消饮化瘀方对慢性心力衰竭大鼠NT-proBNP及GPR35mRNA水平的影响.pdf

2023年9 月第43卷第5期Sep.2023Vol.43No.5引用：王铭，马立旭，王秀萍,等.消饮化瘀方对慢性心力衰竭大鼠NT-proBNP及GPR35mRNA水平的影响 J.现代中医药,2 0 2 3,43(5):113-117.现代中医药Modern Chinese Medicine113消饮化瘀方对慢性心力衰竭大鼠NT-proBNP 及 GPR35mRNA水平的影响王铭2马立旭王秀萍12 韩金荣2 徐（1.宁夏区域高发病中西医结合防治研究重点实验室，银川7 50 0 0 4;2.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，银川7 50 0 0 4;3.宁夏回族自治区人民医院，银川7 50 0 0 2)徐建虎1，2*摘要：目的探讨消饮化瘀方干预慢性心力衰竭（chronic heartfailure,CHF）大鼠的可能作用机制。前体脑钠肽（N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP）及G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor 35，GPR35mRNA)水平的影响。方法7 2 只SD大鼠随机分成空白组和A组,A组采用腹腔注射阿霉素6 周复制CHF模型。随后将A组大鼠随机分为模型组、中药低剂量组（7 gkg）、中药中剂量组（14gkg）、中药高剂量组（2 8 gkg）及美托洛尔组（10 mgkg），分别给与对应的药物，每日一次，连续4W。苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin stain,HE）染色观察心肌组织的形态学变化，酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosor-bent Assay,Elisa）检测血清中前体脑钠肽（N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP）的含量，实时荧光定量PCR(Real Time PCR,RT-PCR)检测心肌组织中GPR35mRNA表达水平。结果与空白组相比,模型组 NT-proBNP含量、GPR35mRNA表达水平明显上升（P0.01）；治疗后，与模型组相比，各治疗组NT-proBNP含量、GPR35mRNA表达水平明显下降(P0.01,P0.05）。结论消饮化瘀方对CHF大鼠的防治作用可能与抑制CPR35表达,改善心肌缺血缺氧有关。关键词：消饮化瘀方；慢性心力衰竭；GPR35mRNA中图分类号：R256.22D0I:10.13424/ki.mtcm.2023.05.021慢性心力衰竭（chronic heart failure，CH F）是由于体循环和肺循环瘀血从而出现心动过速、呼吸困难、下肢水肿等一系列症状 1-2 ,其中体循环和肺循环瘀血导致心脏缺血缺氧是CHF发生发展的关键。研究发现G蛋白偶联受体35（Gprotein-coupled receptor 35,GPR35）是治疗心血管疾病的新兴靶点 3,抑制CPR35可减轻心肌缺血缺氧损伤 41。中医认为心气虚是CHF发病的根本,瘀血为发病的中心环节，水停为发病的必然结果 5-6 。慢性心力衰竭中医诊疗专家共识也指出痰饮和瘀血是 CHF 的病理因素 7 。本研究通过观察消饮*基金项目：宁夏自然科学基金项目（2 0 2 0 AAC03128）*通讯作者：徐建虎，副教授。E-mail:文献标识码：A文章编号：16 7 2-0 57 1(2 0 2 3)0 5-0 113-0 5化瘀方对CHF大鼠前体脑钠肽（N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)及 GPR35mRNA的影响，探讨其可能作用机制。