微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中醋化醋杆菌.pdf

13 2023,Vol.46 No.2 乳业科学与技术 分析检测微滴式数字PCR技术定量检测 发酵乳中醋化醋杆菌张雅伦，王 赞，张 瑞，陈勃旭，周 巍*，张 岩*（河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，国家市场监管重点实验室（特殊食品监管技术），特殊食品安全与健康河北省工程研究中心，河北 石家庄 050227）摘 要：建立一种微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）定量检测发酵乳中醋化醋杆菌的技术。根据醋化醋杆菌ITS基因序列设计特异性引物和探针，通过反应温度筛选优化ddPCR扩增条件，通过多种菌株扩增验证方法特异性，通过人工添加醋化醋杆菌验证方法检出限，通过ddPCR法实测结果和计数法测定结果之间的比较对其绝对定量进行系统性研究。结果表明：建立的发酵乳中醋化醋杆菌ddPCR定量检测方法，反应条件中最适退火温度为54.6，方法特异性强，检出限为7.2101 CFU/mL，灵敏度高，定量偏差率为23.73%。该方法可以满足发酵乳中醋化醋杆菌定量检测需求。关键词：微滴式数字聚合酶链式反应技术；发酵乳；醋化醋杆菌；定量检测Quantitative Detection of Acetobacter aceti in Fermented Milk by Droplet Digital Polymerase Chain ReactionZHANG Yalun,WANG Zan,ZHANG Rui,CHEN Boxu,ZHOU Wei*,ZHANG Yan*(Hebei Engineering Research Center for Special Food Safety and Health,Key Laboratory of Special Food Supervision Technology for State Market Regulation,Hebei Food Safety Key Laboratory,Hebei Food Inspection and Research Institute,Shijiazhuang 050227,China)Abstract:A droplet digital polymerase chain reaction(ddPCR)method for the quantitative detection Acetobacter aceti in fermentedmilkwasestablished.Specificprimersandprobesweredesignedaccordingtotheinternallytranscribedspacer(ITS)gene sequence of Acetobacter aceti,andannealingtemperaturewasoptimized.Thespecificityofthemethodwasverifiedbyapplyingitonvariousstrains,thelimitofdetection(LOD)wasdeterminedforartificiallyinoculatedAcetobacter aceti,andtheabsolutequantificationwassystematicallyinvestigatedbycomparingtheresultsofddPCRandthecountingresults.The experimental results showed that the optimal annealing temperature was 54.6,themethodhadstrongspecificityandhighsensitivity,andtheLODwas7.2101 CFU/mL.Thequantitativedeviationratewas23.73%.This method can meet the demand for quantitative detection of Acetobacter aceti in fermented milk.Keywords:droplet digital polymerase chain reaction;fermented milk;Acetobacter aceti;quantitative detectionDOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20220908-055中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1671-5187（2023）02-0013-05引文格式：张雅伦,王赞,张瑞,等.