浙江大学生物化学甲实验实验6酶基本性质实验——底物专一性激活剂和抑制剂最适温度.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,实验七,用正交法测定几种因素,对蔗糖酶活性的影响,丁鸣,（半自主性设计实验）,一、实验目的和要求,1.,初步掌握正交试验设计法的使用。,2.,运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和,pH,值这四种因素对酶活力的影响。,二、实验基本原理,酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、,pH,值、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活性测定求得该因素的影响，这是单因素的试验方法。对于多因素的试验可以通过正交试验设计法来完成。正交法是借助于正交表，简化的表格计算，正确分析结果，找到实验的最佳条件，分清因素的主次，这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。实践证明正交法是一个多、快、好、省的方法。目前已广泛用于工农业生产和科学实验中。,本实验运用正交法测定,底物浓度、酶浓度、温度、,pH,值,这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和,pH,值时酶的活性最大。,三、实验材料与试剂,1,、实验材料,纯化的蔗糖酶（样品,）,2,、实验试剂,5%,蔗糖（,A.R.,）溶液（,W/V,）；,0.2mol/L,乙酸缓冲液，,pH3.6,、,4.6,、,5.6,；,3,5,二硝基水杨酸试剂；,甲液：溶解,6.9g,结晶酚于,15.2ml 10,NaOH,溶液中，并用水稀释至,69ml,在此溶液中加,6.9g,亚硫酸氢钠。,乙液：称取,255,克酒石酸钾钠加到,300ml 10%NaOH,溶液中，再加入,800ml 1%3,5-,二硝基水杨酸溶液,.,甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置,7-10,天以后使用。,四、实验器材与仪器,1.,试管及试管架；,2.,吸量管；,3.,恒温水浴箱（,37,、,50,、,65,、,100,）；,4,可见光分光光度计。,五、实验操作方法和步骤,1,、实验设计,、确定试验因素和水平,本实验取四个因素，即底物浓度,S,、酶浓度,E,、温度、,pH,值。每个因,素选三个水平，实验因素和选用水平如表,1,。,表,1,因素、水平表,因素,水平,S,（,ml,）,E,（,ml,）,温度,（）,pH,1,0.5,1.0,50,3.6,2,0.2,0.6,37,5.6,3,0.8,0.2,65,4.6,作因素、水平表时，各因素的水平，最好不要按大小顺序排列。按一般方法，如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑，共需做,3,4,=81,次试验，而用正交表只需做,9,次试验。,、选择合适的正交表,合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度,。,正交表,L,n,（,t,q,）,L,正交表的代号,n,处理数（试验次数）,t,水平数,q,因素数,试验次数,n,=,q,(,t,1)+1=4,（,3,1,）,+1,9,总自由度,V,总,=n-,1,各列自由度,V,列,=K,（该列水平数）,1,例如本实验选用四个因素，每个因素选三个水平，四个因素各占一列，那么四个因素的自由度分别为：,V,1,=3,1=2,，,V,2,=3,1=2,，,V,3,=3,1=2,，,V,4,=3,1=2,。,四个因素的自由度总和,=V,1,+V,2,+V,3,+V,4,=8,因为各因素自由度总和是,8,，它没有超过,L,9,（,3,4,）的总自由度,=9,1=8,。所以选择正交表,L,9,（,3,4,）是适合的。,3.,在所选的正交表上进行表头设计,由于本实验是一项四因素各三水平的试验，这样将四个因素依次放在,L,9,（,3,4,）的第,1,，,2,，,3,，,4,列上，这项把因素放入正交表头的工作，叫做表头设计。见表,2,。,正交表都应具有以下两个特性：,（,1,）在每一列中，各水平出现的次数相等。即在任何一列中，数字,1,和数字,2,和数字,3,都出现三次（几个水平就均出现几次）。