冲溶液（pH 9.7）；硫酸锌溶液（0.4mol/L）；NaOH溶液（2mol/L）　　显色剂：对氨基苯磺酸溶液和N－1－萘基乙二胺溶液等体积混合液　　亚硝酸钠标准溶液测定液：（浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.5μg/mL)【实验步骤】　　　　　
【详细步骤】
　　一、泡菜的腌制
　　1．配制盐水：按清水和盐4：1比例配制盐水，煮沸后冷却备用。
　　2．蔬菜洗净，切成适当大小块。
　　3．将蔬菜、糖及调味品放入洗净的泡菜坛中至8成满，注入盐水，浸没蔬菜、如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸一分钟入坛，再加点白酒。
　　4．将坛口用水封好，防止外界空气进入。
　　5．一周后，可开坛食用，也可随时加入蔬菜，不断取用。如果腌制时加入一些已经腌制过的泡菜汁，可减少腌制时间。
　　二、亚硝酸盐的测定
　　本实验分组进行，研究新鲜蔬菜及腌制不同时间的泡菜亚硝酸盐含量．
　　㈠样品处理
　　1．称量25g泡菜及少量泡菜汤，用榨汁机榨汁，用四层纱布和漏斗过滤至500ml烧杯中，用100ml水洗涤研钵两次，洗涤液均过滤至烧杯中。
　　2．用NaOH溶液将滤液调制pH8.0后，加入25mL硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再加入NaOH至产生白色沉淀为止。
　　3．在60℃热水浴中，将样品提取液加热10分钟后，令其冷却至室温，至于500ml容量瓶中，定容。滤纸过滤出50ml溶液作为待测样品。
　　㈡配制标准溶液，样品亚硝酸盐含量测定
　　1． 绘制标准曲线
　　1）分别取0、0.5、1.0、3.0、5.0mL（分别为0、0.1、0.2、0.3、0.5μg/ml)亚硝酸钠标准溶液+4.5mL氯化铵缓冲液+ 2.5 mL 60%乙酸 + 5mL显色液→25mL容量瓶，加水定容混匀，暗处静置25min。
　　2．样品亚硝酸盐含量测定
　　1）分别取10mL待测样品+ 4.5mL氯化铵缓冲液+ 2.5 mL60%乙酸 + 5mL显色液→25mL容量瓶，加水定容　混匀，暗处静置25min。与上述标准溶液进行颜色的比对
　　2）用光程为1cm的比色杯在550nm处测光密度值。以10mL水为空白对照。以亚硝酸钠质量为横坐标，以
　　　 光密度（OD）值为纵坐标，用已知浓度亚硝酸钠标准液绘制标准曲线的同时，在标准曲线上，根据
　　　 待测样品的OD值得出其亚硝酸盐含量m2。
　　【练习题】
　　1．根据教材中泡菜的制作及测定亚硝酸盐含量的实验流程示意图，请回答：（1）制作泡菜宜选用新鲜的蔬菜或其他原料，原因是亚硝酸盐的含量低
　　（2）制备泡菜的盐水中清水与盐的质量比约为4：1 加热煮沸是为了杀灭杂菌，冷却是为了保证乳酸菌的生命活动不受影响 盐有抑菌、渗出蔬菜中过多的水以及调味的作用
　　（3）泡菜风味形成的关键在于调味料的加入。
　　（4）泡菜的制作方法不当，很容易造成泡菜变质，甚至发霉变味，试分析可能的原因：泡菜坛子密封不严或取食工具不卫生，或盐的比例太小都会引起杂菌滋生、泡菜变质
　　（5）发酵过程中应定期测定亚硝酸盐的含量，原因是亚硝酸盐对人体有害，发酵不同时期亚硝酸盐的含量会发生变化，及时检测是为了把握取食的最佳时机
　　（6）测定亚硝酸盐含量的方法是目测比色法或分光光度计测定法
　　2．关于测定亚硝酸盐含量的原理的正确叙述是C
　　A．重氮化 酸化 显色 比色
　　B．重氮化 酸化 比色 显色
　　C．酸化 重氮化 显色 比色
　　D．酸化 重氮化 比色 显色
　　3．泡菜是人们日常生活中比较喜欢的一种食品，但是泡菜中却含有亚硝酸盐。当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.3g - 0.5g时，会引起中毒，达到3g时，会引起死亡。我国卫生标准规定，亚硝酸的残留在酱菜中不得超过20mg/kg。膳食中的绝大部分亚硝酸盐在人体内以“过客”的形式随尿液排出，只有在特定的条件下，才会转变成致癌物质-亚硝胺。针对泡菜在发酵过程中会产生亚硝酸盐的事实，某中学生物小组设计实验，探究不同食盐浓度和发酵时间对亚硝酸盐含量变化的影响。
　　（1）请补充实验设计的空缺内容：
　①制作泡菜的原理：利用乳酸菌在无氧的环境下大量繁殖并发酵产生乳酸而制作泡菜　②测量指标及方法：亚硝酸盐与某些化学物质发生反应后形成玫瑰红色。先使泡菜样品及一系列已知浓度的亚硝酸盐溶液分别与化学物质发生显色反应，然后通过对比颜色，　可以估测出泡菜液样品亚硝酸盐的含量。　　③确定浓度梯度：经过查找资料和初步实验，发现当食盐浓度为3%以下时，制作的泡菜溶液发生腐败，而当食盐浓度在8%以上时，制作的泡菜又容易成为咸腌菜。因此，分别设计了3%、5%、　7%的食盐浓度梯度来制作泡菜。
　 　　　④选择实验材料：红萝卜和白萝卜，哪种更适合于用做实验材料白萝卜，理由是避免植物中色素对显色反应的干扰。
　 　　　⑤制作泡菜：将实验材料分成3组制作泡菜，除了实验材料的重量相同外，还要保证每组泡菜　的制作（或培养、发酵）条件相同。
　 　　　⑥从第三天开始，定期测定泡菜中的亚硝酸盐含量。
　　（2）下图是该生物活动小组记录的三种食盐浓度的泡菜中的亚硝酸盐含量mg与发酵天数的关系图。根据此图实验结果，请你给出制作泡菜的最佳指导意见。

