新型冠状病毒主蛋白酶及其抑制剂研究进展.pdf
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1、综 述基金项目:国家自然科学基金项目,N o.8 1 6 7 2 0 4 2;北京市自然科学基金项目,N o.7 2 1 4 2 1 3作者简介:刘琪彧,大学本科,研究方向:病原免疫学和结构生物学。E-m a i l:l i u q i y u 2 0 0 11 2 6.c o m作者单位:1 0 0 0 6 9 北京,首都医科大学 基础医学院病原生物学系通信作者:贾智惠,讲师,E-m a i l:j i a z hc c m u.e d u.c n;诸欣平,二级教授,E-m a i l:z h u x p i n g c c m u.e d u.c n新型冠状病毒主蛋白酶及其抑制剂研究进展刘
2、琪彧,贾智惠,诸欣平 摘 要 新型冠状病毒肺炎(C O V I D-1 9)是由新型冠状病毒(S A R S-C o V-2)引起的传染性疾病,而主蛋白酶具有高度的序列保守性,在冠状病毒生命周期中起关键作用,是理想的抗病毒药物设计靶标。本文概述了S A R S-C o V-2主蛋白酶的结构和催化反应机制,并根据主蛋白酶抑制剂结构和机制的不同,将已报道的抑制剂分为肽模拟抑制剂和非肽类小分子抑制剂两类,其中以P a x l o v i d为代表的肽模拟抑制剂,根据其基团可分为基于金属络合物类的E b s e l e n,基于亚硫酸氢盐类的G C 3 7 6与G C 3 7 3,基于醛类的钙蛋白酶抑
3、制剂、和酮酰胺类的化合物1 3 a、1 3 b。此外,非肽类小分子药物黄芩素也极具潜力。最后对主蛋白酶抑制剂的抗病毒活性、耐药性、稳定性和广谱性等进展进行综述,为广谱抗病毒药物的研发提供参考。关键词 新型冠状病毒;主蛋白酶;主蛋白酶抑制剂;新型冠状病毒肺炎 中图分类号 R 3 7 3.1 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 8-9 9 2 6(2 0 2 3)4-0 3 6 4-0 6 D O I 1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 8-9 9 2 6.2 0 2 3.0 4.0 2 1M a i n P r o t e a s e o f S A R S-C o V-2
4、 a n d I t s I n h i b i t o r s:R e s e a r c h A d v a n c e sL I U Q i-y u,J I A Z h i-h u i,Z HU X i n-p i n gD e p a r t m e n t o f M e d i c a l M i c r o b i o l o g y a n d P a r a s i t o l o g y,S c h o o l o f B a s i c M e d i c a l S c i e n c e s,C a p i t a l M e d i c a l U n i v e
5、r s i t y,B e i j i n g 1 0 0 0 6 9,C h i n a A b s t r a c t T h e C OV I D-1 9 p a n d e m i c c a u s e d b y S A R S-C o V-2 h a s p o s e d a s e r i o u s t h r e a t t o h u m a n h e a l t h.M a i n p r o t e a s e,w h i c h p l a y s a n e s s e n t i a l r o l e i n t h e l i f e c y c l e
6、 o f c o r o n a v i r u s e s a n d b e l o n g s t o c o r o-n a v i r u s g e n u s,i s a n a p p e a l i n g t a r g e t f o r t h e d e v e l o p m e n t o f i n h i b i t o r s w i t h i t s g e n u s-b a s e d h i g h c o n s e r v a-t i o n.I n t h i s r e v i e w,t h e s t r u c t u r e a n
7、 d c a t a l y t i c r e a c t i o n m e c h a n i s m o f m a i n p r o t e a s e a r e s u mm a r i z e d.T h e r e p o r t e d i n h i b i t o r s a r e d i v i d e d i n t o p e p t i d e-m i m e t i c i n h i b i t o r s a n d n o n-p e p t i d e s m a l l m o l e c u l a r i n h i b i t o r s.