1仪器与材料1.1仪器RM2016切片机（上海徕卡仪器有限公司）；酶标仪（芬兰公司）；洗板机（芬兰公司）；centrifuge5417R低温高速离心机（Eppendorf公司）；BioPhotometer生物分光光度计（Eppendorf公司）;DS-核酸蛋白定量仪（美国丹诺尔）；CFXConnect荧光定量PCR仪（美国Bio-RAD）。1.2试药消饮化瘀方中所有药材均购自宁夏现代中医药114Modern Chinese Medicine医科大学附属回医中医院门诊部，经宁夏医科大学药学院中药教研室检验合格；美托洛尔（批号：H32025391,阿斯利康药业有限公司）；盐酸阿霉素（批号：S17092，源叶生物公司）。苏木素染液（北京百灵威科技有限公司）；伊红染液（源叶生物，R20594）；NT-p r o BNPEl i s a 试剂盒（上海信裕生物科技有限公司，XYR903292）;2*SYBR M ix t u r e 荧光定量试剂盒（北京天根，Cat#FP-205-2）；H iFiS-criptT快速去除基因组cDNA第一条链合成试剂盒（康为试剂,Cat#CW2582M)。1.3实验动物SPF级SD雄性大鼠,2 40 2 6 0 g，购买于宁夏医科大学动物中心，许可证号：SCXK（京）2 0 19-0 0 0 8。已通过宁夏医科大学实验动物伦理申请。2方法2.1分组与造模方法用计算机随机数字法将72只大鼠随机分为空白组和A组，A组参考文献 8-9 复制CHF模型,选用2 mgkg的剂量进行腹腔注射阿霉素，每周2 次，共6 W。将复制成功的CHF大鼠随机分为模型组、消饮化瘀方（简称中药)高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、美托洛尔组，每组12 只。2.2药物制备及干预按照中国药典制剂制备的相关要求,将消饮化瘀方制成含2 gmL-1生药的药液。给药剂量按照成人与大鼠体表面积换基因GPR35-actin2.4统计学方法采用SPSS26.0统计软件进行数据分析，计量资料以xs表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两比较用最小显著性差异法(LSD)检验,以P0.05为差异具有统计学意义。3结果实验过程中，模型组死亡1只（腹水），美托洛尔组死亡4只（腹水及麻药过量），中药低剂量组死亡2 只（腹水及灌胃手法操作不当），中药中剂量组死亡1只（灌胃手法操作不当），中药高剂量2023年9 月第43卷第5期Sep.2023Vol.43 No.5算,分别给予中药高（2 8 gkg=）、中（14gkg=）、低(7 gkg-）及美托洛尔（10 mgkg）灌胃（高、中、低剂量分别相当于成人等效剂量的2 倍、1倍、0.5倍）,空白组和模型组灌胃给予等量的生理盐水，每日一次,连续4W。2.3指标检测2.3.1HE染色观察心肌组织形态学变化取心肌组织放入4%多聚甲醛固定，经冲水、梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤后，制成切片,6 0 烘片2 h后进行脱蜡、梯度酒精脱水、苏木精染色、盐酸酒精分化、伊红染色、透明、封片。显微镜下观察心肌组织形态学变化并拍照。2.3.2Elisa检测血清中NT-proBNP含量腹主动脉采血,40 0 0 rmin-1,离心10 min，吸取上层血清,用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清中 NT-proBNP的水平。按照试剂盒使用说明书中操作步骤进行操作。2.3.3Real Time PCR检测心肌组织中 GPR35mRNA表达水平用Trizol提取心肌组织中总RNA,逆转录为cDNA,并进行实时荧光定量PCR检测。将样品放人实时定量PCR扩增仪中预变形9 515min后,9 5变形10 s、退火30 s、7 2 延伸30 s40个循环。