肿瘤标志物检查及临床应用进展.ppt

肿瘤标志物检查及临床应用进展Tumor Markers Check&Progress of Clinical Use 理想的肿瘤标志物特异性强:即它们只能由肿瘤组织产生，而在正常组织不存在。敏感性好:即它们可用于小肿瘤的早期 诊断或筛选。是一类可用某种检测手段检测，能与正常组织相区别的物质。肿瘤标志物（Tumor Markers，TM）是指在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或由机体对肿瘤反应而异常产生或升高，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质，激素，酶，多胺，及癌基因产物。一、TM的发现概况 第一代（肿瘤代谢产物）1846 Bence-Jones 尿肿瘤特异蛋白（Ig轻链）1928 Zoudek （人绒毛膜促性腺激素）HCG 1032 Cushing 肿瘤异位激素（ACTH）1959 Market PAP，AKP，LDH及同工酶1960 Newell 肿瘤畸变染色体第二代（肿瘤自身抗原）1963 Abelev AFP1965 Gold，Freedman CEA第三代（糖类抗原）1977 Kato SCC（糖蛋白）1979 美Kaprowski CA19-9（糖脂）1981 美NCI CA72-4（糖蛋白）1983 Lindholm CA50（糖脂-节苷脂）1983 Base，Klug CA12-5（糖蛋白）1985 Tobies CA15-3（糖蛋白）二、肿瘤诊断1、临床病史、体症2、辅助物理检查：X光、CT、核磁共振、B超、红外扫描 病理 术前：穿刺、刮片、拉网 术后：组织切片 免疫学检查：肿瘤标志物和代谢物测定 分子生物学检查：核酸分析 WHO提出的危险信号可触及的硬结和硬变，如乳房，皮肤等。疣或黑痣发生明显变化。持续性消化不良，便血，血尿。持续性嘶哑，干咳及吞咽困难。月经期异常大出血，月经期外或绝经期后出血。鼻、耳分泌物带血、颈部肿、视觉障碍。不愈的伤口，原因不明的疼痛及体重减轻。三、血清TM检测及应用 肿瘤特异抗原 肿瘤相关抗原 1、胚胎性抗原 2、肿瘤相关糖脂及糖蛋白抗原 3、激素肽、酶及蛋白 肿瘤相关抗原（TAA）非非肿瘤瘤细胞所有、正常胞所有、正常细胞上也存胞上也存在的抗原，只是其含量在在的抗原，只是其含量在肿瘤瘤时明明显增增加。此加。此类抗原只表抗原只表现为量的量的变化而无化而无严格的格的肿瘤特异性。瘤特异性。（一）主要肿瘤相关抗原分类：1、胚胎抗原 2、肿瘤相关糖脂及糖蛋白抗原 3、激素肽,酶及蛋白等胚胎性抗原癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）甲胎蛋白抗原（a-fetoprotein antigen,AFP）胰胚抗原 (POA)肿瘤相关糖脂及糖蛋白抗原鳞状上皮细胞癌抗原（squamous carcinoma cell antigen,SCC）糖链抗原 19-9 （carbohydrate antigen,CA19-9）癌抗原 15-3 （carbohydrate antigen,CA15-3）癌抗原 12-5 （carbohydrate antigen,CA12-5）前列腺特异抗原（prostate specific antigen,PSA）激素肽、酶及蛋白等人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）神经元特异性稀醇化酶（NSE）Microglobulin、Feritine、Thyroglobulin CYFRA21-1 （二）主要的血清TM（1）CEA存在于胚胎胃肠粘膜上皮与一些恶性组织的细胞表面，是一种分子量为180KD的糖蛋白。