细胞色素P450酶代谢N-亚硝胺类化合物的反应机理研究.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.18,No.3 Jun.2023 基金项目:国家自然科学基金资助项目(22176211,21677125)第一作者:宋润芊(1997),女,硕士研究生,研究方向为环境计算化学和毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230212001宋润芊,金玲敏,苏丽静,等.细胞色素 P450 酶代谢N-亚硝胺类化合物的反应机理研究J.生态毒理学报,2023,18(3):68-78Song R Q,Jin L M,Su L J,et al.Mechanisms ofN-nitrosamines metabolized by cytochrome P450 enzymes J.Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(3):68-78(in Chinese)细胞色素 P450 酶代谢 N-亚硝胺类化合物的反应机理研究宋润芊1,金玲敏2,苏丽静2,季力2,*1.浙江大学环境与资源学院,杭州 3100582.中国矿业大学环境与测绘学院,徐州 221000收稿日期:2023-02-12 录用日期:2023-04-10摘要:细胞色素 P450 酶在生物体内分布广泛,在有机污染物的代谢中发挥重要作用。N-亚硝胺类化合物(N-nitrosamines,?NAs)在 P450 酶的初始催化作用下,所生成的亲电化合物易于与 DNA 加合,从而可能产生致畸变和致癌毒性。本研究对 21种 NAs 的-C 上的 CH 键解离能(bond dissociation energy,BDEC-H)和 P450 酶介导的-羟基化反应的氢提取活化能(E*)进行密度泛函理论计算模拟,探讨链状和环状 NAs 的 BDEC-H和 E*的规律。计算结果表明,链状 NAs 的 BDEC-H为 83.8 91.6kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ),E*为8.3 15.9 kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ);环状 NAs 的 BDEC-H为74.4 88.6 kcal mol-1(1kcal=4.1859 kJ),E*为 8.7 15.1 kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ)。建立的 NAs 反应性模型经多元线性回归(MLR)拟合后表?明模型的稳健性良好,链状 NAs 模型的可决系数(R2)=0.9,平均绝对误差(MAE)=0.8 kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ),环状?NAs 模型的R2=0.9,MAE=1.0 kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ)。同时,以甲基乙烯基亚硝胺为例,理论预测 P450 酶代谢的环氧化反应和羟基化反应的区域选择性,从动力学和热力学角度表明 2 种反应均可发生。本研究开发了一种计算成本小的P450 酶代谢 NAs 作用机制的方法,从而为 NAs 环境健康风险评估提供理论基础。关键词:N-亚硝胺类化合物;细胞色素 P450 酶;代谢毒性;密度泛函理论;预测模型;区域选择性文章编号:1673-5897(2023)3-068-11 中图分类号:X171.5 文献标识码:AMechanisms of N-nitrosamines Metabolized by Cytochrome P450 EnzymesSong Runqian1,Jin Lingmin2,Su Lijing2,Ji Li2,*1.College of Environmental and Resource Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China2.School of Environment and Spatial Informatics,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221000,ChinaReceived 12 February 2023 accepted 10 April 2023Abstract:Cytochrome P450 enzymes(CYP450)distribute widely in organisms,which play an important role inthe metabolism of organic pollutants.N-nitrosamines(NAs),can produce electrophilic compounds initially cata-?lyzed by CYP450,that are susceptible to attack DNA base,which