微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中醋化醋杆菌J.乳业科学与技术,2023,46(2):13-17.DOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20220908-055.http:/ZHANG Yalun,WANG Zan,ZHANG Rui,et al.Quantitative detection of Acetobacter aceti in fermented milk by droplet digital polymerase chain reactionJ.Journal of Dairy Science and Technology,2023,46(2):13-17.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20220908-055.http:/收稿日期：2022-09-08基金项目：河北省市场监督管理局科研计划项目（2022ZD12）第一作者简介：张雅伦（1991）（ORCID:0000-0001-5441-969X），男，工程师，硕士，研究方向为食品安全。E-mail:*通信作者简介：周巍（1983）（ORCID:0000-0003-1763-714X），男，教授级高级工程师，博士，研究方向为食品安全。E-mail:张岩（1979）（ORCID:0000-0002-2947-1629），男，教授级高级工程师，博士，研究方向为食品安全。E-mail:分析检测 Journal of Dairy Science and Technology 2023,Vol.46 No.2 14 发酵乳因含有丰富的蛋白质、糖类等多种营养物质，备受人们喜爱1-4，但发酵乳因其产品独特条件限制，极易在制备流程、流通过程、贮藏环境等中受到其他因素影响而导致产品质量下降，其中微生物污染对其带来的影响最为严重且难以控制5-7。醋化醋杆菌常被发现于腐烂的水果和产酸的食品中，其导致食品变质酸败的作用也逐渐为人熟知8。醋化醋杆菌同时也会造成发酵乳的污染，使其益生菌群结构改变，在酸乳表面形成菌膜，产生胀包和酸涩味等不良现象9。当今发酵乳等乳制品的质量和安全问题受到人们广泛关注，一旦受微生物污染的发酵乳流入市场，不但会对生产企业声誉造成损害，带来经济效益的巨大损失，还会对消费者的身体健康造成影响，危及生命安全。因此，不同环节的精准、定量掌控发酵乳中的污染情况，对发酵乳的质量至关重要10-11。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术自发明以来，已被广泛应用于微生物检验，推动了检验领域快速发展。第1代普通PCR技术通过凝胶电泳方式进行分析，但只能用于样品定性检验和半定量 研究12-17。第2代荧光PCR技术通过反应体系荧光信号进行分析，虽然与第1代技术相比提升了检验速度，减少了非特异性扩增，增加了精准性，但其定量计算是相对的，受到很大应用限制，不能达到定量分析要求18-21。随着定量分析需求日益增加，第3代数字PCR技术应运而生。微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术和荧光PCR技术相比具有高灵敏度、高精确度、高耐受性、绝对定量等特性，可以将一个传统PCR反应激发成数万个独立PCR反应，极大降低了其他因素影响，并且ddPCR方法无需依靠标准曲线和循环阈（cycle threshold，Ct）值，直接计算出样品的拷贝数，从而达到精准定量22。基于以上特点，ddPCR方法能够满足精准定量检测发酵乳中醋化醋杆菌的需求，该方法具有广泛应用前景23-25。本研究基于ddPCR技术建立发酵乳中醋化醋杆菌的检测方法，并对其反应条件进行优化，对其特异性和灵敏度进行验证，采用定量方法进行计算，为发酵乳中污染菌的定量检测提供一定的理论依据，为发酵乳生产企业的过程把控提供技术手段。1 材料与方法1.1 材料与试剂发酵乳购于当地超市，实验用菌株来自于有编号保存菌株，见表1。表 1 实验用菌株Table 1 Strains used in the study菌株编号菌种名称培养条件培养基CICC21482肠炎沙门氏菌37，兼性厌氧，G营养肉汤培养基CICC10420鼠伤寒沙门氏菌37，兼性厌氧，G营养肉汤培养基CICC21534福氏志贺氏菌36，兼性厌氧，G营养肉汤培养基CICC21560克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）36，兼性厌氧，G营养肉汤培养基CICC10357葡萄糖杆菌28，需氧，G醋酸菌培养基CICC21682醋化醋杆菌30，需氧，G醋酸菌培养基CICC21684醋化醋杆菌30，需氧，G醋酸菌培养基CICC22519醋化醋杆菌30，需氧，G醋酸菌培养基CGMCC1.811汉氏葡糖醋杆菌30，需氧，G醋酸菌培养基CICC6076植物乳杆菌37，厌氧，G乳杆菌培养基CICC22937空肠弯曲杆菌37，微需氧，G弯曲菌培养基CICC6223嗜热链球菌42，兼性厌氧，GMRS培养基CICC6077德氏乳杆菌37，兼性厌氧，GMRS培养基CICC6069婴儿双歧杆菌37，厌氧，G双歧杆菌培养基CICC21633单核增生李斯特氏菌37，兼性厌氧，G脑心浸液培养基CICC21617副溶血弧菌30，兼性厌氧，G3.5%氯化钠肉汤培养基CICC10041蜡样芽孢杆菌30，兼性厌氧，G牛肉膏微量元素培养基2ddPCR技术探针检测法混匀体系、微滴专用激发油和专用分析油 