在正常人肠道，胰腺，肝脏组织中也存在有少量，其他体液中存在量极微。除结肠癌升高外，还可见于胰腺癌、乳腺癌、小细胞及非小细胞肺癌、甲状腺髓样癌及某些非癌患者。因此CEA的诊断意义不大。CEA的参考范围，MEIA为5ng/ml。另外吸烟影响CEA的水平，健康吸烟者参考范围的高限值为710ng/ml。2050%的良性疾病患者中，CEA水平轻度升高，尤其是胰腺，肝脏和肺部疾病，如肝硬化、慢性肝炎、胰腺炎、结肠溃疡、肺炎、支气管炎、肾小管性肾炎、肺气肿、自身免疫系统疾病，其CEA水平保持在病理值低限，很少超过10ng/ml。（2）甲胎蛋白（a-fetoprotein,AFP）是由卵黄囊及胚胎肝产生的糖蛋白，分子量为70KD，胎儿六周开始合成，1215周达高峰，出生时脐血含量为10100mg/L，12年降至正常水平，正常妊娠中期可达90500ng/ml。AFP增高：AFP是肝细胞癌和生殖细胞癌（非精原细胞癌)的标志。原发性肝癌（7090%），是目前最好的可实际用于早期诊断的指标，可在症状出现前612个月作出诊断。转移性肝癌和肝外肿瘤：睾丸肿瘤、卵巢肿瘤、胃癌、胰腺癌、结肠癌、支气管癌、肾癌、乳腺癌、白血病等可增高。非肿瘤性疾病：先天性胆道闭锁症，急慢性肝炎、肝硬化等可有不同程度增高。重症肝炎时如AFP减低，则预后不良。AFP与HCG联合检测有助于生殖细胞肿瘤的分类和分期。出生前检查羊水中的AFP也很重要，如显著升高表明有神经导管未闭的可能。乙型肝炎患者一年应测定两次AFP 水平，如AFP水平明显升高，则首先考虑肝细胞癌的可能，而不可能是伴有胆囊炎的急性恶化性肝硬化。但肝炎升高常为间歇性，在病理范围低限值（很少超过500ng/ml）。（3）糖链抗原19-9 （CA19-9）是表达在一高分子量400 KDd的粘蛋白上的糖类位点，是一种单延酸神经节苷脂，在多种腺癌中升高。如胰腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌及胃癌。对胰腺、胃肝胆管癌具有高敏感性，是诊断胰腺癌较为可靠的标志。参考范围：高限值为37u/ml。胰腺癌时CA19-9作为首选标志物其灵敏度达82%。若对患者随诊CA19-9，可在放射影像发现前及临床出现体征前预示肿瘤复发。此外，在胃液与血清中测定CA19-9及CEA,可提高筛选胃癌的敏感性和特异性。CA19-9对于肝胆癌症的灵敏度为5075%，对于胃癌而言,CA19-9是仅次于CEA的肿瘤标志物。由于CA72-4的引用，CA19-9显得不那麽重要了。为了确诊胃癌最好联合测定CA72-4和CEA.而结肠癌时单测CEA即可,结肠癌很少有CEA阴性,如阴性可加测CA19-9。（4）CA72-4:是一高分子量(106)的类粘蛋白分子，是通过以乳腺癌转移癌细胞膜免疫所制备的McAb B 72.3及纯化抗原后所制备的第二代McAb CC 49所识别抗原,可用于诊断与监测某些上皮肿瘤,特别是胃癌。CA72-4的参考范围高限值为2.5-4U/ml,具有高特异性.在胃癌患者血清中,其水平升高尤为明显.经过对50例良性胃肠道疾病和197例处于活动期胃癌的研究发现,CA72-4对胃癌的特异性为100%,灵敏度为48%.CA72-4的测定对胃癌的生长期和治疗效果极为重要,最好联合测定CA72-4和CEA。CA72-4也见于卵巢癌中。（5）CA15-3是监视乳腺癌的重要抗原,其生化本质为分子量400 KD的多形上皮粘蛋白。由抗人乳脂球(HMFG)膜McAb 115D8与抗转移乳腺癌膜成分的McAb DF3所识别,存在于多种腺癌内，如乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌及胰腺癌。