用GPR35mRNA基因引物和-actin 内参基因引物进行扩增。同时在6 0 9 5进行溶解曲线分析利用PCR仪绘出扩增曲线,进行结果分析。见表1。表1引物序列上游引物CTTGGCCGTGTTTATCATCTCTGAGAGGGAAATCGTGCGTGA下游引物GCATCCTGGAACTCTTTGGAGGAAGAGGATGCGGCAGTGGC组死亡2 只（灌胃手法操作不当）。3.1消饮化瘀方对大鼠心肌组织形态学变化的影响HE染色结果显示：空白组可见心肌细胞横纹清楚,排列整齐,无肌纤维断裂,胞质均匀,表明心肌为正常结构；模型组可见心肌细胞排列紊乱，心肌间质水肿,肌纤维断裂，伴有大量的慢性炎症细胞浸润,出现明显的心肌纤维化特征；各治疗组与模型组相比，心肌细胞排列变整齐，无心肌纤维断裂。见图1。产物长度(bp)192932023年9 月第43卷第5期Sep.2023Vol.43No.5现代中医药Modern Chinese Medicine115空白组型美托洛尔组中药低剂量组图1各组大鼠心肌组织形态学变化(HE染色，2 0 0)3.2消饮化瘀方对大鼠血清NT-proBNP含量的影响与空白组相比,模型组NT-proBNP含量明显升高(P0.01）;治疗后,各组NT-proBNP含量均明显降低(P0.01)。见表2。表2 各组大鼠血清NT-proBNP含量的比较(xs)组别NT-proBNP(pg mL-1)n空白组12模型组11美托洛尔组8中药低剂量组10中药中剂量组11中药高剂量组10注：与空白组比较，*P0.01;与模型组相比,P0.013.3消饮化瘀方对大鼠心肌组织GPR35mRNA表达水平与空白组相比,模型组GPR35mRNA表达水平明显升高（P0.01)；治疗后各组GPR35mRNA表达水平明显降低（P0.01,P0.05)。见表3。表3各组大鼠GPR35mRNA表达水平的比较(xs,n=3)组别空白组模型组美托洛尔组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组注：与空白组比较，*P0.01,*P0.05;与模型组相比,P0.01,#P0.05中药中剂量组4讨论中医并无“心力衰竭”这一病名，近代医家认为金匮要略中记载的“心水”“支饮”与CHF的症状十分相近,认为水饮是导致心衰发生的关键。唐宗海的血证论中提出“血病不离乎水,水病不离乎血”的观点,认为水饮和瘀血之关系密切。治44.69 1.83法上根据“病痰饮者，当以温药和之”的治疗原则54.69 1.70*及经方例释日“劳本治心水，故千金十水49.80 2.33*#丸,用以治赤水之从心肿者”。故选用的消饮化瘀50.70 2.17*#49.50 1.98*#48.37 0.97*#GRP35mRNA1.13 0.143.68 0.53*1.93 0.11*#3.08 0.22*#2.07 0.14*#1.75 0.98*#中药高剂量组方是以经方苓桂术甘汤合掌大枣泻肺汤为主方,加丹参、川芎、葛根组成,以化饮为主，兼以活血。2 0 14年慢性心力衰竭中医诊疗专家共识中也同样指出活血化痰利水的治法 7 。史君等 10 将近2 0 年 CHF的临床用药规律进行分析,发现也是以益气、活血、利水的药物为主。说明消饮化瘀方与近代医家思路是一致的。NT-proBNP主要由心室肌细胞释放，主要生理功能是舒张血管、利尿、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮(RAA)和交感神经系统 。在CHF发生时，心脏内压力增高,NT-proBNP的分泌和合成增多，所以NT-proBNP的浓度反应了心衰的严重程度。在本研究中模型组的NT-proBNP含量明显高于空白组,提示 CHF大鼠模型复制成功。治疗后各组NT-proBNP含量明显下降,提示消饮化瘀方能够有效改善CHF。这可能与消饮化瘀方利尿、扩张血管的功能密不可分。