　　　用5%的食盐浓度制作泡菜比较适合食用，但要在发酵时间达
　 　　　10天以后食用才比较适宜

微生物培养与应用基础知识
2．1．1培养基配制原理：微生物的生长繁殖时需要各种营养物质，一般包括水、无机盐、碳源和氮源，有的还需要少量特殊营养物质（生长因子）根据微生物的种类和实验目的不同，选择不同的原料配制不同培养基。本课题使用牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基，也称普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏为细菌提供碳源和能源，磷酸盐；蛋白胨主要提供氮源；而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入琼脂作凝固剂。在培养细菌时要用稀酸或稀碱将pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖
2．1．2 无菌操作原理：针对不同对象采用不同的消毒和灭菌的方法，在高温、高压、化学药剂、强酸和强碱作用下，使微生物蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目的。
 定义
常用方法
 微生物培养和组培的应用
消毒
使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分菌体,但不伤及活组织
煮沸
玻璃仪器
紫外线
实验室、操作台、衣物等
酒精溶液
手、外植体等
次氯酸钠溶液等
外植体
灭菌
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有菌体、芽孢和孢子
高压蒸汽
培养基、玻璃仪器、棉塞、牛皮纸等
灼烧
接种环、涂布器等
干热
玻璃仪器
2．1．3 纯化大肠杆菌的原理：为了获得某种微生物的纯培养，选用平板划线法或稀释涂布平板法，在牛肉膏蛋白胨培养基上操作，经培养后可分离得到有单个细胞繁殖而来的子细胞群，即菌落。 实验流程

配制合适的培养基
配制牛肉膏蛋白胨培养基操作时注意：（1）溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，以免培养基溢出或糊底引起烧杯破裂；（2）加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度；（3）培养基各种成分溶化后灭菌前要根据培养微生物需要调节pH（4）一般是培养基先灭菌再倒平板，倒平板操作必须在酒精灯火焰旁进行，并且不要将皿盖完全打开；（5）冷却后的平板要倒置，以确保拿放方便，同时避免水分蒸发，以利微生物生长。
接种操作
微生物接种方法有两种，一是平板划线接种，即用接种环划线将菌体沾在斜面培养基或平板培养基上。微生物的生长和繁殖迅速，一段时间后，就会在培养基表面形成长满菌落的细线。划线法的作用是纯化微生物，通过划线将微生物单个地分离，并最终形成标准的菌落。划线操作时注意：（1）用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；（2）划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾区不能相连；（3）操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。
二是稀释涂布平板接种，即先将菌液进行一系列梯度稀释，用涂布器将不同稀释度的菌液均匀地涂布在平板上进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，通过统计菌落数可以计算样品中的菌体数目，。涂布操作时注意：（1）配制系列梯度稀释液必须用无菌水配制；（2）配制系列梯度稀释液和转移菌液以及涂布过程等必须都在酒精灯火焰旁进行。 
培养操作
将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h和24h。（未接种的用来检测培养基灭菌是否彻底。）