（6）CA12-5（cancer antiger,CA12-5）是分子量大于200KD的糖蛋白。由抗卵巢癌细胞系的单克隆抗体所证实，对卵巢上皮癌敏感性高，但特异不强，因为其也存在于乳腺、肺、良性及恶性渗出液中。CA12-5水平增高与肿瘤复发有关，有助于随访病情，作为第二次治疗的重要参考。已得到美国FDA准许用于临床，是为数很少的可用于体内免疫显像检查转移发生的单克隆抗体之一。（7）鳞状细胞癌抗原（squamous celantigen,SCC）是48KD的糖蛋白，作为鳞癌的标记，特异性高，但敏感性较低，1977年制备了多克隆抗体，现已用单克隆抗体测定，可用于监视宫颈、肺、及上皮细胞癌的进展。（8）前列腺特异抗原（prostate specific antigen,PSA）是一分子量为34KD的糖蛋白，只存在于人前列腺腺泡及导管上皮细胞胞浆中，不表达于其他细胞，是前列腺较特异的标志，主要用于前列腺癌诊断，阳性率高于63%，用于诊断前列腺癌、鉴别转移性腺癌的来源，以及判断疗效和预后。应用时应注意：多数PSA结合于-1-抗凝乳蛋白酶，前列腺癌患者94%呈结合状态，前列腺增生患者78%呈结合状态。所以，应通过测定游离PSA与结合PSA的比进行分辩.PSA参考范围上界随年龄上升而增加国外文献报道年龄 PSA含量40-49岁：2.5ng/ml50-59岁：3.5ng/ml60-69岁：4.5ng/ml70 岁以上：6.5ng/ml60岁以上正常人PSA水平升高速率为每年0.04ng/ml.9）人绒毛膜促性腺激素（h-HCG）存在于胎盘中的糖蛋白激素,分子量为45KD,当怀孕时，尿中与血中水平上升，正常血中只含微量。以特殊的免疫试验可测定HCG的亚单位。由于高于60%的非精原细胞瘤病人体内HCG上升，所以-HCG的测定可监视非精原细胞瘤的治疗反应及复发状况，甚至有些肿瘤复发可在临床体征出现前几周或几个月通过测定HCG查出。（10）神 经 元 特 异 性 稀 醇 化 酶（NSE）存在于神经及神经来源的细胞中，分子量为78KD，是神经细胞瘤及小细胞肺癌的TM。对小细胞肺癌的敏感性、特异性均高，可用于辅助诊断、鉴别诊断及对病情的疗效估计。（11）2微球蛋白（2microglobulin，2MG）表达在大多数有核细胞表面，临床上多用于证实淋巴增殖性疾病，如白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤。其水平与肿瘤细胞数量、生长速度、预后及疾病活动性有关。骨髓瘤病人2microglobulin水平 高于4.0mg/L时，予示生存时间短。高于6.0mg/L时，对化疗反应不敏感。此外，根据2microglobulin水平还可以 用于骨髓瘤病人分期。（12）Ferritin 是一种铁结合蛋白，存在于各种组织，病理状态下，释放到血液，不是肿瘤特异的标志物，在多种癌症病人血中均有不同程度的升高，肝癌病人的阳性率在70%以上，所以，可辅助肝癌诊断。此外，在进展性乳腺癌患者蛋白水平也有显著增高，可见与病程有关。细胞角蛋白19片段（cyfra21-1）是正常及恶性的上皮细胞支架蛋白，已知有20种，分别为硷性蛋白及酸性蛋白，分子量为68KD0至40KD，在恶性组织中蛋白量升高。CKs作为上皮组织TM已有多年了，其向血中释放可能是通过不同的机制，估计其中之一是细胞分解后发生的。CKs不可溶，而其片段经蛋白酶水解后是可溶的，所以在血清中只能测定到其片段.抗CK19片段的单克隆抗体BM19-21及Ks19-1所针对的抗原为CYFRA21-1。这是检测非小细胞肺癌（NSCLC）的首选TM。