夏枯草乙酸乙酯提取物对一氧化氮合酶作用的研究.pdf

550药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）夏枯草乙酸乙酯提取物对一氧化氮合酶作用的研究郑洋滨，洪燕，龚玮，周年，刘宁江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029摘要：目的 研究夏枯草乙酸乙酯提取物对人脐静脉内皮细胞融合细胞（EAhy926）中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的作用。方法 体外培养 EAhy926，将其分为夏枯草乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组和阴性对照组，分别用31.20、15.60、7.80 g/mL 夏枯草乙酸乙酯提取物和 5 DMSO 的培养基孵育 24 h。通过试剂盒检测一氧化氮（NO）和eNOS 含量。采用 Western blot 检测 eNOS、磷酸化内皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）、热激蛋白 90（HSP-90）、窖蛋白-1（Cav-1）的表达。结果 试剂盒结果显示中、高剂量组细胞内 NO 和 eNOS 含量高于阴性对照组，差异有统计学意义（P0.05）。Western blot 结果显示中、高剂量组 eNOS 和 HSP-90 的蛋白表达高于阴性对照组，Cav-1 的蛋白表达低于阴性对照组，差异有统计学意义（P0.05）；高剂量组 p-eNOS 的蛋白表达高于阴性对照组，差异有统计学意义（P0.05）。结论 夏枯草乙酸乙酯提取物通过增加血管内皮细胞内 eNOS、p-eNOS 的表达，增加 NO 释放；此外，其还能提高 HSP-90 的蛋白表达，降低 Cav-1 的蛋白表达，促进 eNOS 释放 NO，从而舒张血管，降低血压。关键词：夏枯草属；乙酸乙酯；一氧化氮合酶；磷酸化一氧化氮合酶；热激蛋白；窖蛋白-1DOI:10.19939/ki.1672-2809.2023.05.07Effect of Ethyl Acetate Extract of Prunella Vulgaris on Nitric Oxide SynthaseZHENG Yangbin,HONG Yan,GONG Wei,ZHOU Nian,LIU NingJiangxi Institute for Drug Control,NMPA Key Laboratory of Quality Evaluation of Traditional Chinese Patent Medicine,Jiangxi Province Engineering Research Center of Drug and Medical Device Quality,Nanchang Jiangxi 330029,China.Abstract:Objective To study the effects of ethyl acetate extract of prunella vulgaris on endothelial nitric oxide synthase(eNOS)synthesis by human umbilical vein endothelial cells(EA hy926).Methods EA hy926 were cultured in vitro and divided into high,medium and low dose groups of prunella vulgaris ethyl acetate extract and negative control group,31.20,15.60,7.80 g/mL ethyl acetate extract of prunella vulgaris and 5 DMSO were incubated for 24 hours.Detect the content of nitric oxide(NO)and eNOS through the kit.The expressions of eNOS,phosphorylated endothelial nitric oxide synthase(p-eNOS),heat shock proteins 90(HSP-90)and caveolin-1(Cav-1)were detected by Western blot.Results The results of the kit showed that the contents of intracellular NO and eNOS in the medium and high dose groups were higher than those in the negative control group,and the difference was statistically significant(P0.05).Western blot results showed that the protein expression of eNOS and HSP-90 in the medium and high dose groups was higher than that in the negative control group,and the protein expression of Cav-1 was lower than that in the negative control group,the difference was statistically significant(P0.05);the protein expression of p-eNOS 基金项目：江西省药品监督管理局科研项目（2019JS39）作者简介：郑洋滨，硕士，主管药师。