may produce teratogenic and carcinogeniceffects.In this study,density functional theory(DFT)computations were performed to calculate the CH bonddissociation energy(bond dissociation energy,BDEC-H)on-C and the activation energy of hydrogen extraction(E*)for CYP450-mediated-hydroxylation reactions of 21 diverse NAs.The reasonable patterns of BDEC-HandE*of chain and cyclic NAs were explored.The results showed that the BDEC-Hof chain NAs were within 83.8 第 3 期宋润芊等:细胞色素 P450 酶代谢N-亚硝胺类化合物的反应机理研究69 91.6 kcal mol-1and E*values were within 8.3 15.9 kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ);while the BDEC-Hof cy-?clic NAs were within 74.4 88.6 kcal mol-1and E*values were within 8.7 15.1 kcal mol-1(1 kcal=4.1859?kJ).The built reactivity results of NAs showed that the models had the good-of-fit by multiple linear regression(MLR),withR2=0.9 and mean absolute error(MAE)=0.8 kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ)for the chain NAs?model andR2=0.9 and MAE=1.0 kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ)for the ring NAs model.In the meanwhile,the theoretical predictions of the regioselectivity of the epoxidation and hydroxylation reactions of CYP450 metabo-lism,usingN-nitroso-N-methylvinylamine as a model substrate,showed that both reactions can occur from kineticand thermodynamic analysis.Therefore,this study developed a method to study the mechanism of NAs by CYP450with a small computational cost,providing a theoretical basis for their environmental health risk assessment of NAs.Keywords:N-nitrosamines;cytochrome P450 enzymes;metabolic toxicity;density functional theory;predictive?model;regioselectivity N-亚硝胺类化合物(N-nitrosamines,NAs)是指?结构通式为 R1(R2)NNO 的化合物,其中 R1、R2是不同的取代基团。NAs 存在于食品、烟草、饮用水、药物和化妆品中1-2,同时在地下水、土壤等环境介质中也有检出3-4。自 1956 年N-二甲基亚硝?胺(NDMA)被证明容易诱导大鼠肝脏恶性肿瘤的发生以来5,迄今发现了 200 多种 NAs 具有致癌活性6,并且 NAs 会在包括高等灵长动物在内的 40 多种动物中诱发癌症7。人体受 NAs 影响会导致食道癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌等癌症的发生7-8。细胞色素 P450 酶(P450 酶)在环境污染物的生物转化过程中起着重要的作用,大约 2/3 人类酶活化致癌物的反应都与 P450 酶有关9-10。NAs 进入生物体后,可被 P450 酶代谢生成比母体化合物毒性更强的代谢产物11。其中,经过 P450 酶代谢后形成的羟基化产物会自发分解,形成烷基重氮离子,与 DNA 发生加合反应,从而激活 NAs 的致癌的潜力12-13。因此,明确 P450 酶代谢 NAs 的反应机理对于 NAs 致癌性的研究有着极其重要的作用。