8、T h e f o r m e r,r e p r e s e n t e d b y P a x l o v i d,c a n b e d i v i d e d i n t o E b s e l e n b a s e d o n m e t a l c o m p l e x e s,G C 3 7 6 a n d G C 3 7 3 b a s e d o n s u l f u r o u s a c i d,a n d c a l p a i n i n h i b i t o r s,a n d K e t o n a m i d e c o m p o u n d s 1
9、3 a,1 3 b.B a i c a l e i n,a n o n-p e p t i d e s m a l l m o l e c u l a r i n h i b i t o r,a l s o h a s g r e a t p o t e n t i a l.A d d i t i o n a l l y,t h i s p a p e r r e v i e w s t h e r e c e n t r e s e a r c h p r o g r e s s i n a n t i v i r a l a c t i v i t y,r e s i s t a n c
10、e,s t a b i l i t y,a n d b r o a d-s p e c t r u m p r o p e r-t i e s o f r e l a t e d i n h i b i t o r s i n o r d e r t o p r o v i d e r e f e r e n c e f o r d e v e l o p i n g b r o a d-s p e c t r u m a n t i-c o r o n a v i r u s d r u g s.K e y w o r d s S A R S-C o V-2;m a i n p r o t
11、e a s e;m a i n p r o t e a s e i n h i b i t o r;C OV I D-1 9 2 0 1 9年底爆发的新型冠状病毒肺炎(C O V I D-1 9)在全球大流行以来,对全球公共卫生安全构成较大威胁。目前,我国共有5种新冠抗病毒口服药上市,分别为P a x l o v i dP F 0 7 3 2 1 3 3 2/利 托 那 韦(R:t o n a v i r)片、阿兹夫定(A z v u d i n e)、莫诺拉维(M o l n u p i r a v i r)、先诺欣(先诺特韦/利托那韦片)和民得维,这些抗病毒药物和疫苗、中和抗体在抗击疫情中
12、发挥了重要作用。新型冠状病毒(S A R S-C o V-2)是冠状病毒属的一种R N A病毒,易发生基因突变。目前WHO已经定义了5种“关切变异株(V O C)”,即A l p h a、B e t a、G a mm a、D e l t a和Om i c r o n以 及 多 种“关 注 变 异 株(V O I)”。我国流行毒株以Om i c r o n亚分支B A.5及其变种(B A 5.2、B F 5.7)为主,其致病力明显下降,感染潜伏期明显缩短,疫苗接种的保护效果也下降。绝大多数O m i c r o n感染者表现为无症状和轻症,有临床症状者主要表现为中低度发热、咽干、咽痛、鼻塞、流涕
13、等上呼吸道感染症状,与其他变异株(如D e l t a)相比,住院463 解放军药学学报2 0 2 3年8月2 5日 第3 6卷 第4期 P h a r m J C h i n P L A,V o l.3 6,N o.4,A u g 2 5,2 0 2 3 和转变为重症风险明显降低1。随着新变异株的不断出现,病毒的致病力、传播性、耐药性不断改变,导致疫情不断复燃和蔓延,亟需寻找有效的药物靶标。2 0 2 2年1月国家卫健委发布的 新型冠状病毒感染基层诊疗和服务指南(第一版)2中推荐抗病毒药物P a x l o v i d在有发展为重症风险的高危患者人群中尽早使用。2 0 2 3年1月2 9日国
