小麦CBL基因家族鉴定及表达模式分析.pdf
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1、麦类作物学报 2 0 2 3,4 3(9):1 1 2 5-1 1 3 4J o u r n a l o fT r i t i c e a eC r o p sd o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 9-1 0 4 1.2 0 2 3.0 9.0 5网络出版时间:2 0 2 3-0 7-1 3网络出版地址:h t t p s:/k n s.c n k i.n e t/k c m s 2/d e t a i l/6 1.1 3 5 9.s.2 0 2 3 0 7 1 2.1 5 2 0.0 1 1.h t m l小麦C B L基因家族鉴定及表达模式分析收稿日期:2 0
2、 2 3-0 1-1 9 修回日期:2 0 2 3-0 2-2 1基金项目:国家自然科学基金项目(3 1 9 7 1 8 3 1)第一作者E-m a i l:1 6 2 7 2 5 7 3 6 9q q.c o m通讯作者:苍 晶(E-m a i l:c a n g j i n g 2 0 0 31 6 3.c o m)李 畅,陈慧婵,娄贵成,姜云爽,王政委,徐庆华,苍 晶(东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨1 5 0 0 3 0)摘 要:类钙调磷酸酶(C B L)蛋白是植物中独特的C a2+传感蛋白,对植物应对非生物胁迫具有重要作用。为探究小麦C B L基因的功能,利用生物信息学方法从小
3、麦全基因组数据库中共鉴定出6 8个小麦C B L基因家族成员,并对其进行了理化性质、基因结构、进化树和共线性分析。结果表明,小麦C B L蛋白为酸性亲水性蛋白质,其对应基因分布于1 8条染色体上,亚细胞定位分布广泛,核中最多;蛋白结构域高度保守,都含有E F-h a n d结构域,且同一类群中的大多数成员具有相似的m o t i f。与水稻进行种间共线性分析发现,二者的C B L基因之间存在较多的共线性关系。以强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号和东农冬麦2号为材料,对转录组分析显示出的8个在低温下表达差异显著的C B L进行q R T-P C R分析发现,这8个基因在不同小麦品种和不同组织部位都存在
4、明显的差异表达,分蘖节中C B L的表达量在-2 5 时达到峰值,而叶片中C B L的表达量在-1 0时达到峰值,说明C B L基因在低温胁迫调节中起重要作用。关键词:小麦;C B L;基因家族;低温胁迫中图分类号:S 5 1 2.1;S 3 3 0 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 9-1 0 4 1(2 0 2 3)0 9-1 1 2 5-1 0I d e n t i f i c a t i o na n dE x p r e s s i o nP a t t e r nA n a l y s i so fC B LG e n eF a m i l y i nW h e a tL IC
5、 h a n g,C H E NH u i c h a n,L O UG u i c h e n g,J I A N GY u n s h u a n g,W A N G Z h e n g w e i,X UQ i n g h u a,C A N GJ i n g(C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e,N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,H a r b i n,H e i l o n g j i a n g1 5 0 0 3 0,C h i n a)A b s t r a
6、c t:C a l c i n e u r i nl i k e(C B L)p r o t e i n i s au n i q u eC a2+s e n s i n gp r o t e i n i np l a n t s,w h i c hp l a y s a n i m-p o r t a n t r o l e i na b i o t i cs t r e s s.H o w e v e r,s t u d i e so nt h ef u n c t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c so fC B Lg e n ei nw h e
7、 a t a r es t i l l l a c k i n g.I no r d e r t oe x p l o r e t h e f u n c t i o no fw h e a tC B Lg e n e,at o t a lo f6 8m e m b e r so fw h e a tC B Lg e n e f a m i l yw e r e i d e n t i f i e d f r o mt h ew h e a t g e n o m ed a t a b a s eu s i n g t h em e t h o do f b i o i n f o r-m a
8、 t i c s,a n dt h e i rp h y s i c a l a n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s,g e n es t r u c t u r e,e v o l u t i o n a r yt r e ea n dc o l l i n e a r i t ya n a l y s i sw e r ec a r r i e do u t.T h e r e s u l t s s h o w e dt h a tw h e a tC B Lp r o t e i nw a sa c i d i ch y d r o p h i