P450 酶代谢的-羟基化反应是 NAs 代谢活化的关键步骤14。测定动力学同位素效应的实验结果表明,由 P450 酶活性中心进行的氢提取过程是-羟基化反应的速率决定步骤15。铁()-氧血红素阳离子自由基化合物(compound,Cpd)是被普遍认可的代谢活性物种,由 P450 酶在其催化循环过程中形成16。Cpd 的FeO部分可以对 NDMA甲基上的氢原子进行提取,羟基反弹到-亚硝胺自由基,从而完成羟基化过程17。由于 Cpd 反应活性高、存在寿命短,通常很难在实验中对其进行捕捉和表征,理论计算可以作为研究 P450 酶代谢机理的有效手段18。已有研究者对 P450 酶代谢活化少量典型的 NAs(例如:N-甲基-N-亚硝基甲胺、4-甲基亚硝氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮)的反应进行了密度泛函理论(DFT)计算,分析了 P450 酶代谢这些 NAs 的反应路径,包括羟基化反应、脱亚硝基反应、N-氧化?反应17-20。Li 和 Hecht21总结了人类频繁接触的 10种 NAs,分为环状和非环状 2 种类型讨论了其致癌活化的反应过程。然而,已有的研究是仅针对某种具体化合物的反应,很难判别种类众多的 NAs 的反应活性和致癌潜力。因此,本研究借助理论计算方法,基于活化反应机理,探究不同 NAs 的代谢规律。反应物的键能是预测其反应性的重要指标22。特别地,氢原子提取的反应活化能与 CH 键的解离能(BDEC-H)呈显著相关23-24。理论计算存在着耗时、对硬件设备要求高等问题,体系复杂的反应计算难度也会较大23。但是,BDEC-H的计算相对来说体系简 单,计 算 方 便 快 捷。因 此,本 研 究 将 通 过BDEC-H来预测 NAs 氢提取反应的活化能,有助于快速地判断脱烷基的反应活性。本研究通过 DFT 计算,得到 BDEC-H,并且计算了链状和环状 NAs 的反应活化能。通过数学模型构建 NAs 的-羟基化反应活化能与 BDEC-H的相关关系,揭示 NAs 代谢规律,以此对不同种类的 NAs的反应性和致癌潜力进行快速有效的评估;同时,对含有 CC 键的 NAs 羟基化和环氧化的区域选择性进行分析,以加深对 P450 酶催化不同类型 NAs反应的理解。1 计算方法(Computational methods)1.1 DFT 计算本研究选取六配体三自由基复合物Fe4+O2-(C20N4H12)-1(SH)-1(Cpd)作为活性位点模型,70 生态毒理学报第 18 卷NAs(结构式见表 1)作为 P450 酶催化反应的底物,对 Cpd 在高自旋(HS)四重态或低自旋(LS)二重态下进行考察25。几何结构采用非限制性的 DFT 优化,B3LYP 杂化密度泛函结合 LANL2DZ 基组用于Fe,而 6-31G*基组用于 C、H、N、O 原子(记作UB3LYP/BS,简称 BS)。采用 B3LYP 的原因是它可以准确地重现 P450 酶催化反应的动力学同位素效应的测量值26和 P450 酶亚铁血红素的电子顺磁共振参数值27,形成与结晶结构一致的几何形状28,并且得到相对于基准 CASSCF 计算更加精准的能量值29。反应分子的振动频率进一步用于零点能(ZPE)校正,并且在 298.15 K 和 101.325 kPa 的条件下进行吉布斯自由能校正。通过振动模式分析,所有的基态的频率都为实频,过渡态只有一个虚频,振动方向沿着反应坐标方向。采用 PCM 连续化溶剂模型(介电常数=5.7,氯苯)模拟酶环境,评估周围蛋白质的极化效应30。通过 UB3LYP-D3/BS基组进行单点能计算得到 D3 色散校正项,以此弥补 B3LYP方法所缺乏的对色散相互作用的考虑31。采用计算铁原子的 SDD 基组,计算其他原子的 6-311+G*基组(记作 UB3LYP/BS/BS,简称 BS),在更高水平下进行单点(SP)计算以获得更加精确的能量32。本研究中反应的相对自由能是在 BS水平下进行结构优化,与 ZPE 校正、B3LYP/BS单点能校正、PCM 溶剂化校正和色散 D3 校正结合来估计的。BDEC-H与羟基化的活化能紧密相关24,选取BDEC-H作为评估反应底物的 NAs 的反应性的重要参数。BDEC-H是指氢原子和解离掉氢原子的自由基的能量之和减去底物原始的能量,表示底物解离一个氢原子的难易程度33。在 BS水平上进行焓能校正,获得 NAs 的 BDEC-H能量。所有计算均由Gaussian16 软件包完成34。表 1 亚硝胺类化合物结构、CH 键解离能(BDEC-H)和四重态 Cpd 介导的氢提取反应活化能(E*)以及分子描述符Table 1 Structures,bond dissociation energies(BDEC-H)and activation energies(E*)of hydrogen-abstraction by Cpd in HS state and molecular descriptors of NAs序号No.亚硝胺类化合物N-nitrosamines反应位点ReactionsitesE*计算值Calculatedvalues预测值PredictedvaluesBDEC-HM/(a.u.)qC-/(a.c.u.)