研究方向：药包材生物项目检验。E-mail:通信作者：刘宁，硕士，主任药师。研究方向：药包材生物项目检验。E-mail:与体外透皮性能研究 J.中国医药工业杂志,2020,51(11):1410-1417.21 王雅琪,杨园珍,伍振峰,等.中药挥发油传统功效与现代研究进展 J.中草药,2018,49(2):455-461.22 NATHALIA N D,ALINEA E,DAIANA C S,et al.Lavandula angustifolia essential oil inhalation reduces mechanical hyperalgesia in a model of inflammatory and neuropathic pain:the involvement of opioid and cannabinoid receptors-ScienceDirectJ.Journal of Neuroimmunology,2020,15(340):577145.23 KIM D S,LEE H J,JEON Y D,et al.Alpha-pinene exhibits anti-inflammatory activity through the suppression of MAPKs and the NF-B pathway in mouse peritoneal macrophages J.Am J Chin Med,2015,43(4):731-742.24 LEE G G,PARK J B,KIM M S,et al.Analgesic effects of eucalyptus essential oil in miceJ.Korean J Pain,2019,32(2):79-86.25 丁元刚,马红梅,张伯礼.樟脑药理毒理研究回顾及安全性研究展望 J.中国药物警戒,2012,9(1):38-42.收稿日期：2023-02-10 定稿日期：2023-04-19551药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）in the high dose group was higher than that in the negative control group,the difference was statistically significant(P0.05).Conclusion The ethyl acetate extract of prunella vulgaris increased NO release by increasing the expression of eNOS and p-eNOS in vascular endothelial cells;in addition,it can also increase the protein expression of HSP-90,reduce the protein expression of Cav-1,promote eNOS to release NO,so as to relax blood vessels and reduce blood pressure.Key words:Prunella;Ethyl acetate;Nitric oxide synthase;Phosphorylated nitric oxide synthase;Heat shock protein;Caveolin-1夏枯草主要有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降血压等药理作用1，具有清火除热，清肝明目，散结消肿等功效2，可有效扩张血管，具有良好的降压效果3。在前期的研究中发现，夏枯草乙酸乙酯提取物有内皮依赖性血管舒张作用，且其血管舒张作用与一氧化氮（NO）的释放和一氧化氮合酶（NOS）的调节有关4。夏枯草乙酸乙酯提取物多为挥发油、萜类、黄酮、甾醇类和香豆素类。已有文献5-6报道夏枯草中的黄酮类化合物主要有山柰酚、槲皮素、芦丁等，均是有明确舒张血管作用的化合物，均能导致内皮依赖性大鼠胸主动脉舒张。为了进一步阐明夏枯草乙酸乙酯提取物的降压机制，本课题组对其在内皮细胞中的作用机制进行更深入研究。1 材料与方法1.1 细胞株人脐静脉内皮细胞融合细胞（EAhy926），购自上海语纯生物科技有限公司。