（三）血清TM测定方法EIA、RIA 免疫细胞化学、组织化学方法免疫荧光测定（IFA）放射免疫显影（RAID）自动化分析仪结果分析时应考虑的因素（一）影响因素（生物因素）（二）干扰因素（外界因素）（三）试剂盒的质控质量控制（试剂盒）SPSpecificity SESensitive ER Efficiency Rate 2、TM应用范围 理想的TM既能用于肿瘤治疗前后的病情监测及术后有无复发、转移的预测也能用于一般人群的筛查。（1）敏感性 （真阳性率或阳性率）真阳性数敏感性=100%（SE）真阳性数+假阴性数 真阳性率（肿瘤病人组）（2）特异性 （真阴性率或阴性率）特异性=真阴性数 100%(SP)真阴性数+假阳性数 真阴性率 （健康对照组）（3）准确率 有效率（efficiency rate）真阳性数+真阴性数 准确率=100%总测定数2、应用范围：理想的TM既能用于肿瘤的治疗前后的病情监测及术后有无复发、转移的预测，也能用于一般的人群的筛查。除极少数（AFP、PSA）外，均不适于人群的普查。TM最重要的临床应用分析病程 指导治疗及判断预后监测复发或转移3、血清TM的最佳组合：对于某一特定的肿瘤检测，可同时选择几种特异性和敏感性均较满意的标志，即检查肿瘤细胞表面不同抗原的决定族，只要有一种是阳性即可判断为阳性，以此来互相补充，提高诊断的阳性率。3、血清TM的常用组合 结直肠癌 CEA +CA19-9+CA724+CA242乳腺癌 CEA+CA153+CA12-5胃癌 CEA +CA72-4+CA199+CA242胰腺癌 CA19-9+CEA+CA242肺癌 CEA +CA19-9/NSE CYFRA21-1前列腺癌 F-PSA/PSA+CEA肝癌 AFP+CEA+AFU+CA242卵巢癌 CA12-5+AFP/-HCG+CEA 4、综合分析 由于TM检查其特异性和敏感性均受限，所以，必须与病人状况、体症检查、X线、内窥镜及超声波等的各种诊断手段结果综合分析、判断，单一检测不能作为诊断肿瘤疾病的唯一依据。三、组织肿瘤标志肿瘤诊断除了临床病史、体征、物理检查、免疫血清学检查、分子生物学检查的诊断标准外，还迫切的需要指导治疗的标准，这应从对治疗的反应得到。而此反应很大程度上取决于肿瘤的生物学特性。检测细胞及组织内的TM对于认识肿瘤的类型及形成治疗的生物靶位均具有帮助。（一）分类 1、分化标志 乳腺激素受体：ER、PR 2、增殖标志：Ki67、MIBI、PCNA、CMYC 3、转移潜在性标志：蛋白酶、基因产物、黏 附因子及相关基因 integrins CD44及 VEGF）等 4、癌基因及抗癌基因 癌基因（myc、H-ras、erbB）及 抗癌基因（p53、Rb、DCC）等（二）ER、PR雌二醇受体（ER）、孕酮受体（PR）属类固醇 激素类受体。主要存在于特定靶组织的细胞内。1967年Jensen等在乳癌的浆细胞内发现有与性类 固醇相结合的特异性蛋白,称为ER.1973年TerenlusD等用3H标记的孕酮,发现他能 结合到雌激素受体阳性的乳癌细胞,称为PR.ER、PR分布于乳腺、肝、口腔、鼻粘膜及皮肤 等组织。也在乳癌、子宫癌、胃癌、前列腺癌等 肿瘤组织中表达。临床意义ER、PR检出率与肿瘤分化程度有关，受体水平高，复发少。淋巴结转移的病人原发病PR阳性的复发率为0%，而ER阴性的复发率为33。3%，与乳腺癌预后关系：。ER PR阳性的患者，与阴性患者相比，缓解期长，受体水平越高，复发越少。端粒酶（Telomerase）是一个端粒重建酶，除少数更新活跃的组织外，正常组织不表达或少数组织低水平表达端粒酶活性。端粒酶是一个大的核糖核酸蛋白体，含短的RNA成分（200bp），少数蛋白质，包括逆转录酶部分和端粒酶特性蛋白。