分子结构Structure1N-甲基-N-亚硝基甲胺(NDMA)N-nitrosodimethylamine(NDMA)-13.314.688.040.9-0.22亚硝基甲基乙基胺(NMEA)N-nitrosomethylethylamine(NMEA)1212.6NC11.1NC85.289.450.7-0.33N-亚硝基肌氨酸(NSAR)N-nitrososarcosine(NSAR)1215.9NC15.2NC89.991.654.8-0.24二乙基亚硝胺(NDEA)N-nitrosodiethylamine(NDEA)-12.711.987.661.4-0.35N-亚硝基二丙胺(NDPA)N-nitrosodi-N-propylamine(NDPA)-11.310.987.683.5-0.36N-亚硝基二乙醇胺(NDELA)N-nitrosodiethanolamine(NDELA)-15.114.387.368.3-0.17二丁基亚硝胺(NDBA)N-nitrosodibutylamine(NDBA)-8.37.884.2105.8-0.38二异丙基亚硝胺(NDIPA)N-nitrosodiisopropylamine(NDIPA)-9.710.887.282.0-0.3第 3 期宋润芊等:细胞色素 P450 酶代谢N-亚硝胺类化合物的反应机理研究71 续表1序号No.亚硝胺类化合物N-nitrosamines反应位点ReactionsitesE*计算值Calculatedvalues预测值PredictedvaluesBDEC-HM/(a.u.)qC-/(a.c.u.)分子结构Structure9乙基异丙基亚硝胺(NEIPA)N-nitrosoethylisopropylamine(NEIPA)129.4NC9.3NC83.885.471.8-0.310N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(NMBA)N-nitroso-N-methyl-4-aminobutanoic acid(NMBA)1210.0NC11.2NC86.587.776.7-0.3113-(N-亚硝基甲基氨基)丙腈(NMPN)3-(N-nitrosomethyl-amino)propionitrile(NMPN)1211.0NC11.6NC85.687.163.2-0.2123-(N-亚硝基甲基氨基)丙醛(NMPD)3-(N-nitrosomethyl-amino)propionaldehyde(NMPD)1210.0NC10.5NC84.386.962.2-0.313N-亚硝基吡咯烷(NPYR)N-nitrosopyrrolidine(NPYR)-13.310.985.058.0-0.214N-亚硝基甲基苯胺(NMPA)N-nitrosomethylphenyl-amine(NMPA)-14.614.188.690.4-0.2154-甲基亚硝氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)1-butanone(NNK)1215.1NC15.4NC86.787.7129.6-0.316N-亚硝基哌啶(NPIP)N-nitrosopiperidine(NPIP)-9.911.785.469.6-0.217N-亚硝基吗啉(NMOR)N-nitrosomorpholine(NMOR)-10.311.886.562.5-0.118N-亚硝基烟碱(NNN)N-nitrosonornicotine(NNN)1211.2NC10.9NC78.685.3109.3-0.219N-亚硝基新烟碱(NABS)N-nitrosoanabasine(NABS)1213.9NC13.0NC82.287.4121.0-0.220N-亚硝基阿那他滨(NATB)N-nitrosoanatabine(NATB)12NC8.7NC9.582.074.4118.6-0.221N-亚硝基去甲槟榔碱(NG)N-nitrosoguvacoline(NG)12NC8.8NC8.584.474.896.7-0.2223-(甲基亚硝胺基)丙腈(MNPN)3-(methylnitrosamino)propionitrile(MNPN)1214.2NC11.6NC85.587.062.6-0.2231-甲基-1-亚硝基脲(MNU)1-methyl-1-nitrosourea(MNU)-16.116.291.148.0-0.272 生态毒理学报第 18 卷续表1序号No.亚硝胺类化合物N-nitrosamines反应位点ReactionsitesE*计算值Calculatedvalues预测值PredictedvaluesBDEC-HM/(a.u.)qC-/(a.c.u.)