9、l i cp r o t e i n,d i s t r i b u t e do n1 8c h r o m o s o m e s i nt h eg e n o m e,w i d e l yd i s t r i b u t e d i ns u b c e l l u l a r l o c a t i o n,a n dm o s t i nt h en u c l e u s.T h ep r o t e i nd o m a i ni sh i g h l yc o n s e r v a t i v ea n dc o n t a i n st h eE F-h a n dd
10、 o m a i n,a n dm o s tm e m b e r so f t h es a m eg r o u ph a v es i m i l a rm o t i f s.C o m p a r e dw i t ht h e i n t e r s p e c i f i cc o l l i n e a r i t ya n a l y s i so f r i c e,t h e r e i sm o r e c o l l i n e a r i t yb e t w e e n t h eC B Lg e n e so f t h e t w o.F u r t h e
11、 r m o r e,t a k i n gD o n g n o n g-d o n g m a i 1a n dD o n g n o n g d o n g m a i2a sm a t e r i a l s,e i g h tC B Lg e n e sw i t hs i g n i f i c a n td i f f e r e n c e i ne x-p r e s s i o na t l o wt e m p e r a t u r er e v e a l e db yt r a n s c r i p t o m ea n a l y s i sw e r ea n
12、 a l y z e db yq R T-P C R,a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e s ee i g h tg e n e sh a do b v i o u sd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ni nd i f f e r e n tw h e a tv a r i e t i e sa n dd i f f e r e n t t i s s u e s,w h i c h i n d i c a t e d t h a tC B Lg e n e sp l a y e da
13、 n i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e g u l a t i o no f l o wt e m p e r a t u r es t r e s s.T h e r e s u l t s l a i da f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r e x p l o r a t i o no f t h e f u n c t i o no fw h e a tC B Lg e n e.K e y w o r d s:Wh e a t;C B L;G e n e f a m i l y;L o wt e
14、m p e r a t u r es t r e s s 在植物体内,钙离子(C a2+)作为一种普遍存在的第二信使,响应很多逆境和发育过程。植物中有大量的钙离子传感-响应器组件负责钙离子的信号转导1。钙调神经磷酸酶B亚蛋白(C B L)和与其相互作用的蛋白激酶(C I P K s)是钙离子介导的信号转导通路中的关键分子,参与响应不同的外界应激信号2-3。不同的C B L蛋白具有不同的E F-h a n d结构域,C B L家族不同蛋白之间结构域的差异可能与它们对钙离子的不同结合能力有关,这为C B L响应不同的刺激信号引起的C a2+浓度变化提供了基础4。C B L基因在拟南芥中首次被发现,
15、目前在水稻5、番茄6、藜麦7、葡萄8等不同植物中也检测出了多个C B L基因家族;部分C B L转基因植株在不同非生物胁迫下的表达模式会发生不同的变化,从而调节植物的抗逆性9。C B L家族在植物生长发育过程中发挥着关键作用,不仅能够保持植物体内离子浓度平衡与稳定,在植物对环境适应过程中也有着不可或 缺 的 作 用。拟 南 芥 中,C B L家 族 基 因A t C B L 1、A t C B L 2、A t C B L 5、A t C B L 9、A t C B L 1 0均响应非生物胁迫1 0-1 4,其中,A t C B L 1响应低温胁迫1 5。玉 米 中,Z m C B L 3、Z
16、m C B L 4、Z m C B L 5和Z m C B L 8与Z m C I P K 1 6互作响应干旱、盐等逆境胁迫1 6。在水稻中,过表达O s C B L 8赋予了水稻对高温和病原体的抵抗力1 7,但O s C B L 5对植物盐 胁 迫 负 调 控1 8;低 温 处 理 可 提 高 豌 豆 的P s C B L转录水平,但干旱处理后,P s C B L的表达无显 著 差 异1 9;在 杨 树 中,P e C B L 1、P e C B L 2、P e C B L 4、P e C B L 5和P e C B L 9在盐胁迫下表达量均上调2 0。但目前关于小麦C B L s的基因组学