1.2 实验样品及主要试剂夏枯草药材购自毫州市中信中药饮片厂，批号：1904001；人内皮型一氧化氮合酶（eNOS）测定剂盒（上海泛柯实业有限公司，货号：F0465-B）；NO 测定试剂盒（碧云天生物技术公司，货号：NOS0021S）；BCA 蛋白检测试剂盒（碧云天生物技术公司，货号：NO.P0012S）；兔抗人窖蛋白-1（Cav-1）多克隆抗体（批号：0209500101），兔抗人内皮型一氧化氮合酶（eNOS）多克隆抗体（批号：5500004931），兔抗人磷酸化内皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）多克隆抗体（批号：2101760101），兔抗人热激蛋白 90（HSP-90）多克隆抗体（批号：4000001169）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；小鼠抗人-action（江苏亲科生物研究中心有限公司，批号：#37u8343），辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG（批号：22221），辣根酶标记山羊抗兔 IgG（批号：20121）均购自北京康为世纪生物科技有限公司。1.3 实验仪器MB614S 电子天平（d=0.1mg），PowerPacTM Basic电泳仪，IC1000 细胞计数器，ChemiDoc MP 凝胶成像仪，MULTISKAN GO 酶标仪。1.4 实验方法1.4.1 试验样品配制 称取夏枯草乙酸乙酯干浸膏2.03 g 加二甲基亚砜（DMSO）10 mL 溶解为母液。用 DMEM 培养基将母液稀释至 1 500.00、1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.20、15.60 g/mL的样品。1.4.2 细胞毒性试验 取对数生长期细胞，按每孔1104个细胞接种于 96 孔板。待细胞铺满 80%，加入“1.4.1”项下样品，空白对照组给予 5 DMSO的培养基，每组设 8 个复孔。24 h 后每孔加入 MTT 20 L，CO2培养箱孵育 4 h，弃去孔内液体，每孔加 DMSO150 L 溶解，振荡 10 min，在 570 nm和 630 nm 双波长下测定吸光度。计算相对增殖度（RGR），RGR=实验组吸光度/空白对照组吸光度100%。RGR 80%则认为无细胞毒性作用7。1.4.3 对 NO 浓度和 NOS 含量的影响 取对数生长期细胞，按每孔 5105个细胞接种于 6 孔板。待细胞铺满 80%，加入 31.20、15.60、7.80 g/mL 的样品作为高、中、低剂量组，阴性对照组给予 5 DMSO的培养基。24 h 后收集上清液，检测细胞外 NO 含量，每组重复测定 8 次。将 6 孔板置于冰上，每孔加 4 预冷 PBS 洗涤 3 次，再加 200 L 细胞裂解液，用枪吹打数下，将裂解液和细胞碎片转移至 1.5 mL的离心管中，14 000 g 离心 5 min，离心半径 7 cm。取上清液检测细胞内 NO 和 eNOS 含量，每组重复测定 8 次。1.4.4 Western blot 检测蛋白表达 BCA 蛋白测定试剂盒检测细胞裂解液中蛋白质含量，取等量蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，而后将蛋白转印至PVDF 膜上，封闭液孵育 1 h 后，根据 marker 标记剪取目的蛋白 eNOS、p-eNOS、HSP-90 和 Cav-1 的条带，分别加入经 1500 稀释后的兔抗人 eNOS、p-eNOS、HSP-90、Cav-1 多克隆抗体，4 孵育过夜。洗膜后用 12 000 稀释的辣根酶标记山羊抗兔IgG 在脱色摇床上室温孵育 1 h。孵育后的 PVDF 膜经 3 次洗涤，加入显色剂显色，在凝胶成像系统中拍照，采用 Image J 软件对目的蛋白进行灰度分析8，552药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）重复试验 3 次。1.5 统计学方法以 SPSS 17.0 统计学软件处理数据，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用 Dunnett-t 检验，方差不齐采用 Tamhanes T2 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 MTT 实验结果实验结果表明，当夏枯草乙酸乙酯提取物浓度大于 31.20 g/mL 时，会影响 EAhy926 的增殖度，见图 1。故后续实验选择 31.20、15.60、7.80 g/mL作为高、中、低剂量组。图1 夏枯草乙酸乙酯提取物MTT实验结果2.2 对 NO 释放量及 eNOS 含量的影响中、高剂量组细胞内 NO 和 eNOS 含量高于阴性对照组（P0.05），见表 1。表1 夏枯草乙酸乙酯提取物对NO释放量及eNOS含量的影响（，n=8）组别eNOS 含量/（ng/mL）胞内 NO 含量/（mol/L）胞外 NO 含量/（mol/L）阴性对照组13.000.651.460.220.540.18低剂量组13.440.901.660.350.500.11中剂量组 14.341.12a 2.270.45a0.640.08高剂量组 15.230.54a 3.230.85a0.670.15F8.4513.862.25P0.0010.0000.114注：与阴性对照组比较，aP0.05；eNOS，内皮型一氧化氮合酶；NO，一氧化氮。2.3 对相关蛋白表达的影响中、高剂量组细胞内 eNOS 和 HSP-90 的蛋白表达均高于阴性对照组（P0.05），Cav-1 的蛋白表达均低于阴性对照组（P0.05）。