美国Bio-Rad公司；正向（反向）引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒（磁珠式）、Reagent D 德国Biotecon Diagnostics公司；营养肉汤培养基、醋酸菌培养基、乳杆菌培养基、弯曲菌培养基、MRS培养基、双歧杆菌培养基、脑心浸液培养基、3.5%氯化钠肉汤培养基、牛肉膏微量元素培养基 北京陆桥技术有限责任公司。1.2 仪器与设备QX200 ddPCR检测分析系统（包括微滴激发生成仪、微滴检测分析仪、DG8 cartridge微滴生成卡）、C1000 Touch Thermal Cycler PCR基因扩增设备 美国Bio-Rad公司；NanoDropLite核酸测定仪、711基因组全自动提取仪 美国Thermo公司；DK-98-1恒温水浴锅 东方电工仪器厂；BHC-300IIA/B3生物安全检验柜 苏州 净化仪器设备有限公司；3K15台式高速离心机 美国Sigma公司。1.3 方法1.3.1 基因组DNA的提取1.3.1.1 Reagent D处理细菌培养液将传代培养3 次的菌株培养液充分混匀，吸取100L增菌液和400LReagentD到2mL无菌离心管中，在室温条件下避光静置5 min；在500 W卤素灯下方1520 cm处放置离心管，曝光5 min后，8 000 r/min离心5 min，去除上清液；加入100L无菌水充分混匀，用于后续DNA提取。1.3.1.2 FoodProof磁珠提取法采用FoodProof基因组全自动提取仪提取醋化醋杆菌基因组DNA，具体步骤如下：1）取1mLReagentD处理后样品于2mL试管中，8 000 r/min离心5 min，15 2023,Vol.46 No.2 乳业科学与技术 分析检测保留沉淀，加入700LLysisBuffer和80L蛋白酶K，使用65 恒温水浴振荡30 min，12 000 r/min离心5 min，保留上清；2）准备设备所需Tip plate（每个样品孔内250LBindingBuffer和20L磁珠颗粒吹打混匀）、Washing plate（600LWashingBuffer）、Washing plate（800LWashingBuffer）、Washing plate（800LWashingBuffer）、Elution plate（80LElutionBuffer），并加入对应的Buffer；3）吸取500L第1步上清液于Binding plate；4）设备选择MPK 程序进行自动提取；5）程序完成后，将Elution plate上提取的DNA放置于20 备用。1.3.2 醋化醋杆菌特异性引物设计通过分析醋化醋杆菌的基因序列，从GenBank数据库中选取保守性强且特异性强的基因序列，最终选定醋化醋杆菌ITS基因为靶标序列，通过Primer Premier 6.0软件设计相关引物序列，并通过Oligo 7.37进行验证，经实验后获得醋化醋杆菌特异性检测引物，如表2所示。表 2 引物序列与探针Table 2 Sequences of primers and probes used for PCR靶标菌株引物序列靶标基因醋化醋杆菌正向引物：TGAATCGGTTGGTGCGTATGTITS反向引物：TGCTCAGCTCATGGGTCAGA探针：FAM-TGCCGAAATCCTG-BHQI1.3.3 ddPCR检测反应体系建立ddPCR反应体系：2ddPCR探针混匀体系10L、1.2L正向和反向引物及0.4L探针（浓度均为10mol/L），加入4.4L样品DNA，使用ddH2O将体系补至20L。将反应体系充分混匀转移到微滴发生板中，并加入70L微滴专用激发油后放到微滴发生器中进行激发。将生成的微滴通过PCR反应，初始条件：95、10 min，94、1 min，58、45 s，共计40 次循环；98、10 min。PCR反应结束后放入QX200 Droplet Reader采集荧光信号，最终通过微滴QuantaSoft分析软件计算得出结果。1.3.4 ddPCR检测方法的温度优化因退火温度对ddPCR反应影响较大，所以对温度条件进行筛选，在温度为5363 进行梯度实验，根据检测结果确定反应体系中最佳退火温度。1.3.5 ddPCR检测醋化醋杆菌的特异性为了验证醋化醋杆菌ddPCR法检测特异性，将表1与醋化醋杆菌进化关系相近、易造成检测结果影响的14 种菌经活化培养后，按照1.3.1节方法提取相应DNA，并通过优化后的反应体系进行检测。