,（,2,）任何两列中，横行组成的数对出现次数相等，均出现一次（这里有,9,个不同的数对，均出现一次）,（,1,，,1,）、（,1,，,2,）、（,1,，,3,）、（,2,，,1,）、（,2,，,2,）、,（,2,，,3,）、（,3,，,1,）、（,3,，,2,）、（,3,，,3,），各出现一次。,以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是,均衡搭配,的，因此分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。,在所选的正交表上进行表头设计，见表,2,。,水平 因素,实验号,1,S,2,E,3,温度,4,pH,1,1,1,1,1,2,1,2,2,2,3,1,3,3,3,4,2,1,2,3,5,2,2,3,1,6,2,3,1,2,7,3,1,3,2,8,3,2,1,3,9,3,3,2,1,L9,表,表,2,表头设计,2,、试验安排,将本实验的四个因素依次填入,L,9,表的因素,1,，,2,，,3,，,4,中；再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，便可得到下面的试验安排表（表,3,）。,表中试验号共,9,个，表示要做,9,次试验，每次试验的条件如每一纵行所示。如做第一个试验时,S,是,0.5 ml,，,E,是,1.0mL,，温度,50,，,pH,为,3.6,。第二个试验,S,是,0.5ml,，,E,是,0.6mL,，温度,37,，,pH,为,5.6,，余类推,。,实验号,试剂（,ml,）,2,4,9,1,6,8,3,5,7,5%,蔗糖溶,液,S,0.5,0.2,0.8,0.5,0.2,0.8,0.5,0.2,0.8,0.2mol/L,乙酸缓,冲溶液,pH,pH5.6,1.0,pH4.6,1.0,pH3.6,1.0,pH3.6,1.0,pH5.6,1.0,pH4.6,1.0,pH4.6,1.0,pH3.6,1.0,pH5.6,1.0,蒸馏水,0.9,0.8,1.0,0.5,1.6,0.6,1.3,1.2,0.2,37,预温,5min,50,预温,5min,65,预温,5min,蔗糖酶（样品,）,E,(,作相应的预温）,0.6,1.0,0.2,1.0,0.2,0.6,0.2,0.6,1.0,温度,37,反应,10min,50,反应,10min,65,反应,10min,DNS,1,1,1,1,1,1,1,1,1,100,5min,蒸馏水,5,5,5,5,5,5,5,5,5,A,520,表,3,试验安排,表,另取试管一支作,非酶对照,，即加,5%,蔗糖溶,液,0.5ml,，缓冲液,1.9ml,。,先加,DNS,1ml,摇匀,室温,放置,5,分钟后再加入蔗糖酶（样品,）,0.6ml,摇匀室温放置,10,分钟，,100,5min,，再加入,蒸馏水,5ml,，混匀后在,520nm,处测光密度值。,六、试验结果及分析,实验做好后，把,9,个数据填入表,4,试验结果栏内，按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值（各自被,3,除）。最后计算极差。极差是指这一列中最好与最坏的之差，从极差的大小就可以看出那个因素对酶活力影响最大，那个影响最小。找出任何条件下酶活力最高。最后作一直观分析的结论。,以,OD,值 为纵座标，因素的水平数为横座标作图。,实验的典型结果与异常分析,试验确定的最佳条件与理论很吻合。如出现与理论明显不一致的现象可能是试验过程中如加样及时间控制等出现较大误差所致。,水平 因素,实验号,1,S(ml),2,E(ml),3,温度,(),4,pH,值,试验结果,A,520,1,1 0.5,1 1.0,1 50,1 3.6,2,1 0.5,2 0.6,2 37,2 5.6,3,1 0.5,3 0.2,3 65,3 4.6,4,2 0.2,1 1.0,2 37,3 4.6,5,2 0.2,2 0.6,3 65,1 3.6,6,2 0.2,3 0.2,1 50,2 5.6,7,3 0.8,1 1.0,3 65,2 5.6,8,3 0.8,2 0.6,1 50,3 4.6,9,3 0.8,3 0.2,2 37,1 3.6,(,一水平试验结果总和,),(,二水平试验结果总和,),(,三水平试验结果总和,),/3,/3,/3,级差,表,4,试验结果分析计算表,七、,注意事项,1,、各试剂加样一定要准确。,2,、保温时间各管要一致。,3,、加,DNS,后应立即摇匀。,八、参考资料,童一中，生物统计法，湖南科学技术出版社，,1987,丁鸣,下 次 实 验 课,自主实验设计与实践,立题指导,准备填写,自主实验设计与实践课题申请书,下 次 实 验,植物基因组,DNA,的提取 及纯度与含量的测定,丁鸣,丁鸣,丁鸣,实验八,