高剂量组p-eNOS 蛋白表达高于阴性对照组（P0.05）。见表 2、图 2。表2 夏枯草乙酸乙酯提取物对eNOS、p-eNOS、Cav-1 和HSP-90蛋白表达的影响（，n=3）组别eNOSp-eNOSCav-1HSP-90阴性对照组1.290.210.540.235.740.180.740.22低剂量组1.770.320.720.294.600.750.760.13中剂量组 2.540.41a0.850.15 4.420.41a 1.170.08a高剂量组 3.330.85a 1.310.43a 3.850.54a 1.420.22aF9.223.907.0810.40P0.0060.0550.0120.004注：表格数据为各蛋白灰度值，以-actin为对照；与阴性对照组比较，aP0.05；eNOS，内皮型一氧化氮合酶；p-eNOS，磷酸化内皮型一氧化氮合酶；Cav-1，窖蛋白-1；HSP-90，热激蛋白90。阴性 低剂量 中剂量 高剂量阴性 低剂量 中剂量 高剂量阴性 低剂量 中剂量 高剂量阴性 低剂量 中剂量 高剂量注：eNOS，内皮型一氧化氮合酶；p-eNOS，磷酸化内皮型一氧化氮合酶；Cav-1，窖蛋白-1；HSP-90，热激蛋白90。图2 夏枯草乙酸乙酯提取物对相关蛋白表达的影响3 讨论Cav-1 是胞膜窖的膜整合蛋白，主要分布于内皮细胞、平滑肌细胞等细胞中，负责调控众多定位553药品评价 Drug Evaluation 2023,20（5）于胞膜窖的信号分子的活性。在静息状态下，eNOS与 Cav-1 结合，处于失活状态，当细胞受外界信号刺激时，eNOS 与 Cav-1 分离，eNOS 被激活，从而产生 NO9-12。HSP-90 作为分子伴侣蛋白，细胞受外界信号刺激时，HSP-90 会占据 eNOS 上的 Cav-1结合位点，eNOS 与 HSP-90 的结合促进了 Akt 的聚集，Akt 使 eNOS 的 Ser1179 和 Thr497 磷酸化，促进 eNOS 释放 NO，舒张血管，降低血压。因此，降低 Cav-1 表达，增加 HSP-90 表达，可以促进eNOS 释放 NO13-15。本次实验结果表明，夏枯草乙酸乙酯提取物能增加细胞内 eNOS 含量，促进 NO 释放，其通过提高 EAhy926 内 eNOS 和 p-eNOS 的蛋白表达，增加细胞内 eNOS 的含量和活性，使 NO 释放增多。此外夏枯草乙酸乙酯提取物还能增加 HSP-90 的蛋白表达，降低 Cav-1 的蛋白表达，使 eNOS 与 HSP-90 结合增多，促进 eNOS 磷酸化，增加 NO 的释放。然而，本次实验未对夏枯草乙酸乙酯提取物进行进一步的分离、纯化；因此，夏枯草提取物中具体哪一类化合物起到增加 NO 释放作用将是课题组未来的研究方向。综上所述，夏枯草乙酸乙酯提取物的舒张血管作用与增加血管内皮细胞的 NO 释放有关，其能够通过增加血管内皮细胞内 eNOS、p-eNOS 和 HSP-90 的蛋白表达，降低 Cav-1 的蛋白表达，增加细胞内 eNOS 的含量和活性，促进 eNOS 释放 NO，从而舒张血管，降低血压。本次实验基本阐明了夏枯草乙酸乙酯提取物在内皮细胞中的作用机制，为夏枯草进一步的开发利用提供理论基础。参考文献1 窦景云.夏枯草药理作用及临床应用研究进展 J.现代医药卫生,2013,29(7):1039-1041.2 李永桂,管昱鑫,李小鸾,等.夏枯草汤加减结合雷火神针治疗良性甲状腺结节(气郁痰阻型)临床效果观察 J.中华中医药学刊,2022,40(8):225-228.3 陈云峰.夏枯草汤治疗老年高血压的临床效果分析 J.中国社区医师,2021,37(3):121-122.4 郑洋滨,刘宁,艾力奇,等.夏枯草乙酸乙酯部位对离体大鼠胸主动脉环舒张作用的研究 J.药品评价,2021,18(19):1171-1175.5 陈志卫,胡永洲,吴好好,等.黄酮类化合物的合成及其血管舒张作用 J.药学学报,2005,40(11):1001-1007.6 张金华,邱俊娜,王路,等.夏枯草化学成分及药理作用研究进展 J.中草药,2018,49(14):3432-3440.7 中国食品药品监管总局.国家药包材标准 S.北京:中国医药科技出版社,2015.8 付剑江,王曦聆,吕红,等.罗布麻叶提取物的抗高血压作用及其机制研究 J.中国实验方剂学杂志,2013,19(7):159-164.9 熊雪云,李美慧,周琳韵,等.诱导型一氧化氮合酶和内皮型一氧化氮合酶在胃癌中的表达关系及临床意义 J.实用医技杂志,2021,28(4):447-449.10 刘代华,黄红林,廖端芳.热休克蛋白 90 在心血管系统中的作用 J.国外医学(生理、病理科学与临床分册),2004,24(5):473-475.11 张丽,李林,李爱歆,等.白藜芦醇对同型半胱氨酸损伤的人脐静脉内皮细胞 NO、eNOS 和小凹蛋白表达影响 J.中国实验诊断学,2014,18(12):1923-1925.12 李翔.钙敏感受体对持续性肺动脉高压新生小鼠中小凹蛋白-1、内皮型一氧化氮合酶及一氧化氮的影响 D.石河子:石河子大学,2019.13 衣卫杰,任玮叶,张丕伟,等.绿茶多酚影响高脂膳食大鼠心肌 HSP90 和 CAVEOLIN-1 表达的实验研究 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