由于缺乏端粒酶活性，体细胞染色体端粒会随细胞分裂而逐渐缩短，直至染色体完全性受损，细胞分裂停止，衰老死亡。一些尚不明了的因素可使极少数体细胞通过激活端粒酶而无限分裂，其生存延长可给其他基因损伤提供机会，从而使细胞进行性向肿瘤发展。由于肿瘤疾病的发生是一个多因素多步骤的病理过程，除癌症的多基因突变说外，在癌症的发生过程中，端粒酶的激活是一个先决条件。临床意义（1）正常人血标本的端粒酶活性有低水平表达 在人正常少数组织有丝分裂活跃的细胞，如 增生的基底膜高水平表达。（2）以端粒酶活性作肿瘤诊断标志的意义在于：可区别疾病的不同阶段：大肠、膀胱、甲状腺癌。可区别前列腺的良性增生与癌。（3）端粒酶作为肿瘤治疗的目标：大多数肿瘤生成中都有端粒酶的再活化 抑制端粒酶 恢复端粒的缩短 活化细胞老化途径 因端粒酶是肿瘤生长必须的，抑制肿瘤治疗的理想目标。P53基因 目前认为肿瘤是一种基因疾病，与癌基因激活和抑癌基因的失活有关。癌基因的激活与基因突变（DNA重排、点突变、基因扩增）或基因活性及调控有关。自1976年Bishop等首次提出癌基因概念以来，已有近百种癌基因被认识。基因诊断已成为肿瘤诊断研究中一个新的热点。1981年被Crawford等发现，以后Hinds，Finlay等通过研究发现转染了myc或ras癌基因的细胞中若存在野生型P53基因，则出现生长抑制。因此提出P53基因，属于抑癌基因。P53基因定位于第17号染色体17P13区，由11个外显子和10个内含子组成。编码393个氨基酸残基的蛋白质即P53蛋白。P53的功能为转录因子，生物学功能为G1 期DNA损坏的检查点。人类肿瘤中P53基因突变主要在高度保守区内，以175，248，249，273，282位点突变率最高，不同种类肿瘤其突变类型不同。另外P53变化形式还有缺失、基因重排、与肿瘤病毒癌蛋白结合而失活。检测方法（1）PCR-SSCR、DEEG、PCR-ASO及测序技 术,检测点突变。(2）RT-PCR、PCR（3）PCR-RFLP（限制片段长度多态性 restriction fragment length polymorphism）以上TM 优点：具有较强的瘤谱，对定位有帮助。缺点：含量随病程的发展而升高，早 期阳性率很低。四、进展与展望发现理想的TM是我们一直的工作目标，也是我们完成三早所应达到的目的。常规的物理诊断只能发现直径12cm以上的肿瘤细胞，实际上一个肿瘤细胞增长至如此大小，约有109个细胞，需要五年甚至更长的时间。而细胞学检查是在物理学检查发现之后方可取得标本（切片或手术），以上两种方法往往只能发现中晚期的病例，难以达到肿瘤早期发现的目的，且大多操作复杂，费用昂贵。生物化学和免疫学方法检测TM其简单易行是肿瘤诊断的重要手段之一。理想的TM特点 SE高 SP强 有器官特异性，能对肿瘤定位。血清中浓度与大小、临床分期有关，可用以判断预后。半衰期短，能反应肿瘤的动态变化，监 测疗效、复发和转移。测定方法精密、准确、操作简便、试剂 盒 廉价。恶性肿瘤相关物质群（Tumor Supplied Group of Factors，TSGF）是数种与肿瘤生长相关的糖类代谢物的统称。其显著特点是对恶性肿瘤的检测兼具早期性和广谱性。TM的正确使用 （1）联合测定 （2）动态观察 （3）疗效随访 （4）复发和转移的监测肿瘤标志作定期监测是国际上一般采用第六周作第一次复查第一年，每三个月一次第35年，每半年一次第五-七年，一年一次七年后停止复查。若其中发现一次升高，在一个月内复查一次，两次升高即无实验误差，指示复发。比临床发现要早313个月。TM最重要的临床应用分析病程 指导治疗及判断预后监测复发或转移