分子结构Structure24N-亚硝基-N-甲基-N-丙胺(NMNPA)N-methyl-N-propylnitrous amide(NMNPA)1213.0NC11.1NC86.291.262.1-0.325N-亚硝基二异丁胺(NNB)N-nitrosodiisobutylamine(NNB)-12.99.987.5104.1-0.3261-亚硝基-2,2-二甲基氮丙啶(NDZ)1-nitroso-2,2-dimethylaziridine(NDZ)-17.319.2104.259.2-0.3272-甲基-1-亚硝基氮杂吖啶(NMZ)2-methyl-1-nitrosoaziridine(NMZ)1215.1NC16.2NC98.7101.648.0-0.3281-亚硝基氮杂环吖啶(NSZ)1-nitrosoaziridine(NSZ)-17.518.3104.937.3-0.1294-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NHPNM)N-(4-hydroxy-4-phenylbutyl)-N-methylnitrous amide(NHPNM)1213.4NC15.2NC86.187.6130.7-0.2注:BDEC-H为解离键能,kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ);M 为平均分子极化率;qC-为分子中碳原子的最负静电荷;E*为氢提取活化能垒,?kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ);-表示该化合物无反应位点区分;NC 表示未计算该反应位点的 E*。Note:BDEC-His bond dissociation energies of the CH bond,kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ);M is the average molecular polarizability;qC-is themost negative electrostatic charge of the carbon atom in the molecule;E*is the activation energies of hydrogen-abstraction,kcalmol-1(1 kcal=?4.1859 kJ);-indicates that the reaction sites of the compound are not different;NC indicates that E*was not calculated.1.2 模型构建为了考察 BDEC-H与羟基化的活化能紧密相关性,使用模型预测相应的活化能。借助羟基化的活化能作为终点值,BDEC-H以及 NAs 的电荷等量子化学描述符作为变量,使用 Weka 3.0 进行多元线性回归(MLR)模拟35获得模型的拟合可决系数(R2)和?平均绝对误差(MAE),并且对 8 种相似结构的NAs36-40(化合物 22 化合物 25 为链状:MNPN、MNU、NMNPA、NNB;化合物 26 化合物 29 为环状:NDZ、NMZ、NSZ、NHPNM)进行外部验证。对模型进行内部去一法交叉验证以考察模型的稳健性,得到交叉验证的预测相关系数(Q2CV)和均方根误差?(RMSECV)。其中,拟合优度评价系数(R2和 MAE)?的计算公式如下,其余公式参考文献41:R2=1-ni=1(yi-yi)2ni=1(yi-y)2(1)MAE=1nni=1y”i-yi2()式中:yi为模型回归拟合值;yi为实验值;y为实验?值的平均值;y”i为预测值;n为数据个数。2 结果(Results)2.1 DFT 计算结果根据有无环状结构,将 21 种 NAs 分为链状(化合物 1 化合物 12)和环状(化合物 13 化合物 21)2种类别。NMEA(化合物 2)、NSAR(化合物 3)、NDEA(化合物 4)、NEIPA(化合物 9)、NMBA(化合物 10)、NMPN(化合物 11)、NMPD(化合物 12)、NMPA(化合物14)、NNK(化合物15)、NNN(化合物18)、NABS(化合物 19)、NATB(化合物 20)、NG(化合物 21)的两侧取代基不同,有 2 个-C,存在 2 个?不同的反应位点。DFT 计算 21 种 NAs 的所有-C?的 BDEC-H,BDEC-H在 74.4 91.6 kcal mol-1(表 1)范围内,链状 NAs 的 BDEC-H为 83.8 91.6 kcalmol-1,环状 NAs 的 BDEC-H为 74.4 88.6 kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ)。其中,BDEC-H最大的是 NSAR(化合物 3),其反应位点 2(91.6 kcalmol-1,1 kcal=第 3 期宋润芊等:细胞色素 P450 酶代谢N-亚硝胺类化合物的反应机理研究73 4.1859 kJ),NSAR 为链状化合物,存在与碳相连的羧基;最小的是 NATB(化合物 20),其反应位点 2(74.4 kcal mol-1,1 kcal=4.1859 kJ),NATB 为环状化合物,存在环内双键。根据 BDEC-H选取 CH 键断裂的-C 所在的反应位置,BDEC-H越小代表 CH 键的断裂所需要的能量越低,断键越容易42。