17、和参与非生物胁迫的研究尚未见报道。为了探讨小麦C B L的功能,本研究对小麦的C B L基 因 进 行 了 全 基 因 组 分 析,探 究 小 麦C B L基因特征,并对本课题组前期在转录组数据库中筛选获得的8个差异表达的小麦C B L基因(未发表)进行表达模式分析,以期为深入研究小麦C B L基因的功能奠定基础。1 材料与方法1.1 小麦C B L基因家族成员的鉴定参考齐 越等2 1对小麦D E A D-b o x基因家族成员鉴定的方法。首先,从E n s e m b lP l a n t s数据库(h t t p:/p l a n t s.e n s e m b l.o r g/i n d
18、 e x.h t m l)中下载小麦(中国春)全基因组数据,包括全基因组序列及注释文件,并且从水稻基因组数据库(h t-t p:/r i c e.p l a n tb i o l o g y.m s u.e d u/)下载水稻的C B L蛋白。利用水稻C B L家族蛋白质序列作为q u e r y序列,以1 5比例提取基因,并除去重复基因,检索小麦C B L家族基因。利用P f a m(h t t p:/p f a m.x f a m.o r g/)及N C B I(h t t p:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/S t r u c t u r e/b w r p
19、 s b/b w r p s b.c g i)验证候选蛋白的结构域,手动逐一筛选错误序列,排除冗余序列,以获得目标小麦C B L家族基因成员。使 用 在 线 软 件E x P A S y(h t t p:/e x p a s y.o r g/)预测小麦C B L蛋白氨基酸长度、分子量、等电点和脂肪指数等理化性质。在亚细胞定位预测网站(h t t p:/www.c s b i o.s j t u.e d u.c n/b i o i n f/C e l l-P L o c-2/)对C B L进行亚细胞定位预测。1.2 小麦C B L结构域蛋白系统发育树的构建使用C l u s t e r X V
20、2.0(h t t p:/www.c l u s t a l.o r g/c l u s t a l 2/)对小麦、水稻、拟南芥的C B L基因家族所编码的蛋白质进行氨基酸序列对比分析。使 用ME GA(h t t p s:/www.m e g a s o f t w a r e.n e t/)软件的最大似然法(ML)构建系统发育树,设置b o o t s t r a p值为10 0 0。下载的序列已知染色体位置。1.3 小麦C B L蛋白保守结构域和基因结构分析对小麦C B L家族蛋白保守基序的检索分析采用MEME软件(h t t p:/m e m e-s u i t.o r g/),检索参
21、数使用Z e r oo ro n eo c c u r r e n c ep e rs e q u e n c e(z o o p s),基序数值设为9。参考P f a m数据库,对小麦C B L基因家族进行蛋白保守结构域比对分析(E-v a l u e1.0)。使用在线软件G S D 2.0(h t-t p:/g s d s.g a o l a b.o r g/)分析基因结构,T a C B L基因组和C D S序列在E n S e m b lP l a n t s数据库中获得,将序列导入到在线软件G S D 2.0中,对小麦C B L内含子和外显子结构进行分析。1.4 C B L基因家族的
22、共线性分析应用P h y t o z o m e数据库(h t t p s:/d a t a.j g i.d o e.g o v/)获得水稻和拟南芥的全基因组序列及其基因注释文件。小麦基因组数据库中,使用C i r c o s软件获得位置信息,将所有小麦C B L基因定位到染色体上。使用小麦全基因组数据与水稻及拟南芥全基因组对照提取(每个基因提取数3 0)。使用MC S c a n X对小麦进行共线性分析,参数设置取默认值。基因之间的进化关系由同义替代率(K s)和非同义替代率(K a)表现,使用K a K s_C a l c u l a t o r2.0计算小麦的K a/K s比值,除了三6
23、211麦 类 作 物 学 报 第4 3卷对T a C B L基因的K a/K s比值大于1,其他T a C B L小麦基因的K a/K s比值均小于1,由此分别构建出小麦种内共线性图谱及小麦与水稻、拟南芥种间共线性图谱。所有T a C B L基因的位置和染色体长度从E n S e m b lP l a n t s数据库注释信息中获得,并且用T BT o o l s进行绘制。1.5 小麦C B L基因在低温下的表达模式分析对课题组先前建立的转录组数据库进行分析发现,D n 1的分蘖节和叶片含有大量与低温胁迫有关的C B L,筛选到8个低温胁迫下表达量变化显著的C B L,本研究对这8个C B L
24、在低温下的表达模式进行分析。供试材料选用强抗寒性冬小麦品种 东 农 冬 麦1号(D n 1)和 东 农 冬 麦2号(D n 2),于2 0 2 0年9月1 2日播种于东北农业大学试验田,种植区行长2m,种植间距0.2m,播种深度为5c m,每行播种约2 0 0粒。覆土进行自然萌发。大田自然降温连续1 0d平均的最低温度分别达到5、0、-1 0和-2 5时,取其叶片和分蘖节用于8个基因表达量测定。使用康为世纪的U l t r a p u r eR NAK i t试剂盒提取样品的总R NA,使用诺唯赞H i S c r i p t I I I1 s tS t r a n dc D NAS y n
25、t h e s i sK i t(+g D NA w i p e r)试剂盒对提取的总R NA合成c D NA。使用小麦多组学数据库(h t t p:/2 0 2.1 9 4.1 3 9.3 2/)设计8个C B L基因的q R T-P C R特异性引物(表1),并且利用2-C T方法计算其相对表达量。表1 q R T-P C R特异性引物T a b l e 1 q R T-P C Rs p e c i f i cp r i m e r s引物名称P r i m e rn a m e上游引物FF o r w a r dp r i m e rF(5 -3)下游引物RR e v e r s ep
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