14、家药监局紧急审批通过创新药主蛋白酶(m a i n p r o t e a s e,Mp r o)先诺欣上市,用于治疗轻中度新型冠状病毒感染的成年患者。Mp r o抑制剂再次引起广泛关注。Mp r o作为药物靶标的优越性体现在以下几点。首先,Mp r o在S A R S-C o V-2病毒复制转录和蛋白合成过程中起关键作用,是重要的药物靶标。其次,Mp r o的高分辨率三维结构已被解析,并被评选为2 0 2 0年2月的明星分子,已筛选出大量先导化合物。并且,人体内没有与Mp r o具有相似底物特异性的蛋白酶,安全性较高。最后,Mp r o在同属冠状病毒中高度保守,因此之前对S A R S-C
15、o V和M E R S-C o V的Mp r o相关研究具有参考意义,有助于广谱抗冠状病毒药物的研发。本文综述了Mp r o的结构和催化反应机理,总结了目前已报道的部分Mp r o抑制剂的研究进展。1 新冠病毒基因组和生命周期 S A R S-C o V-2的基因组为单股正链R N A,全长为2 9 9 0 3个核苷酸,包含1 4个开放阅读框(O R F s),共编码2 9种蛋白质。其中,靠近5 端的前2/3序列由O R F 1 a和O R F 1 b组成,分别编码多蛋白p p 1 a和p p 1 a b。靠近3 端的后1/3序列在R N A依赖性R N A聚合酶(R N A-d e p e
16、n d e n t R N A p o l y m e r a s e,R d R p)的参与下,编码9种辅助蛋白和4种结构蛋白,即S、M、E和 N蛋白3。S A R S-C o V-2的生命周期包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与释放等基本过程。S A R S-C o V-2 S蛋白裂解为S 1、S 2两个亚单位,介导病毒通过细胞表面血管紧张素2(a n g i o t e n s i n-c o n v e r t i n g e n z y m e 2,A C E 2)受体与细胞膜附着、融合4,使病毒侵入细胞后释放核衣壳和病毒R N A。O R F 1 a和O R F 1 b在细胞质中
17、共表达出完整的多蛋白p p 1 a b,在Mp r o及木瓜蛋白酶(P Lp r o)的作用下裂解成1 6种非结构蛋白(n o n-s t r u c t u r a l p r o t e i n,N s p 1 1 6),这些非结构蛋白能诱导细胞产生双层膜囊泡(D MV)结构,并在其上组装复制转录复合体(R T C)。病毒基因组R N A在R d R p介导下合成负链R N A,作为正链R N A(g R N A)和 亚 基 因 组(s g R N A)的 模 板。s g R N A负责编码结构蛋白和一些辅助蛋白,g R N A则与结构蛋白组装为成熟病毒颗粒,通过胞吐释放到细胞外,继续新的
18、复制周期5。2 新冠病毒主蛋白酶 Mp r o是一种大小为3 3.8 k u的半胱氨酸蛋白酶。因其与小核糖核酸病毒中3 Cp r o具有相似的结构和底物特异性,故又称“3 C Lp r o”6。Mp r o通过水解多蛋白p p 1 a和p p 1 a b中至少1 1个保守的切割位点,以保证病毒复制转录过程中非结构蛋白N s p 41 6的生成,在S A R S-C o V-2基因复制和蛋白合成中起关键作用。2.1 Mp r o的结构和催化反应机制 S A R S-C o V-2 Mp r o是由2个几乎垂直的亚基(P r o t o m e r A和P r o t o m e r B)组成的同
19、源二聚体,每个亚基由约3 0 0个氨基酸组成,包含3个结构域。N端为2个分别由6个反平行的折叠链组成的结构域(残基8 1 0 1)和 (残基1 0 2 1 8 4),与蛋白酶催化活性相关;C端为一个由5个螺旋形成的球状结构域(残基2 0 1 3 0 3),通过一段柔性环区(残基1 8 3 1 9 8)与结构域 相连,从而通过G l u 2 9 0与A r g 4之间的互作调控蛋白酶的二聚化7。Mp r o的单个亚基缺乏酶活性,二聚化对酶构象和活性的形成意义重大。在二聚体中,一个亚基的N端指状区(N-f i n g e r)插入到另一亚基的结构域 和 之间,帮助稳定Mp r o二聚体结构8,见图