现代药理学表明劳子有强心、利尿、拮抗肾素-血管紧张素系统（RAS）等作现代中医药116Modern Chinese Medicine用 1 2 。苓桂术甘汤合掌劳大枣泻肺汤具有调节水液代谢的作用 1 3-4 。葛根、丹参、桂枝等药具有扩张血管的作用 1 5-1 7 G蛋白偶联受体（GPCR是最大和最多的基因家族之一,并构成最大的受体家族,很多临床药物都是通过此类受体来发挥作用 1 8 。GPR35 是一种孤儿受体（尚未被内源性配体激活的受体），近年来被发现与心血管疾病关系密切,可作为治疗心血管疾病的新兴靶点 1 9 。相关研究发现 CPR35的基因表达在人类衰竭的心肌中增加,认为可以将GPR35基因用于诊断心力衰竭,并作为治疗心力衰竭的可能药物靶点 2 0 。Ronkainen VP等 2 1 研究认为GPR35是一种新型的缺氧敏感基因,缺氧诱导因子1（HIF-1）激活诱导GPR35过表达，导致肌动蛋白细胞骨架的排列，使心肌细胞发生形态学变化，从而介导心肌重塑。同时发现GPR35在缺氧导致压力负荷引起的心脏肥大、心肌梗死急性期及小鼠心衰模型中明显升高。贺磊4 1 等研究发现使用CPR35活性抑制剂（C ID 2 7 4 56 7 8）能够抑制低氧环境导致的心肌细胞调亡,改善心肌梗死后的心肌重构。这些研究提示心肌缺血缺氧是导致GPR35上调的一个主要因素,在 CHF 的发病中起着重要作用。不同的心血管疾病都存在一定程度的缺血缺氧 2-2 4 。我们认为 CHF 的缺血缺氧与水饮、血瘀有密切关系。素问痿论云：“心主身之血脉。”心脏健康，心气旺盛，血脉充盈，心主血脉功能正常,将血中的营养物质供给周身组织器官。反之，心脏受损，心主血脉功能失常，心阳不足，推动无力,则血行瘀阻；心阳不足，坐镇无权，不能镇摄寒水,则水饮邪气乘虚上逆凌心；心脏受损，水谷精微贯注心脉,不能顺利化赤为血,则致心血不足。血行瘀阻、水饮内停,阻滞了气血的运行,则心肌组织缺血缺氧,缺血缺氧又进一步加重了瘀血和水饮在体内的聚集,所以缺血缺氧与水饮瘀血形成一个恶性循环。在本研究中苓桂术甘汤合劳大枣泻肺汤消除了水饮，丹参、川芎、葛根祛除了瘀血，使气血运行通常，改善了心脏缺血缺氧的状态。现代药理研究证实丹参、葛根具有改善血液循环,抗心肌缺血缺氧的作用 2 5。结合本研究结2023年9 月第4 3 卷第5期Sep.2023Vol.43No.5果,治疗后各组GPR35mRNA表达水平明显降低，提示消饮化瘀方可能是通过抑制GPR35表达，改善心肌缺血缺氧,从而防治CHF。参考文献1中华医学会心血管病学分会心力衰竭学组，中国医师协会心力衰竭专业委员会，中华心血管病杂志编辑委员会.中国心力衰竭诊断和治疗指南2 0 1 8 J.中华心血管病杂志,2 0 1 8,4 6(1 0):7 6 0-7 8 9.2张广平，谢华宁.从2 0 1 8 中国心衰诊疗指南看更新亮点 J.陕西中医药大学学报,2 0 2 0,4 3（1)：4 0-4 2,6 1.3宋志平，杨永健.CPR35在心血管疾病中的研究进展J.心血管病学进展,2 0 1 9,4 0(9):1 3 0 4-1 3 0 7.4贺磊,杨怡,田,等.抑制G蛋白偶联受体3 5对小鼠缺血性心肌损伤的保护作用J.解放军医学杂志，2018,43(2):101-106.5董晓斌,孔立.慢性心力衰竭的中医病机演变探讨 J.环球中医药,2 0 1 1,4(3):2 0 1-2 0 3.6张军茹.中西医视角治疗慢性心力衰竭合并高尿酸血症探析 J.现代中医药,2 0 2 1,4 1(3):1-5.7毛静远，朱明军.慢性心力衰竭中医诊疗专家共识 J.中医杂志,2 0 1 4,55(1 4)：1 2 58-1 2 6 0.8徐建虎,张琦,杨子庆，等.阿霉素诱导大鼠慢性心衰模型的制备J.宁夏医科大学学报,2 0 1 6,3 8（3）：3 4 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