1.3.6 ddPCR检测醋化醋杆菌的检出限将市售发酵乳进行121、30 min高压灭菌，无菌操作进行醋化醋杆菌人工污染，分别将其按照不同浓度梯度添加到发酵乳中，使其含量维持在101107 CFU/g，并通过上述方法进行基因组DNA提取和ddPCR法检测，得出该方法的检出限。1.3.7 ddPCR绝对定量准确性依据ddPCR检测得到每微升发酵乳中醋化醋杆菌的实测拷贝数，从NCBI上查找出ITS基因在醋化醋杆菌全基因组中的理论拷贝数，计算出样品中醋化醋杆菌的菌落数，实现ddPCR检验的绝对定量。对ddPCR检测结果和通过计数方式得出的结果进行比较，可以验证方法可靠性。ddPCR法测定结果和偏差率分别按 式（1）（2）计算。ddPCR?/?CFU/g?/?copies/L?20?18.18?/copies（1）ddPCR?/?CFU/g?/?CFU/g?/?CFU/g?/%?100（2）式中：20为反应体系体积/L；18.18为提取DNA体积与体系中模板DNA体积比值。通过不同浓度梯度的醋化醋杆菌检测结果和菌落数之间的线性关系分析，可以进一步验证本方法绝对定量检验的准确性。1.4 数据处理ddPCR检测结果通过微滴Quantasoft分析软件计算得出，方法的定量分析使用Excel进行图表编辑。2 结果与分析2.1 醋化醋杆菌ddPCR法检测温度优化结果由图1可知，随着反应温度上升，阳性液滴和阴性液滴越难区分，当反应温度在60 以上时未发生特异性扩增，而在54.6 下时阳性液滴数目最多，且阳性和阴性液滴较为分明，所以54.6 为醋化醋杆菌ddPCR检验最合适的退火温度。012345020 000 40 000 60 000 80 000 100 000 120 000 140 000612345678910 11?103?1.53.0；2.53.2；3.53.7；4.54.6；5.55.8；6.57.1；7.58.4；8.59.8；9.61.1；10.62.2；11.63.0。图 1 醋化醋杆菌ddPCR法检测温度优化结果Fig.1 Results of optimization of annealing temperature2.2 醋化醋杆菌ddPCR法特异性检测结果由图2可知，醋化醋杆菌属的3 种菌株都可以检测出分析检测 Journal of Dairy Science and Technology 2023,Vol.46 No.2 16 阳性微滴信号，而阴性和其他菌株均未出现扩增，由此可以说明，本研究所建立的醋化醋杆菌检测ddPCR法特异性良好。012345050 000100 000150 00076891234 5 6 7 8 9 1011 12 1314 15 16 17?103?1.醋化醋杆菌（CICC21682）；2.醋化醋杆菌（CICC22519）；3.醋化醋杆菌（CICC21684）；4.葡萄糖杆菌；5.肠炎沙门氏菌；6.鼠伤寒沙门氏菌；7.克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）；8.福氏志贺氏菌；9.德氏乳杆菌；10.婴儿双歧杆菌；11.单核增生李斯特氏菌；12.副溶血弧菌；13.空肠弯曲杆菌；14.蜡样芽孢杆菌；15.汉氏葡糖醋杆菌；16.嗜热链球菌；17.植物乳杆菌。图 2 醋化醋杆菌ddPCR法特异性检测结果Fig.2 Specificity of ddPCR for detection of Acetobacter acetis2.3 醋化醋杆菌ddPCR法检出限由图3可知，通道1、2由于模板DNA浓度太高，无阴性液滴产生，数据无效，所以舍弃数据。通道7号反应的菌落数为7.2101 CFU/g，ddPCR检测结果拷贝数为0.49 copies/L。由上可知，ddPCR方法检测发酵乳中醋化醋杆菌的计数灵敏度为7.2101 CFU/g。该检出限可以满足日常检验需要，为方法推广提供了坚实的基础。0246810010 000 20 000 30 000 40 000 50 000 60 000 70 0001412161234567?103?17.7.2107、7.2106、7.2105、7.2104、7.2103、7.2102、7.2101 CFU/g。图 3 醋化醋杆菌ddPCR法检测灵敏度测定结果Fig.3 Sensitivity of detection of Acetobacter acetis by ddPCR2.4 醋化醋杆菌ddPCR法绝对定量结果当实测结果高于计数结果，偏差统计为正；当计数结果高于实测结果，偏差统计为负。由表3可知，醋化醋杆菌的测定偏差率为23.73%，低于日常研究中的偏差率25%2,26，确保了ddPCR定量检测醋化醋杆菌方法可以应用。