20、19。图1 S A R S-C o V-2 Mp r o二聚体结构模式图 Mp r o的 天 然 底 物 是 病 毒 的 多 蛋 白p p l a和p p l a b,底物中N端的残基按照距催化位点的距离由近到远依次命名为P 1、P 2,C端的残基依次称为P 1、P 2。Mp r o对底物序列的识别具有专一性和保守性,底物特异性主要由P 1、P 2和P 1 位置的残基决定,其中P 1位点的G l n残基完全保守1 0。在人体中尚未发现具有相似底物特异性的蛋白酶,因此靶向Mp r o的药物不良反应可能较小。Mp r o包含氧阴离子孔和底物结合口袋2个底物结合位点。其中,C y s 1 4 5-H
21、 i s 4 1催化二元体是Mp r o的催化中 心,位 于 结 构 域和的 裂 隙 中,识 别 序 列 为 L e u-G l n S e r-A l a-G l y(标记切割位点)1 1。Mp r o的催化基于亲核加成反应,C y s 1 4 5作为亲核试剂,H i s 4 1563 解放军药学学报2 0 2 3年8月2 5日 第3 6卷 第4期 P h a r m J C h i n P L A,V o l.3 6,N o.4,A u g 2 5,2 0 2 3 作为质子受体。Mp r o的催化过程可分为5个步骤:(1)质子从C y s 1 4 5转移到H i s 4 1;(2)质子化的
22、H i s 4 1攻击肽键氮原子;(3)释放具有氨基末端的第一产物;(4)活性水分子攻击G l n的羰基碳原子,H i s 4 1重新质子化;(5)羧酸作为第二产物释放,蛋白酶游离再生(图2)。图2 S A R S-C o V-2 Mp r o催化反应机理1 22.2 S A R S-C o V和S A R S-C o V-2主蛋白酶比较 S A R S-C o V-2 Mp r o和S A R S-C o V Mp r o存在约9 6%的序列相似性,即在3 0 6个残基中,只有1 2个残基(T h r 3 5,A l a 4 6,S e r 6 5,L e u 8 6,A r g 8 8,S
23、 e r 9 4,H i s 1 3 4,L y s 1 8 0,L e u 2 0 2,A l a 2 6 7,T h r 2 8 5,I l e 2 8 6)存在差异,且这些突变未严重影响S A R S-C o V-2 Mp r o的整体结构与催化活性1 3。研究显示,S A R S-C o V-2 Mp r o的催化效率(k c a t/K m)为2 8 5 0 0 m o lL-1S-1,略高于S A R S-C o V Mp r o(k c a t/K m=2 6 5 0 0 m o lL-1S-1)1 4。因此,当前的S A R S-C o V的Mp r o抑制剂对S A R S-
24、C o V-2仍有效用。3 主蛋白酶抑制剂 Mp r o抑制剂根据其结构和机制的不同,可分为肽模拟抑制剂和非肽类小分子抑制剂(表1)。肽模拟抑制剂主要利用亲电基团共价结合C y s 1 4 5,从而达到不可逆的抑制作用;而非肽小分子抑制剂主要通过氢键,疏水键和范德华力与底物结合口袋相互作用,抑制Mp r o活性,从而抑制病毒增殖1 5。目前的体内外测试中,已被证实有良好研究价值的Mp r o抑制剂见表1。3.1 肽模拟抑制剂 肽模拟抑制剂类似于Mp r o的天然底物,在P 1、P 2、P 3位引入亲电基团来修饰氨基酸,以改进其抑制活性、抗病毒能力等性质,是至今研究最多的Mp r o抑制剂2 5
25、。表1 S A R S-C o V-2 Mp r o的代表性潜在抑制剂抑制剂I C5 0/m o lL-1E C5 0/m o lL-1研究进展参考文献肽模拟抑制剂 P F-0 7 3 2 1 3 3 2(P a x l o v i d功能组分)0.0 1 80.0 7 5已投入临床使用1 6 E b s e l e n0.6 74.6 7临床 期试验1 7 G C 3 7 30.4 01.5体外实验,动物实验 1 8 G C 3 7 60.1 90.9 2体外实验,动物实验 1 8 钙蛋白酶抑制剂 0.9 72.0 7体外实验1 9 钙蛋白酶抑制剂 0.4 50.4 9体外实验1 9 化合物
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