进一步对 BDEC-H较小的反应位点上 Cpd 在四重态下氢提取步骤的活化能进行计算。在进行零点能校正、B3LYP/BS单点能校正、PCM 溶剂化(=5.7,氯苯)校正和色散 D3 校正后,得到 Cpd 在四重态下进行氢提取步骤的活化能结果(表 1)。链状化合物活化能E*?的范围为 8.3 15.9 kcal mol-1,环状化合物活化能E*的范围为 8.7 15.1 kcal mol-1(1 kcal=4.1859?kJ)。其中,E*最大的是链状化合物 NSAR(化合物?3),其活化能为 15.9 kcalmol-1;最小的是链状化合物 NDBA(化合物 7),活化能为 8.3 kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ),其取代基为 2 个正丁基。2.2 MLR 模型的建立为了有效预测环境中不同类型 NAs 的-羟基化反应性,本研究建立了 21 种 NAs 在 Cpd 氢提取过程的活化能与 BDEC-H相关的模型并验证模型的稳健性。21 种 NAs 的氢提取活化能垒 E*作为终点,借?助 Weka 软件筛选了化合物的 BDEC-H、2 种电荷描述符(分子中碳原子最正静电荷qC+和碳原子最负静电?荷qC-)和部分量子化学描述符(例如:分子平均极化?率 M)。多元线性回归构建的模型2.1 如下:E*=0.3BDEC-H+9.7qC-11.4(3)模型 2.1 的R2为 0.6,MAE 为 1.5 kcalmol-1?(1 kcal=4.1859 kJ)。由于R2较小,根据 21 种 NAs?的结构,将其分为12 种链状化合物以及9 种环状化合物,分别进行模型构建,得到12 种链状 NAs 如下结果:E*=0.6BDEC-H-4.910-2M+11.0qC-32.2(4)9 种环状 NAs 如下结果:E*=0.4BDEC-H+5.310-2 M-28.6(5)模型 2.2 的R2为 0.9,MAE 为 0.8 kcal mol-1,4?种链状 NAs 的外部验证结果R2为 0.9,MAE 为 2.6?kcal mol-1;模型 2.3 的R2为 0.9,MAE 为 1.0 kcal?mol-1,4 种环状 NAs 的外部验证结果R2为 0.9,?MAE 为 1.7 kcalmol-1(1 kcal=4.1859 kJ)。模型 2.2 和 2.3 的 E*的实验值与预测值拟合图如图?1(a)和图 1(b),可知模型具有较好的拟合能力和预测能力。对模型 2.2 和 2.3 进行去一法交叉验证,得到的交叉验证系数,Q2CV为 0.8,RMSECV为 1.5?和Q2CV为 0.6,RMSECV为 2.2,表明模型具有较好?的稳健性。采用这一模型可以快速有效地评估NAs 在 Cpd 氢提取过程中的活化能,进而对NAs 的反应活性进行评估,外部验证结果也证明了这一点。模型筛选出的描述符表明,无论链状还是环状NAs,其 BDEC-H均与活化能呈正相关关系,表明解离能越大的化合物,P450 酶进行催化氧化时所需要的能量越大。分子中的负电荷数和平均分子极化率也可能对活化能产生影响。具有较小qC-值的化合?物分子中碳原子上集中了较多的负原子电荷,且qC-值均在亚硝基相邻的碳上。因此,推测亚硝基相图 1 活化能的计算值和预测值模型(1 kcal=4.1859 kJ):(a)为模型 2.2,(b)为模型 2.3Fig.1 The activation energy calculated and predicted values of models(1 kcal=4.1859 kJ):(a)for model 2.2 and(b)for model 2.374 生态毒理学报第 18 卷邻的碳上具有较多的负电荷,可能对活化能垒产生影响。本文中选择的亚硝胺类化合物是极性化合物,具有极性基团 NNO,其结构的参与会影响R1和 R2的电子排布。分子极化是电荷再分配过程,其相关分子性质是分子平均极化率43。M 表征平均分子色散力,表征电子云的可变形性,模型表明了电子的分布与活化能相关44-45。本研究建立的模型预测 CH 键活化能 E*,表明其与 BDEC-H具?有较强的相关关系,以此对不同种类的 NAs 的反应活性进行快速有效地评估,为 NAs 的环境健康和生态风险评估提供理论依据。2.3 羟基化和环氧化反应的区域选择性当 P450 酶催化反应的底物为 NAs,并且取代基又含有 CC 键时,就存在-C 的羟基化和 CC键环氧化反应的竞争关系46。羟基化和环氧化是 2种典型的 P450 酶代谢反应,可能经常存在区域选择性的现象。甲基乙烯基亚硝胺(N-nitroso-N-methyl-?vinylamine)是一种典型的 NAs,经过大鼠肝微粒体的代谢之后,2 种反应途径生成的产物均被检出47。因此,以甲基乙烯基亚硝胺为例,考察了 P450 酶的活性中心 Cpd 在高自旋四重态和低自旋二重态下介导的-羟基化以及 CC 键环氧化反应的具体路径,揭示了某些含有 CC 键的 NAs 在 P450酶催化作用下的反应机理。羟基化反应的相对能量分布如图 2 所示,4,2RC是反应的起点,高自旋四重态和低自旋二重态之间能量简并。