表 3 醋化醋杆菌测定结果及偏差率Table 3 Measurement results and deviation rates of Acetobacter acetate菌种名称理论拷贝数/copies1L实测拷贝数/copies20L实测拷贝数/copiesddPCR法实测结果/（CFU/g）计数结果/（CFU/g）偏差率/%醋化醋杆菌20.499.889.0872.0023.73由图4可知，当醋化醋杆菌菌落数在7.2104 CFU/g以内，标准曲线R2大于0.99，说明ddPCR法检测拷贝数和菌落数呈一定比例关系，同时证明本方法绝对定量检测的准确性。005101520y?0.378 7x?0.300 0 R2?0.997 516875432?/?104 CFU/g?/?104 copies/L?图 4 醋化醋杆菌ddPCR法检测拷贝数和菌落数的线性关系Fig.4 Linear relationship between copy number of Acetobacter acetate determined by ddPCR and colony number3 讨 论随着社会快速发展，食品中微生物定性检验已经满足不了需求27-29，快速、精准的定量检验才能做到全过程细致把控，为生产企业和市场监管带来活力。ddPCR技术可以将反应体系激发形成约20 000 个微滴，经PCR扩增后，通过微滴分析仪对每个微滴进行分析，有荧光产生的微滴标记成1，没有荧光产生的微滴标记成0，根据阳性、阴性微滴的比例和泊松分布，可计算出反应体系中待测样品的含量。ddPCR技术不依靠标准曲线和对照样品，每个反应均为独立反应，受PCR扩增的影响较小，通过计算可以精准得出样品拷贝数，达到绝对定量分析，现已广泛用于微生物检验30-32。4 结 论本研究建立了一种ddPCR精准、定量检测发酵乳中醋化醋杆菌的技术。根据醋化醋杆菌的ITS基因设计特异性引物及探针，通过实验筛选最佳反应体系，最终确定退火温度为54.6。通过多种相近菌株实验验证，结果表明，本方法特异性强，除目标菌外，其他菌均未出现扩增。发酵乳经人工污染后，本方法测定灵敏度高，检出限为7.2101 CFU/mL。对通过ddPCR检测得出的实测结果和计数法得出的结果之间进行比较，偏差率为23.73%，低于25%，且菌落数在7.2104 CFU/g以内与拷贝数保持良好的线性关系（标准曲线R2均大于0.99），17 2023,Vol.46 No.2 乳业科学与技术 分析检测证明了ddPCR精准定量检测醋化醋杆菌的准确性和可靠性。本方法可以不依靠标准曲线，直接测出每微升发酵乳中醋化醋杆菌实测拷贝数，通过计算可以精准得出样品中醋化醋杆菌数量，达到绝对定量检测。由上可知，本研究建立的ddPCR技术用于发酵乳中醋化醋杆菌的定量检测可以实现生产、流通过程中对醋化醋杆菌污染菌数的精准控制，同时也能为ddPCR在食品安全检测领域的广泛应用提供理论依据和技术保障。参考文献：1 李欣霏,王彩云,王新妍,等.发酵乳加工工艺及检测技术研究进展J.乳业科学与技术,2021,44(5):43-50.DOI:10.15922/ki.jdst.2021.05.009.2 周巍,李月华,孙勇,等.微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中金黄色葡萄球菌J.食品科学,2017,38(16):287-291.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716046.3 余中节,赵洁,孙志宏.多组学技术在自然发酵乳中的应用J.生物产业技术,2019(4):63-68.4 王云霞,侯霞霞,赵淑环,等.乳粉中发酵乳杆菌CECT5716微生物检测方法的建立J.乳业科学与技术,2020,43(3):23-26.DOI:10.15922/ki.jdst.2020.03.005.5 NWAGU T N,AMADI E C.Bacteria population of some commercially prepared yoghurt sold in Enugu State,Eastern NigeriaJ.African Journal of Microbiology Research,2011,4(10):984-988.6FALENSKIA,MAYER-SCHOLLA,FILTERM,etal.Survivalof Brucella spp.in mineral water,milk and yogurtJ.International Journal of Food Microbiology,2011,145(1):326-330.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.11.033.7POIMENIDOUS,BELESSICA,GIAOURISED,etal.Listeria monocytogenes attachment to and 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