反应的第一步是 Cpd 提取-C 上的氢原子,经过一个过渡态(4TSH=15.8 kcal mol-1,2TSH=14.0 kcalmol-1,1 kcal=4.1859 kJ)使 CH 键断裂,这一步也是反应的速率决定步骤。此时,氢原子在碳原子和 Cpd 中的氧原子之间振动,通过接近线性的 O H C 和高虚频(四重态 im=i1792.52?cm-1,二重态 im=i1725.42 cm-1),形成 FeOH 和?烷基自由基构成的中间体4,2IM(4IM=0.5 kcalmol-1,2IM=0.3 kcalmol-1,1 kcal=4.1859 kJ)。随后,FeOH 上的羟基自由基经过无能垒的反弹(四重态4TSreb=-1.5 kcalmol-1,1 kcal=4.1859 kJ,im=i129.74 cm-1;二重态无能垒)到烷基自由基上,?从而形成强放热的产物(4P=-52.7 kcalmol-1,2P=-52.2 kcal mol-1,1 kcal=4.1859 kJ)。图 3 为 Cpd 在简并双态下介导的甲基乙烯基亚硝胺的 CC 键环氧化的相对能量分布图。4,2RC 经过一个较低的过渡态(4TSH=7.8 kcalmol-1,2TSH=6.4 kcal mol-1,1 kcal=4.1859 kJ),Cpd中 FeO 的氧原子向 CC 双键上的 C 原子靠近,形成 CO 键从而生成中间产物 IM。仅获得四重态时自由基中间体4IM(4IM=-16.9 kcal mol-1,1 kcal=4.1859 kJ),并且在环氧化的环闭合过程中,四重态下的环闭合过渡态4TSrc 能量为-18.6 kcalmol-1,1 kcal=4.1859 kJ,im=i221.05 cm-1。二重态?为无能垒反应,二重态的自由基中间体的寿命很短,从而快速、自发地形成了最终的环氧化产物25。环氧化产物能量4P=-44.1 kcalmol-1,2P=-43.6kcal mol-1,1 kcal=4.1859 kJ。四重态下环闭合的过渡态能垒远低于 CO 键形成时的过渡态(Erc=?-1.7 kcalmol-1,EH=7.7 kcalmol-1,1 kcal=?4.1859 kJ),因此 CO 键形成时的过渡态是反应的速率决定步骤。针对 CO 键的形成,在底物中有2 个不同的反应位点,经过初步计算,Cpd 上的氧原子与CH2上的碳原子反应所需要的能量要低于CH 上的碳原子(平均值:-CH2=7.1 kcalmol-1vs.-CH=8.9 kcalmol-1,1 kcal=4.1859?kJ),因此考察反应更容易进行的CH2上的碳原子,这也与实验所得结果一致47。3 讨论(Discussions)BDEC-H的计算结果表明,环状 NAs 的 CH 的解离能要略低于链状 NAs。对于非对称的链状化合物,较长的支链上的 BDEC-H要更小,化合物NMEA(化合物 2)、NSAR(化合物 3)、NEIPA(化合物 9)、NMBA(化合物 10)、NMPN(化合物 11)、NMPD(化合物12)完全符合这一规律。对于非对称的环状化合物,NNK(化合物 15)的亚甲基上的 CH 的解离能更小(BDE1=86.7 kcalmol-1;BDE2=87.7 kcal mol-1;1 kcal=4.1859 kJ),NG(化合物21)的反应位点 2 的解离能更小(BDE1=84.4 kcalmol-1;BDE2=74.8 kcalmol-1,1 kcal=4.1859 kJ)。对于有 2 个环的 NNN(化合物18)和 NABS(化合物19),2 个环的桥接处(反应位点 1)的解离能更小(NNN:BDE1=78.6 kcalmol-1;BDE2=85.3 kcalmol-1;NABS:BDE1=82.2 kcalmol-1;BDE2=87.4kcal mol-1;1 kcal=4.1859 kJ)。但 NATB(化合物20)的桥接处(反应位点 1)解离能却更大(BDE1=82.0kcal mol-1;BDE2=74.4 kcal mol-1;1 kcal=4.1859kJ),可能是由于 NATB 中 CC 键吸电子的诱导效应导致的。第 3 期宋润芊等:细胞色素 P450 酶代谢N-亚硝胺类化合物的反应机理研究75 图 2 甲基乙烯基亚硝胺经 P450 酶活性氧化单体 Cpd 羟基化的能量势能图、四重态 HS和二重态 LS 下关键位点的优化结构注:键长单位为 0.1 nm,顺序为 HS LS;键角单位为();活化能量单位为 kcal mol-1(1 kcal=4.1859 kJ)。Fig.2 Relative energy of hydroxylation ofN-nitroso-N-methylvinylamine by Cpd,and the optimized geometriesof the important reaction sites in the HS and LSNote:Geometric parameters(the unit of bond length is 0.1 nm)are given as HS LS;the unit of bond angle is()and the unit of activation